桑葉生物堿對小鼠酒精性肝損傷的保護作用

劉慶普，陳燕，謝彩俠，雷敬衛，馮衛生，鄭曉珂*

（1.河南中醫藥大學藥學院，河南鄭州 450046）（2.河南省中藥質量控制與評價工程技術研究中心，河南鄭州 450046）（3.河南省中藥開發工程技術研究中心，河南鄭州 450046)

酒精作為一種精神活性物質，長期以來被認為是諸多肝臟疾病的主要誘因之一，其中以酒精性肝損傷（alcoholic liver injury，ALI）最為顯著，ALI根據其演變階段可分為單純性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化、酒精性肝硬化，嚴重者可誘發廣泛肝細胞壞死，甚至肝功能衰竭[1]。ALI已成為威脅人類健康的世界性公共衛生問題。在我國，酒精已成為繼病毒性肝炎后導致肝損傷的第二大病因[2,3]。在歐洲等發達國家中，ALI是肝硬化最主要的病因[4]。因此，ALI在全球范圍內引起了學者們的重視，對它的研究也越來越深入。盡管現代醫學對ALI的研究已取得較大進步，但其具體的發病機制尚未完全清楚。脂質代謝異常、氧化應激、炎癥反應等是目前公認的ALI發病機制。目前臨床關于ALI的治療以戒酒為主，尚無有效藥物可以對其徹底根治。隨著近些年來對藥食兩用植物研究的深入，發現多種藥食兩用植物具備調節脂質代謝、氧化應激和炎癥反應的作用，因此，通過膳食補充營養功效因子預防和治療ALI也逐漸受到人們重視。

桑葉為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥葉，桑葉于2002年被衛生部列入《按照傳統既是食品又是中藥材物質目錄》，即“藥食同源”?，F代研究表明桑葉具有多種藥理作用，如：降血糖、降血脂、防癌、通便利尿和抗炎等[5-8]。桑葉中含有多種活性成分，如：生物堿、黃酮和多糖等。越來越多的研究表明桑葉中的生物堿類化合物是桑葉諸多藥理作用的關鍵成分[9-11]。其中，桑葉生物堿（Mulberry leaf alkaloids，MLA）對肝臟的保護作用也有諸多報道，楊忠敏等[12]研究表明MLA對D-半乳糖所致的肝損傷具有保護作用；王祖文等[13]研究發現MLA對高脂飲食誘導的小鼠肝損傷具有改善作用；Zheng等[14]研究表明MLA的主要成分1-脫氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin，DNJ）可以改善高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝；本課題在前期研究中也發現DNJ對二型糖尿病動物模型db/db小鼠的非酒精性脂肪肝也有保護作用[15]。以上研究都表明MLA的肝臟保護作用與其抑制炎癥和氧化應激有關，而炎癥和氧化應激也是ALI發生發展的重要機制，但關于MLA對ALI的保護作用尚未見報道?；诖?，本研究建立了ALI小鼠模型，探討MLA對ALI小鼠的保護作用，為桑葉防治ALI及相關功能食品的研究與開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

56%紅星二鍋頭酒：北京紅星股份有限公司。甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、谷丙轉氨酶（cereal third transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。BCA蛋白濃度測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒由蘇州卡爾文生物科技有限公司提供。蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H & E）染液：北京索萊寶科技有限公司。

MLA為實驗室研究自制，方法如下[16,17]：將桑葉分別加10倍量的水，煮沸提取三次，每次2 h，過濾，將濾液pH調至3～4，經過己經預處理過的D001型陽離子樹脂，以4%氨水洗脫，收集氨水洗脫液，回收后過201×4陰離子樹脂，再以蒸餾水續洗。合并流出液和水洗液。減壓濃縮、干燥，即得MLA，采用硅鎢酸沉淀法[18]測得樣品中總生物堿質量分數為80.81%。

實驗動物：SPF級雄性ICR小鼠50只，體重18～22 g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 主要儀器與設備

IKA R104高速組織勻漿機，艾卡(廣州)儀器設備有限公司；iMARK酶標儀，美國伯樂公司；高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；JB-P5包埋機，武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機，上海徠卡儀器有限公司；KD-P組織攤片機，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；Nikon Eclipse E100正置光學顯微鏡，日本尼康公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物試驗

小鼠適應性飼養1周后隨機分為5組（n=10）：正常對照組（Control）、模型組（Alcohol）、MLA低劑量組（MLA-L）、MLA中劑量組（MLA-M）和MLA高劑量組（MLA-H）。對照組：灌胃生理鹽水；模型組：灌胃56%紅星二鍋頭；MLA低劑量組（MLA-L）：灌胃56%紅星二鍋頭和MLA（40 mg/kg·day）；MLA中劑量組（MLA-M）：灌胃56%紅星二鍋頭和MLA（80 mg/kg·day）；MLA高劑量組（MLA-H）：灌胃56%紅星二鍋頭和MLA（160 mg/kg·day）。其中，56%紅星二鍋頭灌胃劑量均為0.2 mL/10 g，每日上午根據體重進行灌胃。實驗連續進行4周后，所有動物禁食12 h，以水合氯醛麻醉，摘眼球取血，在4 ℃條件下，3000 r/min離心15 min，取血清用于血清生化等指標的檢測，然后迅速解剖取出肝臟，以生理鹽水沖洗干凈后，濾紙吸凈后稱重，用于計算肝臟指數，取部分肝臟置于4%多聚甲醛溶液中，用于病理學檢測，剩余部分放置-80 ℃環境下保存，用于肝臟中的相關指標檢測。

1.3.2 肝臟指數的測定

動物解剖前，對小鼠進行稱重。

1.3.3 血清相關指標檢測

小鼠血清中TG、TC、ALT、AST的檢測均采用商業試劑盒進行檢測，具體實驗操作按照說明書進行。

1.3.4 肝臟相關指標檢測

精密稱取0.1 g肝組織置于1 mL離心管中，加入生理鹽水（1:9m/V）后勻漿，在4000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒對肝臟組織勻漿上清液蛋白濃度進行測定。使用商業試劑盒檢測肝臟中的SOD、GSH-Px、CAT、MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6，具體實驗操作按照說明書進行。

1.3.5 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色

肝臟組織在4%多聚甲醛固定后，進行脫水、石蠟包埋，切厚度為5 μm的標本，切片漂浮于攤片機40 ℃溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進60 ℃烘箱內烤片，待水烤干蠟烤化后取出依次進行如下處理：石蠟切片脫蠟至水、蘇木精染色、伊紅染色、脫水封片。染色結束后方可進行顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.4 數據分析

使用 GraphPad Prism 5.0軟件（GraphPad software?, San Diego, CA, USA）進行統計分析。結果以均數±標準差表示。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）評估統計學意義，然后進行Dunnett’s posthoc檢驗。p＜0.05為顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 MLA對ALI小鼠肝臟指數的影響

肝臟腫大是ALI臨床上常見的癥狀[19]，肝臟指數可反映肝臟是否出現腫大及腫大程度，表1結果顯示，Alcohol組小鼠肝臟指數與Control組相比升高21.90%（p＜0.001），提示ALI小鼠肝臟出現腫大。有研究表明，MLA可以降低高脂飲食誘導的小鼠肝指數增加[13]，在本實驗中，與Alcohol組相比，MLA-L組小鼠的肝臟指數雖無顯著性變化，但MLA-M組和MLA-H組小鼠肝臟指數分別下降11.18%、15.17%（MLA-M：p＜0.001，MLA-H：p＜0.001），并且MLA-M和MLA-H組小鼠的肝臟指數雖然仍高于Control組，但無統計學差異。這些結果表明MLA可以改善小鼠酒精暴露導致的肝臟腫大。

表1 MLA對ALI小鼠肝臟指數的影響 Table 1 Effects of MLA on liver index in ALI mice

2.2 MLA對ALI小鼠血脂影響

脂質代謝紊亂也是酒精性肝損傷的常見癥狀，過量攝入酒精可誘導肝臟脂肪變性，酒精還可影響血脂轉運，造成血清TG和TC水平異常[20]。如圖1所示，Alcohol組小鼠的TG和TC水平與Control組相比分別升高54.41%、43.79%（p＜0.001），說明ALI小鼠出現血脂升高，脂代謝紊亂，這與Tao等[21]的研究結果一致。有研究報道桑葉水提物可以改善肥胖癥大鼠的脂代謝[22]，在本實驗中，經過MLA干預后，MLA中、高劑量均可使ALI小鼠的血清TG降低22.78%、32.65%（MLA-M：p＜0.05，MLA-H：p＜0.001），使血清TC水平降低19.19%、23.16%（MLA-M：p＜0.05，MLA-H：p＜0.05）；且MLA中、高劑量組小鼠血清TG和TC水平與Control組相比已無統計學差異；低劑量組（MLA-L）小鼠的血清TG和TC水平與Alcohol組相比雖無顯著性差異，但也分別降低15.06%、10.60%。這些結果表明MLA可以改善ALI小鼠的脂質代謝紊亂。

2.3 MLA對ALI小鼠肝功能的影響

ALT和AST被認為是反映肝細胞損傷和肝功能的重要指標，當機體肝細胞出現損傷或壞死時，兩種轉氨酶從肝臟釋放進入血液，造成血液中ALT和AST濃度升高[23]。圖2結果顯示，與Control組小鼠相比，ALI小鼠血清中的ALT和AST分別升高52.00%、29.00%（p＜0.001），表明ALI小鼠肝細胞和肝功能受損，這與Yang等[24]的研究結果一致；MLA低、中、高劑量組可使ALI小鼠血清ALT水平分別下降19.44%、28.08%、30.58%（MLA-L：p＜0.05，MLA-M：p＜0.001，MLA-H：p＜0.001），且與Control組相比已無統計學上的差異；盡管MLA低劑量組（MLA-L）小鼠血清AST水平與Alcohol組相比無顯著性差異，但MLA中、高劑量組可分別使ALI小鼠血清AST降低16.16%、16.41%（MLA-M：p＜0.05，MLA-H：p＜0.05）。這些結果表明MLA能夠保護ALI小鼠的肝細胞，改善其肝功能。

2.4 MLA對ALI小鼠肝臟組織結構的影響

HE染色結果顯示（圖3）：Control組小鼠肝細胞結構形態正常，細胞核呈圓形且排列規則整齊，整體細胞染色均勻，間隔清晰，未見炎細胞浸潤、變性和壞死細胞。Alcohol組小鼠肝細胞損傷較明顯，組織結構紊亂，排列不規則，細胞間隙模糊，肝細胞腫脹，可見小泡性脂變，并可見炎癥細胞浸潤；與Alcohol組比，MLA的低、中、高三個劑量均能不同程度改善ALI小鼠肝組織損傷，且有一定的劑量依賴效應，中、高劑量組小鼠肝細胞形態結構未見明顯損傷，細胞核呈圓形且排列規則整齊，整體細胞染色均勻，間隙清晰，少見炎癥細胞浸潤。這些結果說明MLA可以保護ALI小鼠肝臟組織結構。

2.5 MLA對ALI小鼠肝臟氧化應激的影響

肝臟是機體代謝酒精的主要器官，酒精代謝過程中會產生活性氧，當機體攝入過量酒精時，將產生大量的超氧陰離子等活性氧成分，造成機體抗氧化系統失衡，導致氧化應激，這是ALI發生與進展的重要機制之一[25]。在研究中，可以通過測定SOD、CAT、GSH-Px等指標評價機體的抗氧化能力[26,27]。同時，酒精在代謝過程中能誘發脂質過氧化，導致細胞損傷并產生脂質氧化終產物[28]。MDA是脂質過氧化的最終產物之一，具有細胞毒性，也是氧化應激的標志。因此，在研究中可以通過測定MDA反映機體脂質過氧化水平，間接反映出機體因過氧化造成的損傷情況[29]?；诖?，研究檢測了肝臟中SOD、CAT、GSH-Px和MDA的含量，以評價MLA對ALI小鼠肝臟氧化應激的影響。

本實驗結果顯示（圖4）：Alcohol組小鼠肝臟中SOD、CAT、GSH-Px的活力明顯低于Control組（p＜0.001），分別下降31.71%、36.32%、24.50%，同時，Alcohol組小鼠的肝臟中MDA水平與Control組相比升高51.1%（p＜0.001），表明ALI小鼠肝臟的抗氧化能力顯著下降，并且已經出現脂質氧化損傷，這與欒倩等[30]的研究結果一致。有研究報道MLA能改善D-半乳糖誘導的小鼠機體氧化應激，減輕脂質氧化損傷[31]。本實驗結果顯示：經過MLA的干預后，低、中、高劑量組小鼠肝臟中SOD活力分別升高21.82%、27.47%、38.38%（MLA-L：p＜0.05，MLA-M：p＜0.01，MLA-H：p＜0.001），且中、高劑量組與Control組相比已無統計學差異；中、高劑量組小鼠肝臟中CAT活力升高15.36%、19.09%（MLA-M：p＜0.05，MLA-H：p＜0.001），且高劑量組與Control組相比已無統計學差異，低劑量組（MLA-L）與Alcohol組相比雖無顯著性差異，但也上升13.02%；中、高劑量組小鼠肝臟中GSH-Px活力分別提高27.83%、31.09%（MLA-M：p＜0.01，MLA-H：p＜0.001），且與Control組相比已無 統計學差異，低劑量組（MLA-L）與Alcohol組相比雖無顯著性差異，但也上升10.89%。這表明MLA可以改善酒精暴露導致的機體抗氧化能力下降。經過MLA的干預后，中、高劑量組小鼠的肝臟MDA水平分別降低25.07%、31.97%（MLA-M：p＜0.001，MLA-H：p＜0.001），且與Control組相比已無統計學差異；低劑量組（MLA-L）與Alcohol組相比雖無顯著性差異，但也下降8.02%。這些結果表明MLA可以緩解酒精暴露導致的肝臟氧化損傷。綜合以上結果可以證實MLA能夠改善ALI小鼠肝臟氧化應激。

2.6 MLA對ALI小鼠炎癥因子的影響

IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子是肝臟炎性損傷的重要因素，酒精暴露會刺激庫普弗細胞產生IL-1β、IL-6和TNF-α，造成肝細胞炎性損傷，加劇ALI的進展[32,33]?；诖?，研究檢測了小鼠肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。結果顯示（圖5a，b，c），與Control組相比，Alcohol組小鼠肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量分別升高38.35%、53.88%、39.40%（p＜0.001）；研究報道MLA能夠降低高脂飲食誘導小鼠肝臟TNF-α等肝臟炎癥因子的mRNA水平[15]，在本實驗中，MLA低、中、高劑量組小鼠肝臟IL-1β水平與Alcohol組相比分別降低12.88%、23.51%、27.19%（MLA-L：p＜0.05；MLA-M：p＜0.001；MLA-H：p＜0.001），且中、高劑量組與Control組相比已無統計學差異；與Alcohol組相比，MLA中、高劑量組小鼠肝臟IL-6水平均分別下降18.61%、25.41%（MLA-M：p＜0.05；MLA-H：p＜0.001），且中、高劑量組與Control組相比已無統計學差異，低劑量組小鼠肝臟IL-6水平雖無顯著性變化，但也降低14.31%；與Alcohol組相比，MLA中、高劑量組小鼠肝臟TNF-α水平分別降低11.78%、29.59%（MLA-M：p＜0.05；MLA-H：p＜0.001），且高劑量組與Control組相比已無統計學差異，低劑量組小鼠肝臟TNF-α水平雖無顯著性變化，但也降低了8.48%。以上結果表明MLA能抑制ALI小鼠肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達，這與其發揮減輕ALI小鼠肝臟炎癥反應的作用有關。

3 結論

現有研究表明MLA對多種肝臟損傷具有保護作用，但MLA對酒精性肝損傷的保護作用尚未見報道。本研究發現了MLA可以降低酒精性肝損傷小鼠的肝臟腫大，改善其脂代謝，保護其肝臟形態結構及功能，并且能夠改善其肝臟氧化應激和炎癥反應。這些研究結果證實MLA可以改善小鼠酒精性肝損傷，其作用機制可能與改善肝臟氧化應激和抑制炎癥反應有關。本研究可為桑葉防治酒精性肝損傷及相關功能食品的研究與開發提供依據。