人參葉多酚GLP-8調控AhR/NLRP3信號通路抑制BaP誘導的氣道上皮細胞炎癥因子過表達

羅丹，黃云，羅敏，羅強，劉杰，李玉英

（1.西南醫科大學附屬醫院呼吸科，四川瀘州 646000）

（2.深圳大學醫學部過敏反應與免疫學研究所，廣東深圳 518000）

研究顯示，哮喘發病率及死亡率在全球范圍內呈明顯升高趨勢，預計未來10年，因哮喘導致的死亡率會增加20%，而哮喘患者病情不能得到有效控制是重要的誘因之一[1]。在誘發哮喘的諸因素中，大氣污染物不僅能誘發、加重哮喘、過敏性鼻炎和急性支氣管炎，對肺功能也會造成嚴重的損傷[2,3]。苯并芘（Benzo (a) pyrene，BaP）是多環芳烴化合物，是一種典型的環境污染物。BaP來源廣泛，包括香煙煙霧、熏烤油炸食品、工業廢水以及受污染的大氣等[4]。隨著工業化進程的推進，城市大氣污染狀況的加重與呼吸道疾病，尤其是哮喘的發病率有著直接的關系[5]。

中藥應用于哮喘的臨床治療，具有改善哮喘癥狀、提高哮喘患者肺功能以及減輕呼吸道炎癥的作用。人參（Panax ginsengC.A.Mey）是五加科、多年生草本植物，具有改善心功能及提高免疫力的功效[6,7]。目前，關于人參的研究多集中于生物活性較佳的人參皂苷及人參多糖[8]。其中，人參皂苷的主要藥理作用為改善微循環[9]、提高組織抗缺氧能力、抑制血小板聚集[10]、Ca2+拮抗作用、影響前列腺素（PGs）代謝[11]、抗腫瘤[12]、抗衰老等[13]。在實際應用過程中人參葉多是被丟棄部分，但作為人參植物的一部分，研究發現人參葉中也含有多種生物活性成分，并具有抗疲勞、抗高血糖、抗肥胖、抗衰老等作用[14]。但人參葉中的酚類成分的抗炎作用卻鮮有報道。因此，本文將對人參葉中的多酚類活性成分進行分離、鑒定，并對其抗BaP誘導的氣道上皮細胞損傷活性進行研究。本研究對人參葉有效利用及其中含有的生物活性成分應用于哮喘的臨床治療具有重要的指導意義。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

新鮮人參葉購于廣州市石牌區二天堂大藥房，由暨南大學藥學院陳河如教授鑒定；文中使用的檢測試劑盒、RIPA緩沖液和RNase購于碧云天生物科技有限公司（上海）；16HBE細胞購于中國科學院細胞庫（上海）；抗體購于Cell Signaling（CST，USA）；其它化學品均購于Sigma或Adamas。

KQ-250B超聲波提取器，昆山市超聲波儀器有限公司；Hei-VAP Core ML G3 XL旋轉蒸發儀，購于德國海道夫公司；Agilent 1100半制備型高效液相色譜儀購于美國安捷倫公司。

1.2 人參葉有效成分提取和分析

人參葉酚類成分的提取按照前述方法[15]進行，即通過超聲提取法對新鮮人參葉（1.92 kg）酚類活性成分進行提取，以水/二氯甲烷（1:1）為提取劑，料液比1:20（m/V，g/mL）萃取，并通過旋轉蒸發儀對提取藥液濃縮，得人參葉提取物浸膏（87 g）。將二氯甲烷組分（8.25 g）硅膠柱層析，用乙酸乙酯-甲醇梯度體系（100:1、10:1、1:1、0:1）洗脫，得到4個組分?；贐aP暴露誘導的16HBE細胞損傷模型，評價以上4個組分的保護活性，活性最佳部分用于后續分離。將組分1（1.24 g）置于硅膠柱上，用二氯甲烷/甲醇溶劑體系（100:5、20:1、1:1、0:1）梯度洗脫，得5個亞組分?；贐aP暴露誘導的16HBE細胞損傷模型，評價以上5個組分的保護活性，活性最佳部分用于后續分離。組分2（0.71 g）采用半制備型高效液相色譜法（甲醇-水，40:60；流速：3 mL/min），得到GLP-1（tR 5.2 min）、GLP-4（tR 7.8 min）和GLP-11（tR 11.3 min）；組分4（0.88 g）采用半制備型高效液相色譜法（甲醇-水，30:70；流速：3 mL/min），得到GLP-2（tR 12.2 min）、GLP-5（tR 15.5 min）和GLP-9（tR 19.4 min）；組分5（0.95 g）采用半制備型高效液相色譜法（甲醇-水，50:50；流速：3 mL/min），得到GLP-3（tR 7.8 min）、GLP-6（tR 11.3 min）、GLP-7（tR 17.3 min）、GLP-8（tR 22.5 min）和GLP-10（tR 29.0 min）；進一步的GLP-1～11的結構通過1H-NMR、13C-NMR和ESI-MS進行分析鑒定。

本項目分析儀器使用ACQUITY UPLC系統聯合和Q Exactive HF混合四極桿Orbitrap，并帶有ESI離子源和Orbitrap質量分析儀。質譜儀以35000質量分辨率（200m/z）運行，配備C18色譜柱（UPLC BEH C18，2.1×100 mm，1.7 mm；Waters）結合使用。梯度洗脫所用的流動溶液為水和甲醇，其中含有0.05%的全氟戊酸（PFPA）和0.1%的FA。柱溫為40 ℃，進樣量5 μL，檢測波長254 nm，流速0.4 mL/min。質譜掃描范圍設置為70～1000m/z。在正離子和負離子模式下，MS毛細管溫度均為350 ℃。

1.3 細胞培養及細胞活性檢測

按參考文獻[16]所述方法進行細胞培養，即將人支氣管上皮（16HBE）細胞培養于10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺等配置的Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培養基中（37°C，5% CO2）。

GLPs對16HBE細胞的保護活性采用CCK8試劑盒測定：16HBE細胞（1×104cells/孔）接種到含有200 μL培養基的96孔培養板中，過夜。細胞經BaP（1.00 μmol/L）暴露2.0 h后，冷磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2遍，再加入含有5 μg/mL GLPs的培養基培養12 h，CCK8試劑盒檢測細胞活力。

1.4 細胞內活性氧（ROS）和炎癥細胞因子檢測

ROS和炎癥細胞因子（IL-33、IL-25、IL-1β及IL-6）檢測分別按照相應檢測試劑盒說明書進行：16HBE細胞（5×105cells/孔）接種于6孔板，過夜；BaP（1 μm）暴露2 h，冷PBS清洗2遍，再加入含有GLP-8（5 μg/mL、25 μg/mL）的培養基培養12 h。據檢測試劑盒要求，測量細胞內ROS和炎癥細胞因子含量。

1.5 線粒體跨膜電位（ΔΨm）及細胞凋亡檢測

按照參考文獻進行線粒體跨膜電位檢測，即16HBE細胞（5×105cells/孔）接種于6孔板，過夜；然后BaP（1 μmol/L）暴露2 h，冷PBS清洗2遍，加入含有GLP-8（5 μg/mL、25 μg/mL）的培養基培養12 h，收集細胞，冷PBS洗滌。室溫，加入含有1 μg/mL JC-1染液孵育30 min。棄上清液，使用流式細胞儀檢測[18]。

按照參考文獻進行細胞凋亡檢測，即16HBE細胞（5×105cells/孔）接種于6孔板，過夜；然后BaP（1 μmol/L）暴露2 h，冷PBS清洗2遍，加入含有GLP-8（5 μg/mL、25 μg/mL）的培養基培養12 h，收集細胞Annexin V-FITC/PI孵育，流式細胞儀檢測細胞狀態[17]。

1.6 Western blotting實驗

16HBE細胞（3×106cells/皿）接種于10 cm培養皿中培養過夜；BaP（1 μmol/L）暴露2 h，冷PBS清洗2遍，加入含有GLP-8（5 μg/mL、25 μg/mL）的培養基培養12 h，收集細胞，采集總蛋白，用Bradford蛋白測定法測定蛋白質含量。參考文獻進行Western blotting蛋白分析[18]。利用Image J軟件對蛋白密度進行分析。

1.7 統計分析

用Graphpad Prism 5（San Diego，USA）進行數據分析；通過Student'st-檢驗進行對照和治療之間的統計學比較。所有實驗至少進行3次；數據表示為平均值（mean）±平均值的標準誤差（SD）；p＜0.05被認為具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 人參葉酚類化合物的分離及鑒定

經活性追蹤及多種色譜分離方法共分離鑒定出11個人參葉酚類化合物（圖1）分別為GLP-1（Oligophculatin A）、GLP-2（Oligophculatin B）、GLP-3（Oligophculatin C）、GLP-4（Oligophculatin D）、GLP-5（Oligophculatin E）、GLP-6（Oligophculatin F）、GLP-7（Albaspidin AP）、GLP-8（Albaspidin AA）、GLP-9（Albaspidin AB）、GLP-10 （Methylene-bis-phlorobutyrophenone）、GLP-11（1-[3-[(3-acetyl-2,4,6-trihydroxyphenyl)methyl]-2,4,6-t rihydroxyphenyl] butanone）。其中，GLP-1～11均為首次從人參葉中分離獲得。

參考相關文獻[19]，通過高效液相色譜儀測得GLP-1～11的純度＞98.0%。

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2.2 人參葉酚類化合物保護活性評價

用不同濃度的GLPs最終化合物的純品（0.01～5.00 mg/mL）處理16HBE細胞24 h，并通過CCK8測定細胞活力以測定GLPs自身細胞毒性。實驗結果表明，與空白對照組相比，GLPs在低于3.60 mg/mL時，16HBE細胞活力均無顯著性差異。

與空白對照組（細胞存活率設為100%）相比，BaP暴露使16HBE細胞活力降低19.70%，由此說明BaP暴露對細胞造成了一定的損傷，進而使其細胞活力降低。而與BaP組相比，經GLPs處理后16HBE細胞活力升高。其中，GLP-8組16HBE細胞活力提升最為顯著；與BaP組相比，16HBE細胞活力提升13.90%（表3）。由此得出，GLPs可減輕BaP暴露導致的16HBE細胞損傷，進而發揮保護活性?；贕LP-8具有最佳抗BaP暴露誘導的損傷活性，進而以GLP-8為代表，研究其潛在的分子作用機制。

表3 GLP-1～11增強人氣道上皮細胞（16HBE）抗Bap暴露導致的損傷活性 Table 3 GLP-1~11 enhance protective activity of 16HBE cells against Bap-exposure induced cell viability decline

2.3 GLP-8抑制BaP暴露導致的16HBE細胞氧化應激

自由基活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產生過?；蚩寡趸芰ο陆禃T發DNA損傷和DNA損傷修復反應及細胞凋亡[20]。研究報道，BaP能夠作用于人支氣管上皮細胞、肺泡組織使谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性降低，誘發ROS及MDA含量升高，進而導致氧化應激，損傷人支氣管上皮細胞及肺泡組織[21]。因此，減少ROS的生成是減輕氧化損傷的一種重要策略。如圖2a所示，BaP暴露顯著誘導了16HBE細胞ROS的生成，與空白對照組相比，BaP組ROS含量升高247%。GLP-8處理后，BaP誘導的ROS含量升高被顯著抑制，ROS含量分別降低19.30%（5 μg/mL）和41.30%（25 μg/mL）?；诖丝赏茰y人參葉多酚類化合物可能是通過抑制BaP暴露導致的細胞內ROS過量產生，抑制氧化應激發揮保護活性的。

細胞凋亡線粒體途徑在細胞氧化應激過程中起著重要作用[22]。為研究GLP-8減輕BaP誘導的細胞氧化損傷的潛在機制，進一步檢測了16HBE細胞ΔΨm的變化情況。如圖2b所示，與空白對照組相比（4.46%），BaP暴露使16HBE細胞ΔΨm顯著下降13.33%。而經GLP-8共培養后，ΔΨm下降被顯著抑制，BaP暴露誘導的ΔΨm分別下降7.87%（5 μg/mL）和4.46%（5 μg/mL）。GLP-8能夠減少BaP暴露導致的16HBE細胞內ROS積累并抑制BaP暴露導致的16HBE細胞ΔΨm下降。實驗結果進一步證實，GLP-8可能通過抑制BaP暴露導致的氧化應激發揮保護16HBE細胞作用。

線粒體通透性轉變孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore，MPTP）是位于線粒體內外膜之間由多個蛋白質組成的復合通道。其中，Bcl-2家族相關蛋白能夠調控MPTP。其次細胞內Ca2+，ROS等也可能直接或間接參與MPTP的調控[23]。MPTP開放導致線粒體基質內的高滲透壓可能使基質腫脹導致外膜破裂，釋放出細胞色素C（Cytochrome C，Cyt c）。而Cyt c從線粒體釋放到細胞漿會降低細胞抗氧化能力，進而誘發細胞凋亡[24]。本實驗中，BaP暴露顯著誘導了Cyt c從線粒體釋放到胞質中（圖2c）。而GLP-8顯著抑制了BaP暴露導致的Cyt c從線粒體到胞質的釋放。Bcl-2家族蛋白對細胞凋亡的調控至關重要，其中抗凋亡蛋白（Bcl-2）和促凋亡蛋白（Bax）的比例是調控MPTP，決定細胞凋亡進程的關鍵調控因素[23]。因此，本文檢測了GLP-8對BaP暴露導致的Bcl-2家族蛋白（Bcl-2和Bax）表達變化的影響。如圖2c所示，BaP暴露導致的Bcl-2下調及Bax表達上調，Bcl-2/Bax比例降低。而GLP-8處理后，BaP暴露導致的Bcl-2/Bax比例降低被顯著扭轉，這些結果表明GLP-8可通過線粒體信號途徑減輕BaP暴露導致的16HBE細胞氧化應激。

2.4 GLP-8抑制BaP暴露誘導的16HBE細胞炎癥因子分泌

研究報道，BaP暴露能夠促進Der f 1誘導的上皮細胞因子釋放，進而加重對氣道上皮細胞的損傷[16]。接下來，本文研究了BaP暴露是否能誘導上皮細胞因子的產生，以及GLP-8是否能抑制這種反應。16HBE細胞BaP暴露后，ELISA檢測發現，IL-33、IL-25、IL-1β及IL-6含量顯著升高（圖3）；與空白對照組相比，BaP暴露使IL-33、IL-25、IL-1β及IL-6含量分別升高247%、67.90%、62.70%及103.20%。相反的，GLP-8抑制了BaP暴露誘導的16HBE細胞上皮細胞因子IL-33、IL-25、IL-1β及IL-6的過表達。與BaP暴露組相比，GLP-8（25 μg/mL）使IL-33、IL-25、IL-1β及IL-6的分泌減少60.10%、28.90%、33.50%及41.90%。以上實驗結果說明，GLP-8可能是通過抑制BaP暴露導致的炎癥細胞因子發揮保護功能的。

2.5 GLP-8抑制BaP暴露誘導的16HBE細胞凋亡

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡形式，在細胞凋亡過程中細胞形態會發生顯著的變化，如細胞收縮、核碎裂和染色質凝聚等[25]。本實驗中，與空白對照組（細胞總凋亡率為7.80%）相比，BaP暴露使細胞凋亡顯著增加（BaP組，細胞總凋亡率為24.50%）。而與BaP暴露組相比，GLP-8治療組細胞凋亡率分別降低5.80%和9.30%（圖4）。細胞凋亡實驗為GLP-8抑制BaP暴露誘導的16HBE細胞損傷提供了進一步的證據。

2.6 GLP-8抑制BaP誘導的芳基烴受體（AhR）活化及核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體激活

研究報道，芳基烴受體（AhR）活化在BaP加重塵螨誘發的過敏性哮喘患者炎癥細胞因子IL-33、IL-25和胸腺基質淋巴細胞生成素（Thymic Stromal Lymphopoietin，TSLP）的過表達中具有十分重要的作用[17]。為了檢測GLP-8能否抑制BaP暴露誘導的AhR活化，本文檢測了AhR及其下游主要蛋白細胞色素P450亞酶1A1（CYP1A1）的表達情況。結果如圖5a、5b顯示，BaP暴露使AhR及CYP1A1的表達顯著增加，而GLP-8抑制了BaP暴露誘發的AhR信號激活。研究報道，BaP暴露會誘導呼吸道上皮細胞ROS產生，激活AhR信號通路并進一步誘發上皮細胞因子過表達。本文的實驗結果顯示，GLP-8能夠抑制BaP暴露誘導的16HBE細胞ROS過量產生，GLP-8處理后，ROS含量分別降低19.30%（5 μg/mL）和41.30%（25 μg/mL）；GLP-8也能夠抑制BaP暴露誘導的16HBE細胞AhR信號通路激活，與空白對照組（AhR表達設為100%）相比，BaP暴露使AhR的表達增加89.10%，CYP1A1的表達增加49.32%，經GLP-8處理后，BaP暴露使AhR的表達降低了40.00%，CYP1A1的表達降低了65.50%。

NLRP3炎癥小體是由NOD樣受體（NOD-like receptor，NLR）家族成員NLRP3蛋白與ASC接頭蛋白及胱冬肽酶-1（Caspase-1）胱冬肽酶形成的一個多蛋白復合物，其活化后能促進IL-1β、IL-18和IL-33等多種炎癥細胞因子的剪切，成熟與分泌，因而在炎癥發生過程中起關鍵作用。NLRP3炎癥小體作為固有免疫的重要組分在機體免疫反應和疾病發生過程中具有重要作用[26]。因此，本實驗中進一步檢測了BaP暴露及GLP-8對NLRP3炎癥小體NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達的影響。結果如圖5c、5d所示，BaP暴露顯著誘導了NLRP3炎癥小體NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白的表達，分別增加69.80%、92.60%、151.20%；而GLP-8抑制了BaP暴露誘發的NLRP3炎癥小體激活，GLP-8處理后的NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達量增加顯著降低，分別為19.40%（5 μg/mL）、18.58%（5 μg/mL）、67.40%（5 μg/mL）。

3 結論

本研究發現環境污染物BaP暴露會誘發氣道上皮細胞ROS過量產生并誘發氧化應激，激活AhR信號通路；進一步的，BaP暴露會誘發氣道上皮細胞炎癥因子分泌并激活NLRP3炎癥小體，最終導致細胞凋亡。本文分離的人參葉多酚類化合物具有抗BaP誘導的氧化損傷及炎癥損傷的活性。其中，GLP-8能夠抑制BaP暴露誘導的ROS過量產生及炎癥細胞因子（IL-33、IL-25、IL-1β及IL-6）等過表達。進一步研究發現，GLP-8可能是基于抑制NLRP3炎癥小體及AhR信號通路相關蛋白的表達進而發揮抗炎及抗氧化活性的。同時，本研究為人參葉有效活性成分的提取及其應用于哮喘的臨床治療方面提供了一定的理論借鑒依據。