γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp改善斑馬魚焦慮樣行為及五羥色胺合成的作用機制

朱西平，崔春，王煒，王順民，陶瑾，郭玉峰

（1.安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽蕪湖 241000）（2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）（3.廣東巍微生物科技有限公司，廣東廣州 510640）

焦慮癥（Anxiety disorders）又名焦慮性神經癥，是當今世界上最為常見的全球性精神衛生問題之一，嚴重影響著人們的生活質量[1,2]。目前關于焦慮癥的發病機制涉及以下幾種假說：神經遞質假說、免疫系統假說、HPA軸假說、腦源性神經營養因子假說、遺傳學假說等[3,4]。其中單胺類神經遞質五羥色胺（5-HT）分泌異常在精神類疾病的診斷和治療中扮演著非常重要的角色，是目前最為公認的發病機制假說之一[5]。研究表明合成和分泌5-HT的中樞神經系統與調節情緒的腦區（如海馬、前額葉皮層）有著密切的突觸聯系，構成了單胺類神經遞質5-HT參與精神類疾病調節的生理基礎[6]。近幾年越來越多的學者開始關注5-HT在焦慮障礙中所發揮的作用，此外臨床上用于治療焦慮癥的藥物的作用機制和靶點也多數是通過調節突觸間隙神經遞質5-HT的水平來發揮作用[7-9]，但是這些藥物均具有其自身的局限性（用藥時間長、起效慢、副作用明顯、復發率高和癥狀緩解不徹底等特點），其作用機理也有待進一步明確[10]。隨著人們對生活質量的要求越來越高，單純通過藥物調節中樞神經系統5-HT水平的治療已經無法滿足人們的需求，因此營養干預在精神類疾病中的作用越來越受到重視。

色氨酸（Trp）是5-HT合成的直接前體物質，5-HT又是抑制大腦產生焦慮情緒的神經遞質，因此膳食補充Trp及其衍生物可增加機體Trp濃度進而提高5-HT的水平[11]。流行病學和臨床研究表明，Trp及其衍生物營養干預能夠有效降低精神類疾病的發病率，并且有學者建議Trp可作為改善精神健康的飲食進行補充[12-15]。由于Trp肽比Trp具有更優的吸收機制和更強的生物活性，近幾年Trp肽營養干預在精神類疾病中的研究不斷增加，Orosco等[13]和Zhu等[14,15]研究表明通過膳食補充乳清蛋白源色氨酸寡肽可增加實驗動物中樞神經系統5-HT的釋放，具有抗焦慮的作用。γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp已被證明具有改善焦慮性抑郁癥小鼠的焦慮樣行為作用，但是關于其改善斑馬魚焦慮樣行為的研究尚處于空白。γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp是以谷氨酰胺（Glutamine，Gln）和Trp為反應底物在解淀粉芽孢桿菌源L-谷氨酰胺酶（L-Glutaminase）的催化下定向合成的系列產物，由γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp 和γ-[Glu]4-Trp四種寡肽組成[15]，但是關于γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp和γ-[Glu]4-Trp分別作用改善和預防焦慮癥的研究尚處于空白。因此，本文以γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp、γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp和γ-[Glu]4-Trp為供試品，利用斑馬魚模式生物研究其改善焦慮樣行為和促進5-HT合成的作用，再結合生化指標探究其改善焦慮癥的作用機制，篩選出改善焦慮效果最優的肽單體。旨在為γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體預防和改善焦慮癥的作用機制提供方法指導和理論依據，這些研究對促進γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體的未來實際應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成年斑馬魚（野生型AB品系），♀ ♂比為1:1，2月齡由華南理工大學醫學院斑馬魚實驗室培育；解淀粉芽孢桿菌源L-谷氨酰胺酶（100 U/g）購買于天野酶中國有限公司（中國上海）；L-色氨酸和L-谷氨酰胺兩種氨基酸（純度≥95%）購買于上海伯奧生物科技有限公司（中國上海）；γ-Glu-Trp（γ-EW）、γ-[Glu]2-Trp（γ-EEW）、γ-[Glu]3-Trp（γ-EEEW）、γ-[Glu]4-Trp（γ-EEEEW）（純度≥95%）四種商業合成色氨酸肽單體均由南京肽業生物科技有限公司（中國南京）合成；解剖剪、鑷子、鋁箔紙、一次性過濾器、研缽、離心管、移液器等均購于廣州精科化玻儀器公司（中國廣州）；生化指標測定所需的試劑盒均購買于上海江萊生物科技有限公司（中國上海）。

1.2 實驗方法

1.2.1 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp的制備

酶法定向合成γ-谷氨酰色氨酸肽（γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp，EnW）的方法參照Yang等[16]，稍有改進。以Gln為?；w、Trp為?；荏w、Gln:Trp=300 mmol/L:100 mmol/L、底物濃度為0.2 mol/L、酶添加量為0.15%（m/V）在37 ℃和pH 10.0的條件下利用解淀粉芽孢桿菌源L-谷氨酰胺酶催化反應180 min。然后利用沸水浴的方法滅酶處理15 min以終止反應，冷凍干燥，-20 ℃保存，待用。采用UPLC-ESI-MS/MS對整個反應產物進行序列和結構鑒定，UPLC-ESI-MS/MS相關參數設定如下：干燥氣溫度180 ℃、流速8.0 L/min；掃描范圍質荷比（m/z）50～1000；毛細管電壓4500 V；四級桿電子能量為4.0 eV，碰撞誘導裂解能為8.0 eV。采用電噴霧離子源ESI+模式下掃描，ESI+霧化器壓力為1.5 bar；采用Data analysis 4.1軟件對原始數據進行手動de novo分析得到反應產物中多肽序列，測定的多肽實際分子質量應與其理論值相匹配，偏差在300×10-6以內，然后根據Yang等[17]采用離子峰萃取的方法對鑒定的系列產物進行定量分析。

1.2.2 供試品的最大耐受濃度（MTC）測定

斑馬魚飼養在華南理工大學醫學院斑馬魚實驗室，參照王麗娟[18]的方法進行，并有所改進。供試品的最大耐受濃度（MTC）測定方案經華南理工大學斑馬魚實驗室批準，并遵循中國試驗動物護理和使用指南。EnW、γ-EW、γ-EEW、γ-EEEW、γ-EEEEW五個供試品均按照不同的濃度分為6個組（一個正常組和5個濃度梯度組），共計30個組別，每組30尾斑馬魚，然后隨機選取900尾斑馬魚于6孔板中（溫度28.5±0.2 ℃、pH值7.5±0.02）開始供試品最MTC測定。上述供試品（EnW、γ-EW、γ-EEW、γ-EEEW、γ-EEEEW）均按照如下濃度梯度測試：0、125、250、500、1000和2000 μg/mL。供試品處理24 h后，觀察斑馬魚狀態，記錄并統計各實驗組斑馬魚的毒性情況與死亡數量，確定上述五種供試品的MTC。

1.2.3 動物分組

依據1.2.2的結果得到EnW、γ-EW、γ-EEW、γ-EEEW、γ-EEEEW的MTC，選取各供試品的MTC和1/9 MTC為實驗的高劑量組和低劑量組，同時設置一個正常對照組，共計11個組別，每個組30尾斑馬魚。330尾斑馬魚（溫度28.5±0.2 ℃、pH值7.5±0.02、魚缸容積3 L、14/10 h光暗循環，電導率450～550 μs/cm；系統水為循環水，每日自動更新10%，并有紫外燈實時凈水消毒），利用斑馬魚獨立養殖系統養殖斑馬魚，每日喂食兩次，食物為豐年蝦卵。試驗方案經華南理工大學斑馬魚實驗室批準，并遵循中國試驗動物護理和使用指南。330尾斑馬魚隨機分為11組，分別為正常對照組（NC）；EnWL（EnW低劑量組56 μg/mL）、EnWH（高劑量組500 μg/mL）；γ-EWL（γ-EW低劑量組56 μg/mL）、γ-EWH（γ-EW高劑量組500 μg/mL）；γ-EEWL（γ-EEW低劑量組56 μg/mL）、γ-EEWH（γ-EEW高劑量組500 μg/mL）；γ-EEEWL（γ-EEEW低劑量組56 μg/mL）、γ-EEEWH（γ-EEEW高劑量組500 μg/mL）；γ-EEEEWL（γ-EEEEW低劑量組56 μg/mL）、γ-EEEEWH（γ-EEEEW高劑量組500 μg/mL）。供試品處理前將斑馬魚移入一個3 L的魚箱中適應3 d，適應期結束后供試品處理14 d。每天供試品處理時將實驗斑馬魚從飼養魚缸中撈出，放入浸有相對濃度 供試品的魚水中，浸泡30 min，然后再轉入飼養魚缸中。在第15 d供試品處理結束后一天將受試斑馬魚放入干凈的測試魚箱中，進行行為學測試。

1.2.4 行為學實驗

供試品以水溶給藥的方式處理14 d后，在白天（早7:00～晚17:00）對所有實驗組斑馬魚進行焦慮樣行為測試。為了確保獲得準確的結果必須使整個行為學測試過程在一個安靜和平穩的環境下進行，此外，且整個測試過程中保持水溫、水質與正常飼養條件一致。

1.2.4.1 黑白偏好實驗

黑白偏好實驗模型為長×寬×高（18 cm×9 cm×7 cm）的魚箱，通過可控式隔板把魚箱分為兩個相等的部分，一側四周均被黑色包繞，另一色則被白色包繞。斑馬魚黑白偏好實驗根據蔣湘云[19]報道的方法，并有所改進，供試品處理14 d后，將正常飼養魚水（溫度28.5±0.2 ℃、pH值7.5±0.02）裝入黑白偏好實驗測試裝置中，水深約3～4 cm，并保證斑馬魚能在整個測試過程中自由游動。實驗開始前，先將受試魚轉移至行為學檢測所用場地，并給予受試魚30 min時間來適應周圍環境。測試開始時，首先將斑馬魚輕柔且迅速的放入明區，然后打開閥門，點擊開始按鈕，開始一個6 min的測試。整個測試過程中采用Zebralab 3.3斑馬魚行為軌跡分析儀（法國Viewpoint公司）系統跟蹤和記錄斑馬魚的運動和行為。試驗結束后，將斑馬魚從水中取出并放回飼養魚缸中。整個實驗采集數據，再分析斑馬魚在明區的停留時間，計算明區停留時間百分比見公式（1）。

1.2.4.2 新魚缸實驗

新魚缸實驗模型為底面長×寬×高×頂面長（22.5 cm×7.1 cm×15.2 cm×27.9 cm）的梯形魚箱，將新魚缸裝上魚水，水面距離上頂面約2～3 cm。將斑馬魚從飼養魚缸缸轉移至測試新魚缸中，測試過程中光照強度與平時飼養條件相同，實驗開始前，先將受試魚轉移至行為學檢測所用場地，并給予受試魚30 min時間來適應周圍環境。適應結束后點擊開始按鈕，開始一個6 min的測試。整個測試過程中采用Zebralab 3.3斑馬魚行為軌跡分析儀（法國Viewpoint公司）系統跟蹤和記錄斑馬魚的運動和行為。試驗結束后，將斑馬魚從水中取出并放回飼養魚缸中。整個實驗采用先采集數據，后分析斑馬魚6 min內在新魚缸中的上下穿梭次數和魚缸上半部分停留時間百分比。

1.2.5 生化指標測定

行為學結束后，立即在冰上快速分離受試斑馬魚腦組織，用4 ℃的生理鹽水沖洗3～5次后用吸水紙吸干斑馬魚腦組織，再加入9倍體積的磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS），然后用均質儀將組織樣品勻漿，最后4 ℃、3000 r/min離心20 min取上清液，將上清液分裝后，-80 ℃保存，待用。斑馬魚腦組織中Trp濃度、TPH活性、吲哚胺-2,3-雙加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase，IDO）活性、犬尿氨酸（Kynurenine，KYN）和5-HT水平等生化指標測定根據試劑盒說明書采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（Elisa）方法。整個測定方法簡述如下：首先將試劑盒取出室溫（25±2 ℃）平衡20 min，往包被單抗的微孔中分別依次加Trp、TPH、IDO、KYN和5-HT，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺顯色，然后用分光光度法在450 nm波長下測定OD值，根據OD值計算斑馬魚腦組織中Trp濃度、TPH活性、IDO活性、KYN和5-HT水平。

1.2.6 數據處理

實驗數據采用Excel、OriginPro 8.5.1、SPSS 17.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）等統計分析軟件進行分析和作圖；所有實驗均重復三次并采用“平均值±標準偏差”的形式來表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和兩兩比較采用Duncan’s post-hoc檢測，p＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 酶促反應體系中γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp的表征特性

為進一步探究以Gln為供體、Trp為受體，在解淀粉芽孢桿菌源L-谷氨酰胺酶催化作用下獲得的酶促反應液，采用UPLC-ESI-MS/MS對酶促反應液進行定性定量分析和結構鑒定。原始數據通過Data analysis 4.1軟件中的手動de novo分析后，結果如表1所示。從該酶促反應液中共鑒定出四種γ-谷氨酰肽：γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp、γ-[Glu]4-Trp。在正離子[M+H+]模式中質核比（m/z）為334.14、463.18、592.22、721.27分別對應多肽γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp、γ-[Glu]4-Trp的理論m/z（334.14、463.18、592.22、721.27）（Error≤300×10-6）。然后采用離子峰萃取的方法對γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp酶促反應 液 中γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp、γ-[Glu]4-Trp進行定量分析，分析結果可知γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp的總轉化率達到45.72%（m/m），其中γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp、γ-[Glu]4-Trp的產率分別為30.82%、10.36%、3.51%和1.03%（m/m）。綜上所述，以Gln為?；w、Trp為?；荏w，在L-谷氨酰胺酶催化作用下能夠定向合成γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp、γ-[Glu]4-Trp系列產物，從分析結果來看，該酶促合成方法中γ-Glu-Trp和γ-[Glu]2-Trp合成率較高。

表1 酶促反應體系中γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp的表征特性 Table 1 The characterization of identified γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp in the reaction system

2.2 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體的最大耐受濃度

EnW、γ-EW、γ-EEW、γ-EEEW、γ-EEEEW設置的濃度分別為0、125、250、500、1000和2000 μg/mL。供試品處理24 h后，觀察斑馬魚行為狀態，各實驗組斑馬魚的死亡數量與毒性情況分析如表2所示，由表2可知各供試品濃度在2000 μg/mL時每組半數以上的斑馬魚出現死亡，各供試品濃度在1000 μg/mL時各組斑馬魚均出現少數死亡，但死亡率明顯下降，各供試品濃度在125、250、500 μg/mL時各組斑馬魚均未出現死亡。綜上所述，MTC確定為500 μg/mL，且為各供試品的高劑量組；1/9 MTC為56 μg/ml，為低劑量組。

表2 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體的濃度對斑馬魚的影響 Table 2 The effect of γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp and its peptide monomer concentration on zebrafish

2.3 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體對斑馬魚黑白偏好實驗的影響

斑馬魚黑白偏好實驗（Light-dark test）作為一種焦慮癥應激模型，是抗焦慮藥物篩選和斑馬魚焦慮模型建立與評價的經典方法，廣泛應用于應激反應、精神藥理學或神經藥理學的基礎研究[20,21]。其實驗原理是動物具有畏懼白亮區域的特性，其活動會選擇在偏黑暗的區域（趨避性），但是面對新奇區域（白亮區域）的刺激又會產生探究的沖動行為，這就造成了探究/趨避的矛盾心理，從而產生焦慮行為。供試品處理14 d后，各組斑馬魚黑白偏好實驗結果如圖1所示，從圖1可以看出各供試品處理后斑馬魚的明區停留時間百分比均高于正常對照組（NC）斑馬魚，EnWH、γ-EWH、γ-EWL、γ-EEWH、γ-EEWL和γ-EEEWH供試品處理組斑馬魚明區停留時間百分比顯著（p＜0.05）高于NC組（25.70%），其中γ-EWH（41.66%）和γ-EEWH（39.54%）供試品處理組明區停留時間百分比最高。EnWL、γ-EEEWL、γ-EEEEWH和γ-EEEEWL供試品處理組斑馬魚明區停留時間百分比雖然也高于NC組，但是不具有統計學意義（p＞0.05）。四種肽單體之間相比，γ-EWH和γ-EEWH組斑馬魚明區停留時間百分比顯著（p＜0.05）高于EnWL（31.36%）、γ-EEEWL（30.35%）、γ-EEEEWH（32.03%）和γ-EEEEWL（29.07%）組斑馬魚；γ-EWH和γ-EEWH組斑馬魚明區停留時間百分比雖然高于EnWH、γ-EWL、γ-EEWL和γ-EEEWH組斑馬魚，但是差異不顯著（p＞0.05）。根據前人研究[21]可知明區停留時間百分比越高說明小鼠探索欲望越強烈，探究/趨避的矛盾行為越少，焦慮癥狀越低。因此以上結果表明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體均具有降低斑馬魚黑白偏好實驗中焦慮樣行為的作用，其中二肽和三肽高劑量組的效果最好。

2.4 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體對斑馬魚新魚缸實驗的影響

斑馬魚新魚缸實驗結果如圖2所示，結果表明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體處理組斑馬魚在新魚缸實驗中的上下穿梭次數均高于正常對照組（圖2柱狀圖），EnWL、γ-EEEWL、γ-EEEEWH和γ-EEEEWL供試品處理組斑馬魚的在魚缸中的上下穿梭次數略高于NC組（14.57次），不具有統計學意義（p＞0.05），但是EnWH、γ-EWH、γ-EWL、γ-EEWH、γ-EEWL和γ-EEEWH供試品處理組斑馬在魚缸中上下穿梭次數顯著（p＜0.05）高于NC組，其中γ-EWH（25.83）、γ-EWL（22.89）和γ-EEWL（22.40）組斑馬魚在魚缸中的上下穿梭次數最多。γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體處理組斑馬魚在新魚缸實驗中的上半部分停留時間百分比（%）也均高于正常對照組（圖2折線圖），其中γ-EEEEWH、γ-EEEEWL和NC組之間沒有顯著差異（p＞0.05），但是其余各供試品處理組均顯著高于NC組（22.19%）。γ-EW二肽魚缸上半部分停留時間百分比最高（高劑量組38.95%和低劑量組36.81%），其次為γ-EEW三肽（高劑量組36.30%和低劑量組34.07%）。Hawkey等[22]研究表明，新魚缸實驗是一種直接、可重復的測量斑馬魚焦慮樣行為的方法，當被引入一個新的魚缸時，斑馬魚通常會潛入魚缸的底部（趨避性），但是面對新奇區域（魚缸的上部）的刺激又會產生探究的沖動，常被用來評價斑馬魚的焦慮行為。根據已有研究分析可知γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體處理后，斑馬魚趨避行為降低、探索行為增加，焦慮樣行為降低。膳食補充γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體能夠預防和改善新魚缸實驗中斑馬魚焦慮樣行為的作用，其中的γ-EW二肽和γ-EEW三肽效果較好。

2.5 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體對斑馬魚大腦TPH酶活性和5-HT水平的影響

大腦組織突觸間隙5-HT水平異常是焦慮癥產生的主要原因，Trp作為5-HT的主要前體物質，其在大腦組織中的水平及其生物利用度直接影響中樞神經系統5-HT水平[23]。因此研究了γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體對斑馬魚體內5-HT水平的影響，γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體處理后2周后各組斑馬魚大腦組織勻漿上清液中5-HT水平如圖3所示（黑色方格），EnWH、EnWL、γ-EWH、γ-EWL、γ-EEWH、γ-EEWL和γ-EEEWH處理組斑馬魚大腦組織5-HT水平均顯著（p＜0.05）高于NC（352.07 ng/mL）組，其中γ-EEEEWH和γ-EEEEWL處理組斑馬魚5-HT水平雖然也高于NC組，但是不具有統計學意義（p＞0.05）。γ-EEEWL處理組斑馬魚大腦組織5-HT水平顯著（p＜0.05）低于NC組。目前已知臨床上用的抗焦慮癥的藥物的作用機制大部分是通過增加大腦組織突觸間隙5-HT水平進而影響神經信息傳遞而發揮作用[24]。研究結果與藥物改善焦慮癥的效果一致，表明膳食補充Trp肽可以增加大腦組織5-HT水平，進而起到預防和改善焦慮癥的作用。TPH酶是促進5-HT合成的關鍵限速酶，其活性和基因表達異常均可導致5-HT合成混亂，進而引發中樞神經系統相關疾病[25,26]。斑馬魚大腦組織中TPH酶活性測定結果如圖3所示（紅色圓圈），結果表明與NC組（447.03 U/L）相比，各供試品處理組斑馬魚TPH酶活性均顯著（p＜0.05）降低。各供試品處理組斑馬魚TPH活性在630 U/L以上的組分按照依次降低的順序可描述為為：γ-EWH（637.95 U/L）＞γ-EEWH（636.67 U/L）＞γ-EWL（620.41 U/L）＞EnWH（612.50 U/L）。綜上所述，γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體均能夠增加斑馬魚TPH酶活性和提高中樞神經系統5-HT水平，其中γ-EW和γ-EEW的改善效果明顯優于γ-EEEW、γ-EEEEW。因此γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體可能是改善焦慮癥狀的潛在膳食補充劑。

2.6 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體對斑馬魚大腦IDO酶活性和KYN水平的影響

IDO酶是KYN合成的關鍵限速酶、也是Trp向KYN代謝途徑轉化的關鍵限速酶，研究表明機體在炎癥和感染狀態下由肝外組織分泌的IDO酶被激活而發揮作用，進而增加KYN的合成[27]，造成Trp耗竭，降低神經遞質5-HT的合成和Trp的生物利用度。斑馬魚大腦組織IDO酶活性和KYN水平測定結果如圖4所示，結果表明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體處理后斑馬魚大腦組織IDO酶活性與正常對照組之間沒有顯著差異（p＞0.05），不具有統計學意義。除了γ-EEEWL組外，其余各供試品處理組斑馬魚大腦組織KYN水平均與正常組之間沒有顯著差異（p＞0.05）。研究表明KYN可進一步被代謝為具有神經毒性作用的3-羥基犬尿氨酸和喹啉酸，并且KYN及其代謝產物水平異常與焦慮癥密切相關[28]。綜上所述，研究結果表明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體處理后對斑馬魚大腦組織IDO酶活性和KYN水平的影響均不顯著，說明正常機體膳食補充γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體后對機體大腦組織中IDO酶活性和KYN水平沒有明顯的影響。

2.7 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體對斑馬魚大腦Trp代謝途徑的影響

中樞神經系統5-HT的水平除了取決于大腦組織Trp的濃度外還取決于Trp的生物利用度，但是Trp的生物利用度受到其代謝途徑的影響，根據Trp代謝產物的不同可將其分為Trp-KYN代謝途徑和Trp-5-HT代謝途徑[29,30]。研究5-HT與Trp的比值（5-HT/Trp）可以間接反應Trp向5-HT代謝途徑的轉化率，研究KYN與Trp的比值（KYN/Trp）可以間接反應Trp向KYN代謝途徑的轉化率。由表3可知，與NC組相比，γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體處理2周后斑馬魚大腦組織Trp濃度均有所增加，其中EnW、γ-EW和γ-EEW高低劑量組、γ-EEEWH和γ-EEEEWL處理組顯著增加（p＜0.05），但是γ-EEEWL和γ-EEEEWH處理組斑馬魚大腦組織Trp濃度也高于NC組，但是差異不顯著（p＞0.05）。EnWH、γ-EWH、γ-EWL、γ-EEWH供試品處理組5-HT/Trp值顯著（p＜0.05）高于NC組（1586.98）斑馬魚，其中γ-EWH（1734.37）和γ-EEWH（1722.13）組的5-HT/Trp值最高，顯著（p＜0.05）高于其余各組，說明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體能夠上調Trp-5-HT代謝途徑。γ-EEEWL和γ-EEEEWH處理組除外，與NC組相比，各供試品處理組斑馬魚大腦組織KYN/Trp值均顯著（p＞0.05）降低，其中γ-EWH（1205.85）和γ-EEWH（1202.27）組的KYN/Trp值最低，說明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體能夠下調Trp-KYN代謝途徑。綜上所述，γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體供試品處理后，斑馬魚的大腦組織Trp濃度和5-HT/Trp值增加，KYN/Trp值降低，說明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體膳食補充后改善斑馬魚焦慮樣行為可能是通過提高Trp濃度和上調Trp-5-HT代謝途徑，進而增加Trp的生物利用度而發揮作用。

表3 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體對斑馬魚Trp代謝途徑的影響 Table 3 The effect of γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp and its peptide monomer on Trp metabolism of zebrafish

3 結論

本研究以γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp、γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp和γ-[Glu]4-Trp（肽單體）作為膳食補充劑，研究γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體對斑馬魚焦慮樣行為的改善作用。結果表明，與正常對照組相比，膳食補充γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體后，斑馬魚新魚缸實驗和黑白偏好實驗中的焦慮樣行為均出現不同程度的下降，其中γ-Glu-Trp和γ-[Glu]2-Trp處理組焦慮樣行為降低的最為顯著（p＜0.05）。生化指標測定結果表明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp、γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp和γ-[Glu]4-Trp供試品處理后斑馬魚大腦組織Trp濃度、TPH酶活性和5-HT水平均顯示不同程度的增加。此外，γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體可誘導Trp-5-HT代謝途徑上調。分析其作用機制可能是γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體膳食補充后作為Trp的直接來源增加了機體Trp的濃度，又通過增加TPH酶活性誘導Trp-5-HT代謝途徑上調，增加Trp的生物利用度，提高大腦組織5-HT水平。綜上所述，與正常對照組斑馬魚相比，γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽單體處理的斑馬魚具有抗焦慮、增加大腦組織Trp濃度、TPH酶活性和5-HT水平，上調Trp-5-HT代謝途徑的作用，從而證明膳食補充γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp、γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp和γ-[Glu]4-Trp具有預防和改善焦慮癥的作用，其中γ-Glu-Trp和γ-[Glu]2-Trp的作用最為顯著。