全蛋及去蛋黃替代物攝入對代謝綜合征小鼠脂代謝調控作用的比較分析

于智慧，周麗媛，朱迎春

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷 030801）

代謝綜合征（Metabolic syndrome，MetS）是一種流行率較高的常見疾病[1]，由遺傳和環境多種因素引起，是一組代謝紊亂性疾病的總稱。常見臨床癥狀有高血脂、肥胖癥、胰島素抵抗、慢性炎癥、氧化應急、高血壓和二型糖尿病等[2]。隨著人民的生活水平在不斷的提高，MetS的患病率在逐年上升，目前MetS已經成為典型慢性疾病的公共健康衛生問題。因此，飲食調控對于MetS的預防和治療具有重要意義。

我國是雞蛋的生產和消費大國，雞蛋不僅營養豐富，而且價格低廉，是人們的日常生活中的重要營養來源。雞蛋蛋黃所含有的膽固醇是人體內不可或缺的一種重要營養物質。主要參與細胞膜、各種激素、膽汁酸及維生素D的合成。膽固醇的含量與人體的健康狀況直接相關，過高會導致動脈硬化并誘發一些綜合并發癥，過低易導致血管壁脆性增加，導致人體免疫力和應急能力降低[3]。在過去研究中，雞蛋以其高膽固醇含量受到人們飲食限制，然而近些年許多國外研究表明蛋黃攝入可調控脂質代謝紊亂。研究表明，健康人群食用雞蛋可改善血清高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）功能，增加血漿類胡蘿卜素含量并維持低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）與高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）比率[4,5]。此外，Lemos等[6]研究表明健康人每日食用3枚雞蛋可有效提高血清HDL-C含量，但對于LDL-C/HDL-C比率無顯著影響。Shin等[7]研究表明，每日攝入雞蛋能夠提高MetS患者血清中HDL-C含量水平，并提高對膽固醇的運載能力。同時，在超重和肥胖成年男性中進行的研究表明，12周適度限制碳水化合物的飲食下，每日食用3個雞蛋不會影響血漿LDL-C。較不含膽固醇的雞蛋攝入組相比，蛋黃攝入可有效提高血漿HDL-C含量[8]。

然而，目前對于蛋黃攝入對于MetS的影響研究較少。蛋黃對MetS的作用機理不清楚。因此，探究雞蛋蛋黃對于人體的作用和影響對于人們日常飲食具有重要的指導意義?；谝陨?，本實驗通過高脂飼料建立MetS小鼠模型，實驗周期為60 d，比較探究全蛋（EGG）攝入與去蛋黃（SUB）攝入對MetS血脂代謝的影響。同時，洛伐他汀類藥物在MetS治療中應用具有廣泛的積極作用，能夠改善患者血脂指標和心功能，提高整體的治療效果，因此，本實驗設置諾伐洛伐藥物作為陽性對照組。在實驗周期中定期測定小鼠體重、攝食，在實驗末期測定主要臟器指標（心臟、肝臟、脾臟、腎臟和附睪脂肪組織），通過對血脂相關指標進行系統測定，比較EGG和SUB攝入對MetS小鼠脂代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：C57BL/6雄性小鼠40只、普通飼料（D12450B）、高脂飼料（D12492）、全蛋粉墊料購買于北京斯貝福生物技術有限公司，合格證號：NO.110324200102532878，動物許可證號：SCXK(京) 2019-0010。其中去蛋黃代替物粉（SUB）由（99%蛋清），1%的瓜爾豆膠和黃原膠，0.01%的β-胡蘿卜素組成，含有0 mg的膽固醇。

主要試劑：TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT及AST、SOD、MDA檢測試劑盒和總蛋白定量測定試劑盒（BCA法）購買于南京建成生物工程研究所。洛伐他?。↙ov）購買于北京萬生藥業有限公司。

1.2 主要儀器與設備

SRH高壓均質機，上海申鹿均質機有限公司；SPectraMax i3x多功能酶標儀，美國Molecular Devices；小鼠用灌胃針12號，北京中科恒天科技有限公司；BSM電子分析天平，江蘇灼卓精密儀器有限公司；BC/BD-20ZHT冷凍冰箱，青島海爾特種電冰柜有限公司；BTP-8Z冷凍干燥機，SP Scientific公司；WFJT200可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司。

1.3 試驗設計

實驗經山西農業大學動物實驗倫理委員會批準，符合動物實驗倫理。選擇40只C57BL/6雄性小鼠作為實驗對象，體重24.5～26 g之間，飼養于山西農業大學動物科學學院小鼠屏障房內，進行一周的適應性實驗。將小鼠放于層流架中喂養，采用12 h采光/12 h暗室采光循環條件，控制動物房溫度21～23 ℃之間，相對濕度在40%，隨機分配，分成五組，每組8只，分別為普通飼料組（ND）、高脂飼料洛伐他汀組（Lov）、高脂飼料組（HFD）、高脂飼料去蛋黃雞蛋代替物組（SUB）、高脂飼料全蛋組（EGG）。灌胃劑量按照60 kg成年人每日食用3個雞蛋（50 g雞蛋干重）的劑量為0.83 mg/g，按照小鼠劑量=人的劑量×9.1換算成小鼠的劑量為7.55 mg/g。ND、HFD組每天灌胃等量生理鹽水Lov組每天灌胃生理鹽水0.4 mL，在實驗結束前十天，變更灌胃藥品，Lov的劑量為0.3 mg/g。小鼠每天自由攝食，每3 d對飼料和小鼠進行稱重，計算小鼠攝食量和體重變化。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣本采集

1.4.1.1 血清收集

實驗結束前小鼠禁食12 h。通過摘取小鼠眼球眼眶處取血，隨后脊椎脫臼法處死小鼠。血液收集于離心管中，40 ℃靜止3 h后，將血樣在3000 r/min，于4 ℃離心10 min，上層血清保存于-80 ℃冰箱中。

1.4.1.2 臟器收集

用棉球蘸取少許醫用酒精來擦小鼠身體，切開腹腔，分別取出小鼠肝臟、腎臟、心臟脾及附睪脂肪，觀察肝臟形態，將肝臟立即放置液氮中保存，并轉移至-80 ℃冰箱中保存用于生化指標測定。

1.4.2 指標測定

1.4.2.1 臟器指數的測定

取小鼠肝組織、腎組織、脾組織、心臟組織以及附睪脂肪組織用生理鹽水洗凈，用濾紙擦干后稱重，并且計算相關臟器指數[9]。

1.4.2.2 血脂及肝脂指標的測定

血清和肝臟中的高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三脂（Triglycerides，TG）和總膽固醇（Total cholesterol，TC）均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，具體操作步驟根據試劑盒說明書進行操作。

1.4.2.3 天冬氨酸轉氨酶（aspartate transaminase，AST）及丙氨酸轉氨酶（alanine transaminase，ALT）指標的測定

血清和肝臟中的AST及ALT測定參考南京建成生物工程研究所試劑盒說明書利用分光光度法進行測定[10]。

1.4.2.4 肝臟超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）指標的測定

用分析天平準確稱量0.20 g肝臟組織，按照重量體積比為1:9的比例加入事先準備好的PBS溶液（0.01 mol/L），利用組織勻漿機進行充分研磨，制備含量為10%的組織勻漿液，根據南京建成生物工程研究所試劑盒的操作步驟，分別測定肝臟組織勻漿中的MDA和SOD活力[11]。

1.4.2.5 小鼠肝臟及脂肪組織切片分析

用10%甲醛溶液固定肝臟及附睪脂肪組織后沖洗24 h，并用不同濃度梯度的乙醇脫水。二甲苯透明，浸蠟包埋后切片，厚度為5 μm，經HE染色后，在顯微鏡下觀察組織結構。

1.5 數據處理

試驗均重復三次，結果表示為：平均值±標準偏差。用Microsoft Excel 2016計算各個指標的平均值與標準差；測定結果用使用SPSS 26.0進行數據處理，p＜0.05為顯著性差異，p＜0.01為極顯著性差異；利用Origin 8.6進行作圖分析。

2 結果與討論

2.1 EGG及SUB對MetS小鼠攝食和體重的影響

在實驗開始初期，各組小鼠攝食量均出現降低增加交替的現象，這是由于初期灌胃小鼠產生的應急反應造成的。由圖1a可知，小鼠攝食量范圍在1.81～3.85 g之間，HFD組攝食量顯著低于ND組（p＜0.01），原因為高脂飼料為小鼠提供的能量（5.24 kcal/g）比普通飼料（3.85 kcal/g）多，進而減少小鼠的攝食量。在實驗周期后10 d后，EGG和SUB組小鼠的攝食量顯著低于HFD組（p＜0.05）。由圖1b可知，為期60 d的飼養實驗中，小鼠的體重從24.51～26.02 g增加到26.51～32.52 g，各組小鼠總體呈現穩定增長趨勢。這表明高脂飲食能夠引起小鼠體重異常增長，這與高脂誘導小鼠肥胖的研究一致[12]。同時HFD組小鼠體重的增加量顯著高于EGG等其他組小鼠體重增加量，表明EGG比SUB能更顯著抑制HFD引起小鼠體重異常增長[13]。

2.2 EGG及SUB對MetS小鼠主要臟器指數的影響

由圖2a可知，ND組小鼠心臟指數最高為0.75，Lov組最低為0.62，EGG組小鼠的心臟指數顯著高于HFD組（p＜0.05）。由圖2b可得，HFD組小鼠腎臟指數最低為1.27，EGG組和SUB組都顯著高于HFD組（p＜0.05），EGG組和SUB組的腎臟指數無顯著差異（p＞0.05），實驗說明，HFD能引起小鼠腎損傷，而EGG和SUB能顯著改善由HFD引起腎臟指數下降的結果，對高脂飲食導致的腎損傷具有一定的修護作用[14]。

脾臟是機體內重要的淋巴器官，其指數可以反映機體的免疫能力的強弱，指數越大，則表明機體的免疫能力越強[15]。由圖2c可知，EGG組顯著高于HFD組和SUB組（p＜0.05），而SUB組HFD組脾臟指數無顯著差異（p＞0.05），數據表明EGG組在一定程度上提高了小鼠的免疫系統抵抗能力，而SUB對于脾臟指數無明顯作用效果。如圖2d可得，ND組小鼠肝臟指數均顯著高于高脂各組，且高脂各組間無顯著差異（p＞0.05）。由圖2e可知，ND組小鼠附睪脂肪指數最低為0.88，HFD組最高為3.65。EGG組和SUB組顯著低于HFD組（p＜0.05），而SUB組顯著高于EGG組（p＜0.05）。這與表明，EGG攝入較SUB能更加顯著降低由HFD引起的機體附睪脂肪的積累。Yu等人[16]基于脂質組學分析長期食用蛋黃對高脂飲食小鼠的高脂血癥的影響，發現，蛋黃攝入可顯著降低肥胖小鼠腹部脂肪積累，這與本研究結果相一致。

2.3 EGG及SUB對MetS小鼠血脂及肝脂的影響

研究表明，臨床診斷中，通過血脂血清學指標的檢測有助于明確脂肪肝疾病診斷，對及早確診和接受治療，具有良好促進作用[17]，血脂中重要的指標如HDL-C、LDL-C、TC、TG與MetS等疾病的相關性已經得到證實[18]。LDL-C是膽固醇向肝外組織轉運的主要載體工具，其含量與心血管疾病的發病率及病變程度相關，被認為是動脈粥樣硬化的主要致病因子[19]。HDL-C主要是將膽固醇從肝外組織轉運到肝臟進行代謝，由膽汁排出體外，其含量的高低與動脈粥樣硬化的發生呈負相關[20]。由圖3a和3b可知，HFD組LDL-C含量最高為1.13 mmol/L，ND組最低為0.54 mmol/L。EGG組和SUB組LDL-C含量顯著低于HFD組（p＜0.05），為HFD的74.51%。同時，HFD顯著抑制了血清中HDL-C水平，而EGG能顯著改善由HFD引起的不良后果，使得血清中HDL-C上升到正常水平，而SUB對于MetS小鼠血清中HDL-C無顯著作用，這與之前的研究一致[21]。Christopher等[22]研究發現，較去蛋黃雞蛋替代物，食用全蛋可改善代謝綜合征患者脂蛋白分布，表現為增加LDL-C含量及HDL粒徑，增強血清HDL運載膽固醇的能力，這與本研究結果相一致。圖3c和3d為血清TC和TG水平，與ND組（3.80 mmol/L）相比，HFD組（6.52 mmol/L）血清中TC含量顯著升高（p＜0.05），EGG組（5.02 mmol/L）和SUB組（5.37 mmol/L）的TC含量顯著低于HFD組（p＜0.05），EGG組和SUB組無顯著差異（p＞0.05）。由圖3d可知，EGG組TG（0.64 mmol/L）含量顯著高于HFD組（0.55 mmol/L）和SUB組（0.57 mmol/L）水平（p＜0.05）。圖3e和3f為肝臟TC和TG水平，EGG和SUB均可降低肝臟中TC、TG含量，SUB肝臟TC和TG含量更低，分別為0.11 mmol/L和0.42 mmol/L。Samantha等[23]表明食用全蛋可有效抑制2型糖尿病大鼠TG濃度，與酪蛋白相比，食用全蛋飲食導致大鼠血漿TG濃度降低52%。同時，Lisa等[24]研究發現，與SUB飲食相比，食用EGG可增加超重婦女膽固醇外排能力，對膽固醇代謝具有積極作用。這表明，EGG顯著抑制血清和肝臟中TC水平，然而對血清TG并沒有產生改善作用。

2.4 各組小鼠血清及肝臟ALT和AST水平變化

由圖4a～c可知，與ND相比，HFD組血清ALT和AST水平顯著升高（p＜0.05），EGG和SUB能夠顯著降低MetS小鼠血清AST水平。盡管EGG組ALT水平較HFD增加了0.42倍，然而EGG可顯著下調AST/ALT比例。由圖4d～e可知，相比于HFD組，EGG和SUB均可顯著降低肝臟AST、ALT和AST/ALT比值，其中EGG組AST、ALT和AST/ALT比值分別為HFD組的44.99%、54.79%和81.74%。據有關研究證明，ALT以及AST作為評價肝功能的重要指標，ALT主要存在于肝細胞的細胞質中，而AST主要存在于肝細胞的線粒體中，受到細胞膜包被，正常情況下，ALT和AST不會在血液當中，然而，當肝臟組織發生破損或出現炎癥時，細胞膜的通透性就會發生改變，會引起血清中AST和ALT水平上升。AST/ALT比值上升常見于重型肝炎、肝硬化、肝癌及酒精性肝病等肝臟疾病，AST/ALT比值隨著肝臟病變的加重而逐漸升高[25]。這表明EGG和SUB對高脂飲食引起的肝臟組織破損和炎癥的發生有一定的改善作用。雞蛋蛋黃中含有豐富的卵磷脂，蛋黃中的卵磷脂具有顯著的抗氧化能力，研究表明攝入蛋黃卵磷脂可有效降低肝臟中ALT及AST水平，這解釋了相對于SUB，EGG更能緩解由于高脂飲食而引起的肝損傷[26]。

2.5 各組小鼠肝臟SOD和MDA水平變化

MetS常伴隨著肝臟脂肪過度積累。肝臟氧化應激、肝臟脂質失調和促炎細胞因子的協同作用會導致肝臟脂肪堆積，并促進MetS發生[27]。史雅凝[28]研究表明，肝臟中包含的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）等是重要的抗氧化酶，可以作為評價人體氧化還原狀態的重要指標，可作為檢測MetS疾病相關的抗氧化指標。有研究發現，高脂飲食可引起肝組織SOD使機體的抗氧化損傷的防御機制受損不能清除過多的自由基而導致肝損傷[29]。由圖5a可知，HFD組SOD酶活水平顯著高于其他組，是ND組SOD酶活水平的1.64倍（p＜0.05），EGG組和SUB組的SOD酶活水平均顯著低于HFD組（p＜0.05），分別為HFD組的75.10%和62.26%。

MDA含量是反映機體潛在抗氧化能力的重要參數，它能反映脂質過氧化速率和強度，間接反映組織過氧化損傷的程度，其含量與組織氧化程度呈正比[30]。研究發現，當肝臟組織中脂質含量過高時，會導致脂質過氧化反應加劇，使過氧化產物MDA增加，而MDA可與線粒體結合形成希夫氏堿化合物，使線粒體膜的流動性下降，干擾脂肪酸β-氧化，使脂肪在肝內積累，造成肝臟結構和功能損害[31]。由圖5b可知，與HFD組相比，EGG（0.81 nmol/mg prot）和SUB組（0.63 nmol/mg prot）MDA酶活含量水平顯著低于HFD組（2.03 nmol/mg prot）水平（p＜0.05），EGG組和SUB組組無顯著差異（p＞0.05）。這表明，EGG和SUB都能顯著抑制小鼠肝臟內過氧化，抑制機體炎癥的發生，SUB對調控肝氧化作用顯著高于EGG。相似的結果在之前研究中也報道過[24]。

2.6 各組小鼠病理學觀察

機體中的肝臟是進行脂質代謝的主要場所，MetS常常伴隨著肝臟脂質代謝系統紊亂，從而誘發肝臟脂肪過度積累，肝細胞中脂肪發生變性等肝臟疾病[32]。圖6a為各組小鼠的肝臟形態，ND組小鼠肝臟顏色鮮艷紅亮，表面有明亮光澤，質地較軟。HFD組小鼠肝臟顏色顏色呈現紅色略帶黃色，質地稍微偏硬，在肝臟的表面帶有脂肪顆粒，呈現病變狀態，表明模型構建成功，與王寧等[33]研究結果一致。EGG組、SUB組和Lov組的肝臟表面顏色呈現紅色略帶黃色，其中EGG組肝臟表面略帶光澤，并且沒有脂肪的積累，不帶有脂肪顆粒，而SUB組肝臟組織表面有輕微的脂肪顆粒，較HFD組數量較少。

觀察圖6b肝臟組織切片，發現ND組小鼠肝臟組織的表面結構完整清晰，肝細胞之間的界限清楚，細胞外形向周圍呈現放射形態，細胞核清晰位于細胞中央，沒有發現細胞炎癥或細胞壞死等現象。HFD組小鼠肝細胞具有一定程度的脂肪變性，排列結構是不規則的，細胞內出現明顯的脂滴溶解后的空泡且大小不一致。在EGG組和SUB組中，脂滴空泡的分布較少。實驗表明EGG組和SUB能夠在一定程度上抑制肝組織中脂肪的積累，并且EGG能夠顯著降低肝細胞中脂解空泡的形成。相關實驗研究表明HFD可引起的TG儲存增加會導致脂肪細胞的體積增大，脂肪細胞體積的增大是MetS主要特征[34]。觀察圖6c得知，ND組小鼠附睪脂肪細胞體積小、結構完整、形態清晰，HFD組小鼠附睪脂肪細胞與ND組相比，體積顯著增大。EGG組、SUB組小鼠脂肪細胞大小相對于HFD組明顯變小，Lov組脂肪細胞最小。實驗說明，HFD能夠引起肝臟組織中脂肪細胞增大，EGG和SUB攝 入都顯著減小了附睪脂肪細胞體積。

3 結論

本研究建立為期60 d的MetS小鼠模型，研究EGG和SUB攝入對MetS小鼠血脂以及酶水平相關指標。EGG和SUB能緩解高脂飲食所導致的脂質代謝紊亂，主要表現在降低小鼠的體重、攝食量。EGG和SUB都顯著抑制了由HFD引起的肝臟中SOD、AST、ALT以及MDA酶活上升，降低了肝臟中TC和TG的積累。相比于SUB組，EGG攝入能夠顯著降低血清TC和TG，LDL-C，同時顯著提高血清HDL-C。組織病理學顯示，與HFD組相比，EGG和SUB攝入具有減少肝臟脂肪空泡的功能，對高脂飲食引起的脂代謝紊亂有良好的預防作用。