芹菜素對慢傳輸型便秘小鼠的通便作用

蘇立杰，李國坤，陳淼煥，曾鈺鵬，韋艷祝，陳驍熠，陳靜

（1.廣州醫科大學公共衛生學院，廣東廣州 511436）（2.廣州醫科大學基礎醫學院，廣東廣州 511436）

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是一種臨床上常見的功能性便秘，以結腸動力減弱、結腸傳輸時間延長為主要特點，主要癥狀為便意消失、排便次數減少、糞便干硬、排便費力，其癥狀頑固，嚴重者可誘發心腦血管疾病、結直腸癌等并發癥，嚴重影響患者的生活質量和心理健康[1,2]。據相關報道，慢性傳輸型便秘全球發病率約為14%，其中我國發病率為3.19%～11.6%，且呈上升遞增趨勢[3]。已有的研究表明，STC發病因素眾多，其可能與胃腸動力不足、激素水平紊亂、腸道菌群失調[4]、Cajal間質細胞變化[5]、腸神經異常[6-8]、結腸粘膜水通道改變[9,10]等有關。STC現有的治療方法主要有藥物治療（緩瀉劑和促動力劑）、手術和糞便移植等，常規的藥物治療雖然短期內療效較好，但長期使用會引起藥物依賴、惰性結腸等不良反應，而手術和糞便移植在臨床上難以普遍開展，手術治療的復發率也較高[11,12]。因此，尋找安全有效的天然活性物質在治療和緩解慢傳輸型便秘具有重要的意義。

研究顯示，慢性便秘的發生與腸道菌群失調密切相關。便秘型腸易激綜合征患者糞便中的雙歧桿菌豐度水平較低[13]。Khalif等[14]研究發現成年功能性便秘的患者糞便中雙歧桿菌菌屬和乳桿菌屬細菌菌落數量顯著減少。張旭等[15]發現老年便秘患者糞便中腸道菌群的雙歧桿菌含量顯著降低。黃小明等[16]認為腸道微生物可能通過改變宿主代謝和代謝產物（包括氣體、短鏈脂肪酸和膽汁酸）而影響腸道蠕動，進而導致慢性便秘。因此，以腸道菌群為靶點干預STC是切實可行的。

芹菜素（apigenin）是天然存在的一種黃酮類化合物，已知其具有抗腫瘤、抗炎、抗疲勞、抗動脈硬化、抗氧化、抗痛風、降壓、降糖、免疫調節等多種作用[17-22]。王麗等[23]發現芹菜素能降低糖尿病小鼠血糖，并通過提高MLCK蛋白表達來改善腸動力障礙。Thaiss等[24]發現芹菜素可調節腸道菌群，進而影響減肥后的體重恢復速率。常佩亮等[25]發現腸道菌群會影響芹菜素的代謝。Hanske等[26]研究發現人體腸道微生物群對芹菜素-7-葡萄糖苷（A7G）生物利用及代謝有很大貢獻。結合已有的研究報道，芹菜素與腸動力以及腸道菌群密切相關，我們推測其可能通過調節腸道菌群進而發揮改善慢傳輸型便秘的作用。

但目前關于芹菜素對便秘及腸道菌群的研究報導較少，故本課題擬基于STC小鼠模型，探討芹菜素對STC小鼠的通便效果及其對腸道菌群的調節作用，為STC防治及相關功能食品的研發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芹菜素（HPLC≥98%），上海金穗生物科技有限公司；鹽酸洛哌丁胺膠囊，西安楊森制藥有限公司；碳粉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿拉伯膠，上海麥克林生化科技有限公司；吐溫80，天津市福晨化學試劑廠；氯化鈉，天津市大茂化學試劑廠；戊巴比妥鈉（1%），天津市大茂化學試劑廠；伊紅美藍瓊脂培養基，廣州環凱微生物科技有限公司；膽汁七葉苷瓊脂，廣州環凱微生物科技有限公司；雙歧桿菌瓊脂培養基，廣州環凱微生物科技有限公司；LBS瓊脂，廣州環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-250B微機生化培養箱，上海悅豐儀器儀表有限公司；移液槍，艾本德中國有限公司；玻璃儀器氣流烘干器，鞏義市予華儀器有限責任公司；旋渦混合儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；FE20 pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；T6773電子天平，普利賽斯科學儀器有限公司（瑞士）；ZHJH-C1106B超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；MULTISKAN GO全自動酶標儀，廣東丹利科技有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌機，日本三洋；純水機，南京貝登醫療股份有限公司；DZF-6050真空干燥，上海-恒科學儀器有限公司。

1.3 實驗動物

BALB/c小鼠，SPF級，30只，雄性，四周齡，健康狀況良好，購買于廣東省醫學實驗動物中心，合格證號：NO. 44007200049595，許可證號：SCXK(粵) 2013-0002。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠的灌胃

30只BALB/c小鼠隨機分為三組：空白組（K組）、模型組（M組）和芹菜素干預組（G組）。根據各組小鼠體重按量給藥，其中模型組和干預組給予10 mg/kg·BW的鹽酸洛哌丁胺溶液，另外干預組再同時給予200 mg/kg·BW的芹菜素溶液，空白組和模型組再給予相應的生理鹽水。灌胃14 d后觀察黑便判斷其造模和干預效果。其中，根據相關文獻報道選擇200 mg/kg·BW芹菜素劑量進行干預[27]。

1.4.2 黑便實驗

連續灌胃14 d后，將各組小鼠禁食不禁水12～16 h，再進行黑便觀察實驗。模型組和干預組小鼠使用洛哌丁胺灌胃，空白組小鼠相應的生理鹽水進行灌胃。30 min后，模型組和空白組使用生理鹽水和0.2 mL墨汁灌胃，芹菜素干預組使用200 mg/kg芹菜素和0.2 mL墨汁灌胃，分別放入準備好的小隔間，進行黑便觀察實驗。通過對黑便粒數、墨汁灌胃時間和首顆黑便排出的時間的記錄，統計出首顆黑便時間和黑便粒數。

1.4.3 糞便含水率的測定

使用隔板將老鼠隔離開，用鑷子收集小鼠糞便于滅菌過的2 mL EP管中，做好標記。使用分析天平稱量新鮮糞便重量，置于37 ℃的烘箱中，在24 h、48 h后稱量烘干后的糞便重量，通過計算，得出糞便的含水量。

1.4.4 墨汁推進率的測量

重復1.4.1灌胃操作25 min后，立即使用腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉（1%），待麻醉后，摘眼球取血，處死，開腹取小腸測量小腸長度和墨汁推進長度，計算得出小鼠墨汁推進率。計算公式如下：

1.4.5 新鮮糞便的采集及處理

1.4.5.1 糞便采集

對小鼠肛門附近進行充分消毒后，使用無菌棉棒輕微擦拭小鼠肛門，刺激小鼠排便，并收集糞便于已知質量（b）的2 mL EP管中，蓋緊備用。稱量帶有小鼠糞便的EP管，質量為a，計算得小鼠糞便重量為m，單位為g，其計算公式如下：

1.4.5.2 糞便稀釋液的制備

對手部充分消毒后，在超凈工作臺上，使用移液槍向裝有糞便的EP管中加入99倍糞便重量的生理鹽水，攪拌搗碎，待充分混合后，再吸取1 mL糞便混合液于10 mL的無菌試管中，加入9 mL無菌生理鹽水，制成濃度為10-3的糞便稀釋液。重復以上方法分別制備濃度為10-4、10-5、10-6的糞便稀釋液，做好標記后備用。

1.4.6 腸道細菌的體外培養鑒定與計數

1.4.6.1 培養基的配制

伊紅美藍瓊脂培養基（EMB）：稱取37.5 g培養基配方粉末，加入蒸餾水或去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，120 ℃高壓滅菌15 min，冷至50 ℃傾注滅菌培養皿。

膽汁七葉苷瓊脂培養基（BEA）：稱取44.5 g培養基配方粉末，加入1 L蒸餾水或去離子水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，120 ℃高壓滅菌15 min，備用。

雙歧桿菌瓊脂培養基（BBL）：稱取59.3 g培養基配方粉末，加入蒸餾水或去離子水600 mL和西紅柿浸出液400 mL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，120 ℃高壓滅菌15 min。（西紅柿浸出液制備：將新鮮西紅柿洗凈后稱量切碎，加入等量的蒸餾水在100 ℃水浴中加熱，攪拌90 min，然后用紗布過濾，校正pH至7.0）

乳桿菌選擇性培養基（LBS）：稱取84.0 g培養基配方粉末，再吸取1 mL吐溫80和冰乙酸1.3 mL，加熱攪拌溶解于1000 mL蒸餾水中，120 ℃高壓滅菌15 min。

1.4.6.2 生化鑒定

觸酶試驗：取潔凈玻片1片，用接種環挑取細菌，加入3%過氧化氫1滴，立即觀察結果。若立即出現大量氣泡則為陽性，否則為陰性。

氧化酶試驗：直接往待測菌菌落上滴加1%鹽酸四甲基對苯二胺。若細菌在與試劑接觸10 s內呈深紫色，為陽性。

硝酸鹽還原試驗：將待測菌接種于硝酸鹽培養基中，于35 ℃培養1～4 d，將甲、乙液等量混合后（約0.1 mL）加入培養基中，立即觀察結果。若培養基出現紅色則為陽性，否則為陰性（或假陰性）。

高鹽耐受試驗：將待測菌接種于6.5%氯化鈉葡萄糖瓊脂培養基的平板中，使用涂布棒涂勻，后置于37 ℃恒溫箱內培養。24～48 h后，觀察平板上是否有細菌生長。

45 ℃生長試驗：將待測菌接種至腸球菌選擇培養基中，使用涂布棒涂布均勻，后置于45 ℃下恒溫箱內培養。24～48 h后，觀察平板上是否有細菌生長。

氧氣生長試驗：將待測菌接種至雙歧桿菌選擇培養基中，用涂布棒涂布均勻，后置于37 ℃恒溫箱內培養。24～48 h后，觀察平板是否有細菌生長。

1.4.6.3 菌落計數（腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌）

分別取以上一系列濃度（10-3、10-4、10-5、10-6）的糞便稀釋液100 μL于四種不同培養基中，均勻涂布后，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24～48 h（雙歧桿菌、乳桿菌的培養需使用厭氧培養袋）。每種菌種做三個平行，選取菌落總數在30～300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板進行計數菌落總數取平均數。

1.5 數據處理與統計分析

所有數據均獨立平行測定，數據結果以平均值±標準差的形式表示，采用SPSS 24.0軟件對試驗數據進行統計學分析，通過獨立樣本t檢驗和單因素方差檢驗做顯著性分析，p＜0.05為有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 小鼠STC模型的建立

將空白組與模型組的排便指標進行對比，如表1和圖1所示，可得模型組的首粒黑便時間（188.70 min）相對于空白組（74.60 min）增加了1.53倍（p＜0.05）；6 h排便粒數（10.40 n）相對于空白組（18.80 n）減少了45%（p＜0.05）；糞便重量（0.42 g）相對于空白組（0.91 g）減少了53.85%（p＜0.05）；墨汁推進率43.99%相對于空白組（78.63%）減少了44.05%（p＜0.05）。判斷慢性傳輸型便秘小鼠模型建立成功與否的標準包括首粒黑便時間、6 h排便粒數、糞便重量、墨汁推進率。通過觀察，小鼠6 h排便粒數和糞便重量任一結果陽性，并且首粒黑便時間和墨汁推進率任一結果陽性，即可判定STC模型成功建立[28,29]。根據實驗結果，首粒黑便時間、6 h排便粒數、糞便重量、墨汁推進率均呈陽性，可說明小鼠STC模型建立成功。本實驗使用10 mg/kg·BW的鹽酸洛哌丁胺溶液灌胃14 d可成功建立小鼠STC模型，與相關文獻的STC模型研究建立方法一致[30-32]。

表1 洛哌丁胺對小鼠排便指標的影響 Table 1 Effect of loperamide on defecation indexes of mice

2.2 芹菜素對小鼠首次黑便時間、6 h排便粒數、糞便重量、墨汁推進率的影響

將干預組與模型組的排便指標進行對比，如表2和圖1所示，得干預組的首粒黑便時間（141.80 min）相對于模型組（188.70 min）減少了24.85%（p＜0.05）；6 h排便粒數（19.30 n）相對于模型組（10.40 n）增加了0.86倍（p＜0.05）；糞便重量（0.93 g）相對于模型組（0.42 g）增加了1.21倍（p＜0.05）；墨汁推進率（90.61%）相對于模型組（43.99%）增加了1.05倍（p＜0.05）。根據保健食品的通便功能檢驗方法：6 h排便粒數和糞便重量任一項結果顯著，同時墨汁推進率和首粒黑便時間任一項結果顯著，可判定該受試樣品對便秘小鼠具有通便功效[33]，而在本次實驗中，首粒黑便時間、6 h排便粒數、糞便重量、墨汁推進率均呈陽性，可判定200 mg/kg·BW芹菜素對STC小鼠具有顯著的通便作用。

表2 芹菜素對小鼠排便指標的影響 Table 2 Effect of apigenin on defecation indexes of mice

2.3 芹菜素對STC小鼠糞便含水率的影響

將空白組和干預組的糞便含水率與模型組進行對比，如表3所示，可得模型組的糞便含水率（39.45%）相較于空白組（62.37%）減少了36.75%（p＜0.05），干預組的糞便含水率（72.15%）相較于模型組（39.45%）增加了0.82倍（p＜0.05）?？傻贸雎暹叨“吩诮⑿∈骃TC模型可顯著地降低糞便含水率，而芹菜素可增加STC小鼠的糞便含水率。

表3 芹菜素對小鼠糞便含水率的影響 Table 3 Influence of apigenin on various defecation indexes in mice

上述結果表明芹菜素具有潤腸通便作用。相關研究報道發現一些富含黃酮類物質成分的天然產物也有通便的效果。付山等[34]通過檢測便秘小鼠的小腸推進率，發現桑葚果汁具有通便作用，并證明其通便作用與總黃酮類成分有關；研究發現[35]沙蔥中的黃酮類物質成分對洛哌丁胺誘導的便秘有通便作用，可以通過影響腸動力和腸道水分轉運來達到通便的效果。因此，同屬于黃酮化合物的芹菜素，也可能通過影響腸道蠕動和水分轉運來發揮通便作用。

2.4 芹菜素對STC小鼠腸道菌群的調節作用

2.4.1 試驗菌生化鑒定

取各組小鼠糞便，用生理鹽水稀釋后，分別接種在EMB、BEA、BBL、LBS培養基上，放37 ℃恒溫箱培養24～48 h，通過對所培養的試驗菌進行生化鑒定，確保菌群為研究所需的試驗菌，其菌落形態和生化鑒定結果如表4和圖2所示，腸桿菌、腸球菌、乳桿菌和雙歧桿菌菌落形態的生化鑒定結果均符合《伯杰氏系統細菌學手冊》第九版的相關規定，可用作以下小鼠腸道細菌菌落總數計數使用。

表4 試驗菌菌落形態和生化鑒定結果 Table 4 Colony morphology and biochemical identification results of the test bacteria

2.4.2 菌落計數

如表5所示，模型組的腸桿菌菌落總數（7.1×106）顯著多于空白組（2.6×106），而干預組的菌落總數（2.9×106）相對于模型組顯著降低（p＜0.05）。模型組的腸球菌菌落總數（5.4×106）相對于空白組（1.2×106）顯著增加，而干預組的菌落總數（1.9×106）（p＜0.05）有顯著下降。模型組的雙歧桿菌菌落總數（2.4×107）顯著少于空白組（6.9×107），而干預組（4.6×107）則顯著增加雙歧桿菌菌落總數（p＜0.05）。模型組的乳酸桿菌菌落總數（2.1×107）顯著少于空白組（8.4×107），而干預組可顯著增加乳酸桿菌菌落總數（6.7×107）（p＜0.05）。上述結果表明STC小鼠糞便有害菌腸桿菌、腸球菌顯著增加，芹菜素的干預可有效地抑制腸桿菌、腸球菌的過度生長；另一方面，STC小鼠糞便中有益菌雙歧桿菌、乳酸桿菌顯著減少，芹菜素干預可有效地扶植雙歧桿菌、乳酸桿菌的增殖。

表5 芹菜素對腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌的影響(CFU/g) Table 5 Effects of apigenin on Enterobacterium, Enterococcus, Bifidobacterium and Lactobacillus (CFU/g)

根據相關文獻報道，可以選擇益生菌中的雙歧桿菌和乳桿菌，及有害菌中的腸桿菌和腸球菌為試驗菌進行體外培養，來評價對腸道菌群的影響。如李根林等[36]通過對STC模型老鼠新鮮糞便中的腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌進行培養和計數，研究復方地芬諾酯建立的STC模型老鼠中腸道菌群的變化情況。彭禛菲等[37]通過對腸桿菌、腸球菌、乳桿菌和雙歧桿菌進行培養和計數，發現野山杏果肉不溶性膳食纖維具有改善小鼠腸道菌群和通便的作用。因此，本課題選取雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌和腸球菌作為試驗菌對象來評價芹菜素對腸道微生物的調節作用。本研究結果發現芹菜素干預可有效地抑制腸桿菌、腸球菌的過度生長，以及有效地扶植雙歧桿菌、乳酸桿菌的增殖。相關研究報道也發現類似結果。如魏濤等[38]以復方地芬諾酯建立小鼠便秘模型，連續給予低聚木糖干預14 d后，低、高劑量組小鼠糞便內乳桿菌、雙歧桿菌均顯著增加，從而證明了低聚木糖具有改善小鼠腸道菌群及潤腸通便的功能。唐飛等[39]發現適度的青磚茶可以抑制腸桿菌、腸球菌繁殖，扶植雙歧桿菌和乳桿菌，從而改善小鼠腸道功能。腸球菌是一種條件性致病菌，可導致院內感染和抗生素耐藥。研究報道通過體外模擬人升結腸的糞便接種物培養，發現芹菜素有效地抑制了腸球菌的生長，并影響腸球菌中涉及DNA修復、應激反應等基因的表達[40]。雙歧桿菌和乳桿菌是常見的益生菌。研究報道富含雙歧桿菌和乳桿菌的酸奶可以抑制洛哌丁胺誘導的便秘[41]。雙歧桿菌可增加腸動力，可能與其促進短鏈脂肪酸（SCFAs）的產生相關[42]。研究報道給予便秘小鼠乳桿菌處理，可增加糞便含水量從而達到通便效果[43]。因此，推測芹菜素的通便作用可能與促進雙歧桿菌和乳桿菌的生長，從而增加腸動力和糞便含水量相關。當然，本研究僅能表明芹菜素對四種試驗菌的調節作用，還應用16s rRNA測序等技術對便秘小鼠腸道菌群中的其他微生物種群、豐度進行分析，進一步探究芹菜素調節腸道菌群改善便秘的作用機制。

3 結論

芹菜素可通過減少首粒黑便時間，增加排便粒數和重量，促進腸蠕動和增加糞便含水量，對慢傳輸型便秘小鼠起到通便的作用。芹菜素可能通過抑制有害菌腸球菌和腸桿菌的過度生長，以及扶植有益菌雙歧桿菌和乳桿菌的生長，改善腸道微生態環境，增加腸動力和糞便含水量，從而達到通便的效果。