厭氧水環境中噬菌體MS2的存活和團聚特性及理化因素的影響

張崇淼,趙 倩,王 真

厭氧水環境中噬菌體MS2的存活和團聚特性及理化因素的影響

張崇淼*,趙 倩,王 真

(西安建筑科技大學環境與市政工程學院,陜西省環境工程重點實驗室,西北水資源與環境生態教育部重點實驗室,陜西 西安 710055)

為探究病毒在厭氧水環境中的存活特性,以噬菌體MS2為模式病毒,采用雙層平板法進行噬菌體MS2的定量檢測,研究溫度、pH值、懸浮顆粒物、乙酸等理化條件對噬菌體MS2的影響,分析其衰減動力學特征,并通過測定Zeta電位和噬菌斑直徑考察噬菌體顆粒在不同條件下的聚集狀況.結果表明,在厭氧水環境中,噬菌體MS2的衰減符合一階指數衰減模型.在眾多研究因素中,溫度是影響噬菌體MS2存活的最主要因素.噬菌體MS2在4,17,25和35℃時的90分別為20.36,6.14,5.15和0.46d.35℃條件下12h后噬菌體失活率高達2.44lg,而4℃條件下7d后噬菌體失活率僅有0.78lg.增加乙酸濃度能明顯提高噬菌體MS2的衰減速率.低pH值和懸浮顆粒物條件會促進噬菌體的團聚,使噬菌體顆粒Zeta電位降低,水力學直徑增大,但懸浮顆粒物濃度過高會影響顆粒間的靜電作用. 噬菌體的團聚也增加了噬菌斑的直徑,pH=6和20mg/L的懸浮顆粒物條件下,直徑1.0mm以上的大噬菌斑數量占比分別達到了45.61%和57.74%.明確厭氧水環境中各種理化因素對噬菌體MS2的影響,可為水環境病毒控制提供科學依據.

厭氧水環境；噬菌體MS2；理化因素；存活；團聚

病毒在自然界分布廣泛,水環境是其傳播的一種重要途徑,目前已知有700余種病毒可介水傳播[1],包括腸道病毒[2]、諾如病毒[3]、冠狀病毒[4]、腺病毒[5]等.病毒在各種水環境中均有檢出,如廢水[3]、再生水[5]、地下水[6]、河水[7]、海水[8]、景觀用水[9]等,特別是城市污水管網、污水處理系統中通常存在大量的、種類繁多的病毒,其中也包括新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)[4].當人體接觸受病毒污染的水體,會導致胃腸炎、腹瀉、肝炎等疾病的發生,嚴重威脅著人類健康.

病毒在水環境中的傳播潛力主要取決于其在水環境中的存活能力[10].因此,闡明病毒在水環境中的存活特性對于病毒風險評估和控制十分重要.對于水環境中病毒的存活,國外學者做了一些研究,主要包括病毒在不同水環境中的衰減[6-7,11]、病毒存活時間和影響因素[7].目前國內有關于病毒存活的研究報道很少.現有的病毒存活研究大都集中在有氧水環境,而在城市污水管網和湖庫底部等一些區域,往往處于厭氧狀態,厭氧處理在城市污水、養殖廢水的處理中也是十分重要的環節,但迄今為止鮮有關于病毒在厭氧水環境中環境行為的報道,厭氧環境下病毒的存活特性及影響因素亟待闡明.

鑒于此,本文以大腸桿菌噬菌體MS2作為模式病毒,研究厭氧條件下水溫、pH值、懸浮顆粒物、乙酸等理化因素對噬菌體MS2存活特性的影響.通過研究噬菌體MS2的數量變化、衰減特性以及不同環境因素下噬菌體MS2的行為特征,以期為水環境中病毒的風險控制提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 噬菌體及其培養方法

噬菌體MS2及其宿主菌(大腸桿菌BW39773)均購自國家典型培養物保藏中心.將大腸桿菌BW39773培養至對數期,按照感染復數為1:1的比例將噬菌體MS2與宿主菌混勻,靜置15min, 10000r/min離心10min,沉淀用5mL LB培養液重懸,37℃搖床培養5h后10000r/min離心10min,取上清液經0.22μm孔徑的濾膜過濾后獲得噬菌體MS2懸液,置于4℃保存備用.

1.2 厭氧水環境中噬菌體MS2的存活實驗

將純水置于具塞玻璃瓶中,使用水浴氮吹儀以5L/min的速率進行氮吹5min,使水樣中的溶解氧低于0.09mg/L.使用注射器將噬菌體MS2懸液注入水樣中,使其終濃度為(3391.90±526.45)×103PFU/mL.使用恒溫箱控制水樣溫度分別為4,17,25,35℃,使用0.1mol/L HCl或NaOH溶液調節水樣的pH值(pH=6、7、8、9),加入高嶺土模擬水中的懸浮顆粒物(終濃度分別為0,10,20,50mg/L),加入2mol/L乙酸使水樣中的乙酸濃度分別為0,200,400,800mg/L.采用單一變量原則,分別研究溫度、pH值、顆粒物對噬菌體MS2存活的影響.除研究的變量之外,其他因素都保持在同一控制水平(溫度25℃、pH=7、無懸浮顆粒物).研究乙酸對噬菌體MS2的影響時,控制溫度為25℃,且無懸浮顆粒物存在.在上述不同條件下,連續測定水樣中的噬菌體MS2含量.按照式(1)計算噬菌體MS2的失活率:

= lg(0/N) (1)

式中:為失活率;0為水樣中噬菌體MS2初始濃度, PFU/mL;N為時刻水樣中噬菌體MS2的濃度,PFU/mL.

圖1 厭氧水環境構建示意

1.3 噬菌體的雙層平板法定量檢測

噬菌體的檢測參照ISO10705-1-1995[12]和EPA1602[13]標準方法進行.將含有噬菌體MS2的樣品100μL與宿主菌懸液100μL混合均勻,再加入到3mL 0.45%瓊脂(55℃)的玻璃管中混勻,快速傾倒至1.5%的瓊脂平板表面.待上層瓊脂凝固后,在37℃培養箱中倒置培養12h.菌落計數儀(Czone G6T,杭州迅數科技有限公司)拍照和測量噬菌斑.對噬菌斑在20～300的平板進行計數.

1.4 噬菌體MS2的衰減動力學分析

分別使用指數模型[14]和Fermi模型[15]對水樣中噬菌體MS2的濃度隨時間變化的數據進行擬合.

指數模型是一種典型的線性模型,如式(2)所示:

Fermi模型是一種非線性模型,如式(3)所示:

式中:N為時刻水樣中噬菌體MS2的濃度, PFU/ mL;0為0時刻水樣中噬菌體MS2的濃度, PFU/ mL;為指數模型中的衰減速率常數;1、2為Fermi模型中的衰減速率常數,表示噬菌體MS2在水樣中的衰減速率;為時間.

90、99分別表示噬菌體MS2初始數量減少90%(1lg), 99%(2lg)所需要的時間(d)[7].利用最優的動力學模型,可計算出90、99值.

1.5 顆粒的水力學直徑和Zeta電位的測定

采用Zeta電位儀(Zetasizer Nano ZS 90,馬爾文儀器有限公司)測定噬菌體MS2顆粒、高嶺土顆粒和高嶺土吸附噬菌體MS2后形成的顆粒的水力學直徑及Zeta電位.選擇pH值、懸浮顆粒物濃度分別作為研究變量,控制噬菌體MS2的濃度為103PFU/mL,溫度為25℃,平行測定3次.

1.6 數據處理與分析

使用ImageJ圖像分析軟件對噬菌斑進行直徑測量,計算噬菌斑直徑分布.所有實驗數據均采用Excel 2019軟件進行處理與分析,使用Origin 2018軟件作圖,并通過SPSS 26.0軟件進行數據的方差分析和正態性檢驗分析.

2 結果與討論

2.1 厭氧水環境中理化因素對噬菌體活性的影響

在無宿主菌存在的厭氧水環境中,噬菌體MS2的濃度會隨時間延長而逐漸降低,直至低于檢出限(圖2).隨著溫度的升高,噬菌體MS2的衰減加快.在4℃時,7d后噬菌體濃度仍有5.73×102PFU/mL,相比初始濃度僅下降了0.78lg;而在35℃時,僅12h噬菌體濃度就下降了2.44lg,24h后則未檢出.高溫會對病毒衣殼蛋白和核酸造成破壞,還可以提高胞外蛋白酶和核酸酶的活性,從而引起病毒的失活[16].本研究的水樣中并無大量細菌,也不存在胞外蛋白酶和核酸酶,因此溫度升高導致噬菌體MS2失活加速主要是通過破壞噬菌體衣殼蛋白和核酸來實現的.

自然水環境及水處理過程中的pH值大都在6～9.在此范圍內,pH值對噬菌體MS2存活并未造成明顯的影響,各條件下4d后噬菌體MS2濃度的失活率都在2.83～3.49lg范圍內,無顯著差異(>0.05).水中懸浮物含量是衡量水污染程度的指標之一.在沒有高嶺土存在的條件下,噬菌體MS2的濃度在5d內降低了2.15lg,而高嶺土濃度為10,20,50mg/L時,失活率分別為2.27,2.51,2.63lg.通過方差分析發現,不同懸浮顆粒物濃度條件下的噬菌體MS2的失活率并無顯著差異(>0.05).這說明在厭氧水環境中無機懸浮顆粒物的存在不影響噬菌體的存活,何強等[17]在研究好氧水環境中高嶺土對噬菌體MS2的影響時也有類似的結果.

從圖2(d)可以看出,隨著體系中乙酸濃度的升高,噬菌體MS2的衰減加快.當乙酸濃度增加到800mg/L時,36h后噬菌體的濃度下降2.83lg,而無乙酸體系中的噬菌體MS2失活率僅為0.80lg.乙酸是厭氧生物處理中產生的一種典型小分子有機酸,這種有機酸通常被認為是天然抗菌劑,且具有滅活病原體的能力[18],可作用于細胞壁、細胞質膜,影響細胞質中與核酸復制、蛋白質合成等相關代謝功能[19-20].

2.2 不同條件下的噬菌體MS2衰減動力學

圖3為分別利用指數模型和Fermi模型對噬菌體MS2在不同情況下濃度衰減的擬合曲線.擬合曲線與實驗數據的接近程度用可決系數2來表示,2越大,曲線擬合程度越高.由此可見,使用指數模型描述噬菌體MS2的衰減動力學特征更合適.

使用指數模型計算得到在不同條件下的噬菌體MS2衰減速率常數k、以及90和99值,以定量描述其衰減特征.如表1所示,噬菌體MS2在4,17,25和35℃時的90值分別為20.36,6.14,5.15和0.46d, 35℃時的90值僅為4℃時的2.26%.在實際水環境中,溫度的升高還可能提高其他微生物的活性,從而間接促進噬菌體MS2的衰減.例如,Gordon等[21]研究發現,在地下水樣品中,噬菌體MS2在15℃和28℃條件下的90值都不足3d,而在經過濾去除了微生物的地下水樣品中,噬菌體MS2在這兩個溫度下的90值則均大于180d.

從表1可以看出, pH值、懸浮顆粒物濃度在一定范圍內的改變并未對噬菌體MS2的衰減產生明顯影響.與溫度、懸浮顆粒物濃度、乙酸濃度這些單因素控制實驗中同樣條件的結果相比,在pH單因素控制實驗中pH=7時噬菌體MS2的90和99值偏低.這可能與調節pH過程中生成了NaCl有關,有報道表明較高的鹽度會降低病毒的存活率[10].乙酸會明顯加速噬菌體MS2的衰減速率.在厭氧水處理體系中,乙酸濃度通常為50～800mg/L[22-23].根據本研究的衰減動力學特征來看,這種濃度范圍的乙酸可能會使噬菌體MS2的衰減速率加快2.54～3.52倍.

表1 不同條件下的噬菌體MS2衰減的k、T90和T99值

2.3 噬菌體顆粒的團聚性及影響因素

病毒顆粒的表面電荷與所處環境的pH值有關,改變pH值可以使病毒顆粒表面電荷以及病毒顆粒之間的靜電作用發生變化,從而影響病毒顆粒在水環境中的穩定性[24].水中懸浮顆粒物能影響病毒顆粒表面電荷和親疏水性,從而影響病毒在水環境中的狀態[25].因此,本文對噬菌體MS2在厭氧水環境中的行為特征也進行了研究.

2.3.1 pH值和懸浮顆粒物對顆粒Zeta電位及水力學直徑的影響 噬菌體MS2顆粒的等電點在2.2～3.9[26],因此在pH 6～9的水環境中,噬菌體顆粒表面都帶負電.在pH=6、7、8、9時,噬菌體顆粒的Zeta電位分別為-13.68,-22.49,-25,-32.80mV(圖4).其中,pH=6與pH=9時的Zeta電位存在顯著性差異(<0.05).根據雙電層理論,Zeta電位能反映膠體顆粒的穩定性,其絕對值越大,表明擴散層越厚,膠體顆粒越穩定[27].反之,膠體顆粒則易脫穩.顯然,偏酸性的環境更接近噬菌體MS2的等電點,Zeta電位絕對值更小,噬菌體顆粒更易脫穩團聚.噬菌體顆粒的水力學直徑分布可以更直觀地顯示出pH值對噬菌體MS2團聚的影響.當pH=6時,噬菌體顆粒的水力學平均直徑為535nm,遠大于pH=7、8、9條件下的(256.83,123.30,85.97nm).

高嶺土在水溶液中帶負電,不同濃度高嶺土條件下的Zeta電位約為-20～-30mV,加入噬菌體MS2后,Zeta電位絕對值有所減小,說明高嶺土和噬菌體MS2發生了相互作用.但顆粒的Zeta電位絕對值仍維持在20mV以上,這表明噬菌體能夠吸附在高嶺土顆粒上,并穩定存在于水中.這種情況與不同類型礦物顆粒的作用結果類似.例如,閔凡飛等[28]研究石英與高嶺土懸濁液顆粒表面電位時發現,它們混合后形成的懸濁液的顆粒表面Zeta電位絕對值小于這兩種單一礦物顆粒的,這歸因于混合礦物顆粒間發生了聚集作用.

如圖4所示,在噬菌體MS2濃度為103PFU/mL時,噬菌體顆粒的水力學直徑為25.43nm.當體系中含有濃度為10,20,50mg/L的高嶺土時,顆粒的水力學平均直徑增至1730.67,2354.60和2785.43nm;而無噬菌體存在時,對應濃度的高嶺土懸濁液中的顆粒水力學平均直徑分別為1581,1485.67和1127.2nm.對照可以看出,高嶺土會吸附噬菌體從而形成較大的顆粒.隨著高嶺土濃度的增加,顆粒物逐漸增大并最終趨于穩定.高嶺土主要由SiO2組成,還有少量的無機氧化物[29].高嶺土分散于水中,顆粒內部夾雜的一些鹽類易溶解到溶液中,電離出的Ca2+,Mg2+等陽離子附著在高嶺土表面[28-29],當帶有負電的噬菌體顆粒與高嶺土顆?？拷鼤r,高嶺土表面的陽離子從表面解離,增強了懸濁液的離子強度,通過壓縮雙電層發生聚集作用,從而使顆粒的水力學直徑增大[30].

圖4 不同pH值和懸浮顆粒物條件下噬菌體MS2的Zeta電位及水力學直徑分布

2.3.2 噬菌斑的直徑分布及影響因素 以大腸桿菌BW39773作為宿主菌,噬菌體MS2在雙層平板上產生的噬菌斑的直徑通常在0.5～1.0mm范圍內.通過K-S檢驗,在本研究中不同條件下形成的噬菌斑直徑分布均服從正態分布(>0.05).從圖5可以看出,pH值對噬菌斑直徑分布產生了一定的影響.當pH=6、7、8、9時,直徑1.0mm以上的大噬菌斑在全部噬菌斑中所占的比例分別為45.61%、36.51%、29.67%、24.57%.特別是在pH=6時,還出現了直徑為1.6～1.8mm的超大噬菌斑.

影響噬菌斑外觀的因素包括:宿主菌細胞濃度、瓊脂層組成、病毒株等[31].在確定的雙層平板法檢測體系條件下,初始侵染宿主菌的噬菌體的聚集行為就是影響噬菌斑最主要的因素[32].通常情況下,一個噬菌斑是由宿主菌受到單個噬菌體的初始侵染所形成的[32].但如果多個噬菌體顆粒聚集在一起,共同侵染同一個宿主菌,這樣就會使噬菌斑直徑增大.由上述實驗結果可知,在偏酸性的環境中,噬菌體MS2容易發生團聚,從而形成較大的噬菌斑.

懸浮顆粒物會吸附多個噬菌體顆粒,并作為一種載體使多個噬菌體同時侵染宿主菌細胞[29].因此,增加水中的懸浮顆粒物濃度也會使形成的噬菌斑直徑增大,但該變化趨勢并非始終存在.當高嶺土濃度為10,20,50mg/L時,直徑1.0mm以上的大噬菌斑占比分別為46.74%、57.74%、47.68%.高嶺土濃度為20mg/L時,大噬菌斑和超大噬菌斑的占比都高于50mg/L時(圖6).這表明過高的懸浮顆粒物濃度可能會增加同種電荷粒子之間的相互排斥,干擾噬菌體在顆粒物表面的吸附.在目前的研究中,通常認為噬菌斑僅能提供噬菌體的“數量”信息,其能否在噬菌體環境行為的研究中發揮更大的作用尚有待研究.本研究結果表明了噬菌斑的直徑分布能在一定程度上反映噬菌體MS2在不同環境下的行為.

圖5 不同pH值和懸浮顆粒物條件下噬菌體MS2的的噬菌斑直徑分布

3 結論

3.1 在無宿主菌存在的厭氧水環境中,噬菌體MS2的數量會逐漸衰減,其衰減過程符合指數模型.溫度是影響其衰減的最重要因素,35℃條件下,其濃度減少2.48lg僅用了12h,24h后已低于檢出限.提高乙酸濃度都會顯著加速噬菌體MS2的衰減.噬菌體MS2的.

3.2 噬菌體MS2顆粒在偏酸性的環境中容易發生團聚,其Zeta電位絕對值降低,水力學平均直徑增大.水中的高嶺土會吸附噬菌體MS2形成較大的顆粒.隨著高嶺土濃度升高,顆粒的水力學直徑會逐漸增大,并最終趨于穩定.

3.3 噬菌斑的直徑分布也能體現出pH值和懸浮顆粒物對噬菌體MS2的影響.在偏酸性和懸浮顆粒物濃度較高的條件下,直徑1.0mm以上的大噬菌斑數量占比較高.這一發現有助于挖掘噬菌斑分析在噬菌體環境行為研究中的潛力.

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ZHANG Chong-miao*, ZHAO Qian, WANG Zhen

(Key Laboratory of Northwest Water Resource, Environment and Ecology, Ministry of Education, Shaanxi Key Laboratory of Environmental Engineering, School of Environmental and Municipal Engineering, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China)., 2022,42(7)：3434～3442

Bacteriophage MS2 was chosen as the model virus to reveal the survival characteristics of virus in anaerobic water environment. The effect of physicochemical conditions, including temperature, pH, suspended particles, and acetic acid on bacteriophage MS2 were studied by double-layer plate method.The decay kinetics of bacteriophage MS2 were analyzed, and the aggregation of phage particles under different conditions was investigated by measuring Zeta potential and plaque diameter.The results showed that the decay of bacteriophage MS2 in anaerobic water environment followed the first-order exponential decay model. Among the above-mentioned factors, temperature was the most important factor affecting the survival of bacteriophage MS2. At 4℃, 17℃, 25℃ and 35℃, the T90values of bacteriophage MS2 were 20.36d, 6.14d, 5.15d and 0.46d, respectively.The inactivation rate of bacteriophage MS2 was as high as 2.44lg after 12h at 35°C, while the inactivation rate was only 0.78lg after 7days at 4°C. Increasing the concentration of acetic acid significantly enhanced the inactivation rate of bacteriophage MS2. Low pH value and suspended particles promoted the aggregation ofbacteriophage MS2, which caused Zeta potential decrease and the hydrodynamic diameter of phage particles increase, but excessively high concentrations of suspended particles affected the electrostatic interaction between particles.The aggregation of bacteriophage MS2 also increased the diameter of plaques. Under the condition of pH 6 and suspended particles at 20mg/L, the proportion of large plaques with diameter more than 1.0mm reached 45.61% and 57.74%, respectively.Clarification of the impact of various physicochemical factors on bacteriophage MS2 in anaerobic water environment can provide scientific basis for virus control in water environment.

anaerobic water environment；bacteriophage MS2；physicochemical factors；survival；aggregation

X172

A

1000-6923(2022)07-3434-09

張崇淼(1978-),男,河南鄭州人,教授,研究方向為水環境微生物風險評價與控制,污水處理與資源化.發表論文80余篇.

2021-12-09

國家重點研發計劃(2017YFE0127300);陜西省重點研發計劃項目(2020ZDLNY06-07)

* 責任作者, 教授, cmzhang@xauat.edu.cn