新型酚類化合物DFTP對結腸癌SW480細胞生物學表型的影響及其機制*

劉驁駿 孫鑫怡 郝校鵬 范慧霞 夏 勇 △

(1 濟寧醫學院基礎醫學院；2 濟寧醫學院精準醫學研究院，濟寧 272067)

結直腸癌是人類高發惡性腫瘤,其發病率一直呈上升趨勢,在全球惡性腫瘤發病率中已上升至第三位,其死亡率居惡性腫瘤死因的第二位。在我國,結直腸癌死亡率已位于惡性腫瘤死亡率的第五位,嚴重危害人類健康，對家庭和社會造成巨大的經濟負擔[1]。結腸癌治療方法目前仍然以手術為主，化療是一個主要的治療方法，包括靶向藥物治療，還有新興的免疫方法。但目前的方法仍存在術后復發，不良反應強烈等弊端。因此，急需開發高效、低副作用的新型結腸癌療法。近幾年抗癌藥物研究顯示，酚類化合物是具有抗癌價值的單體藥物研究領域中的熱門主題。迄今人們已經發現或合成一系列具有抗癌活性的酚類化合物，如兒茶酚衍生物、多酚衍生物、鶴草酚等。兒茶酚可以通過誘導細胞周期停滯和細胞凋亡來抑制胰腺癌的活性，并可調節胰腺癌細胞中的AMPK / Hippo信號通路[2]。在前期研究中，我們從實驗室合成酚類單體化合物2,4-dibromo-3-fluoro-6-(3-(trifluoromethyl) isoxazol-5-yl) phenol(DFTP)并發現其對結腸癌有明顯抑制作用。本論文中，我們用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，用倒置顯微鏡監測其形態學的變化，用細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，用EdU熒光染色試劑盒檢測DNA復制速率，用克隆形成實驗檢測細胞的克隆形成能力，用流式細胞儀檢測細胞周期，用Calcein AM熒光染色法檢測活/死細胞，用Annix-V-FITC染色檢測細胞凋亡，從多角度闡述了DFTP對結腸癌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

單體化合物DFTP來自中南民族大學藥學院；結腸癌細胞系SW480、膠質瘤細胞系U251、肺癌細胞系A549購自北納生物(中國，河南，BNCC)；胰蛋白酶(北京，沃卡威生物技術有限公司)，結晶紫染色試劑盒(江蘇，凱基生物)，BSA(北京，索萊寶科技有限公司)，TritonX-100(北京索萊寶科技有限公司)；RNA酶、碘化丙啶、Hoechst 33342染色液、EdU細胞增殖檢測試劑盒、4%多聚甲醛固定液、CCK-8細胞活性試劑盒、CCK-F試劑盒、V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。DMEM培養基(以色列，BI公司)、PBS緩沖液(以色列，BI公司)、胎牛血清(以色列，BI公司)、青霉素/鏈霉素雙抗(以色列，BI公司)、細胞劃痕插件(德國，iBidi)均由濟寧諾昂生物科技有限公司代理商代購。

光學顯微鏡(8588，日本尼康)；Cytation5多功能酶標儀(美國伯騰公司)；Cyto FLEX LX 流式細胞儀(中國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 SW480細胞(結腸癌細胞系)、A549細胞(肺癌細胞系)、U251細胞(腦膠質瘤細胞系)培養于完全培養基(DMEM+10%FBS+1%PS)，置于37℃(5% CO2)恒溫細胞培養箱中培養，每日觀察細胞狀態及密度。

1.2.2細胞活性檢測 SW480細胞、A549細胞、U251細胞接種在培養皿中貼壁后，用DFTP處理適當時間(每個濃度3個復孔)，棄掉培養基后，加入CCK-8細胞增殖檢測試劑，置于37℃(5% CO2)恒溫培養箱中孵育20～40 min后用酶標儀檢測細胞吸光度，檢測波長450nm。

1.2.3細胞形態觀測 將SW480細胞接種在6孔板中培養，細胞貼壁后用不同濃度DFTP處理，每日觀察細胞形態并拍照保存。

1.2.4細胞遷移實驗 將細胞遷移插件(iBid)插在12孔板中，在插件的每個小孔中接種SW480細胞，細胞長滿后拔除插件，用DFTP處理適當時間，每隔一定時間在顯微鏡下觀察拍照并保存。細胞劃痕的定量分析在Image J(V1.8.0.112)軟件中進行。

1.2.5細胞增殖檢測 將SW480細胞接種在12孔板中，細胞貼壁后用DFTP處理適當時間，每孔加入EdU在恒溫箱中孵育，取出后用4%多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100通透，3%BSA(in PBS)溶液清洗，加入click染液(按照碧云天C0078S試劑盒說明書配置)避光室溫孵育，清洗后加入H33342避光孵育，PBS清洗后拍攝熒光照片保存。

1.2.6細胞克隆形成實驗 將SW480細胞消化后梯度稀釋，按照每孔500個細胞的密度接種在12孔板中，培養72h后待細胞形成小型克隆團落時用DFTP處理，后續培養過程中，每3天更換一次培養基并補足相應濃度的DFTP，待對照組細胞出現大型克隆團落時終止培養，用結晶紫染色劑染色，在PBS環境中拍照保存。

1.2.7細胞周期檢測 將SW480細胞接種在6孔板中培養，貼壁后用不同濃度DFTP處理24 h后收獲細胞。細胞收集于1.5ml EP管，經清洗—離心后，用冷乙醇(70%)再冰浴中固定40 min。固定后的細胞經PBS清洗后，加入細胞周期檢測劑(由PI、Triton X-100、RNA酶組成)避光孵育20 min，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.8活細胞/死細胞雙熒光染色實驗 將SW480細胞接種在6孔板中培養，細胞貼壁后用DFTP處理適當時間，用PBS清洗，加入用緩沖液配置的Calcein AM染液(按說明書進行配制)，在培養箱中孵育適當時間后，加入用PBS配置的H33342和PI染液避光孵育，PBS清洗后拍攝熒光照片保存。

1.2.9細胞凋亡檢測 將SW480細胞接種在6孔板中培養，細胞貼壁后用DFTP處理適當時間，棄培養液，加入用結合液配制的Annix-V-FITC和PI染液(按說明書進行配制)避光孵育，棄染液后加入用PBS配置的H33342染液避光孵育15 min(4°C，避光)，拍攝熒光照片并保存。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 DFTP對癌細胞的抑制作用

圖1A 為 DFTP的結構式；DFTP對癌細胞的抑制在3種惡性腫瘤細胞系中得到了研究，如圖1B所示，DFTP對結腸癌細胞SW480、腦膠質瘤細胞U251以及肺癌細胞A549的細胞活力均有不同程度的抑制作用，其中SW480對DFTP最為敏感。該現象分別在10μM與20μM的DFTP中得到了具體對比(圖1B)。經過定量計算，DFTP對上述3種細胞系的半抑制濃度(IC50)分別為4.2μM、10.3μM、6.3μM(圖1C)。

圖1 DFTP對癌細胞的抑制作用

2.2 DFTP對SW480細胞形態的影響

正常生長的SW480細胞結構完整，貼壁狀態良好，細胞呈圓形至梭形。而隨著DFTP濃度增加，SW480細胞密度逐漸下降，細胞外觀變狹長，細胞邊緣有絲狀結構出現(見圖2中黃色箭頭標示)，并且隨著DFTP濃度增大，細胞出現無法良好伸展甚至不能貼壁生長的現象(見圖2中藍色箭頭標示)。

圖2 DFTP對結腸癌細胞形態方面的影響

2.3 DFTP對SW480細胞遷移能力的影響

正常生長的SW480細胞向劃痕中央大量遷移，細胞延展伸長呈梭形或線形。而隨著DFTP濃度增加，SW480細胞仍然大量向中央遷移，細胞形態與正常生長的細胞相似(見圖3A)。經圖像處理軟件ImageJ 測量和統計學分析，在相同處理時間，不同DFTP處理濃度下的細胞劃痕面積無顯著差異，且在不同濃度下，處理前后的細胞劃痕面積之差無顯著差異(F=1.849,P>0.05)(見圖3B)。

圖3 DFTP對結腸癌細胞遷移能力的影響

2.4 DFTP對SW480細胞增殖能力的抑制作用

如圖4A所示，紅色熒光代表細胞DNA復制速率，藍色熒光代表細胞核。正常生長的SW480細胞在熒光顯微鏡下紅色熒光和藍色熒光均較強烈，表示細胞DNA合成旺盛，細胞增殖速率快，細胞密度較高。而隨著DFTP濃度的增加，SW480細胞在熒光顯微鏡下的紅色熒光和藍色熒光均逐漸減弱，并且紅色熒光與藍色熒光之比也隨之下降(F=11.897,P<0.001)，這說明隨著DFTP的加入，細胞密度逐漸降低，DNA復制速率和細胞增殖能力受到顯著抑制。

2.5 DFTP對SW480細胞克隆能力的抑制作用

正常生長的SW480細胞形成較多大型細胞克隆團落，細胞有重疊堆積生長的現象。而隨著DFTP濃度的增加，SW480細胞形成的克隆團落逐漸變小，細胞分布逐漸分散，直至無法形成團落，甚至細胞碎片逐漸增多，細胞密度顯著降低(見圖4B)，這說明DFTP對于結腸癌細胞SW480的克隆形成具有顯著的抑制作用。

2.6 DFTP對SW480細胞周期S期的抑制作用

如圖4C所展示，隨著DFTP濃度的增加，SW480細胞周期中的S期所占比逐漸下降，并且在DFTP濃度為20 μM時，有大量死細胞存在(如圖4C中黃色箭頭所表示)。

2.7 DFTP對SW480細胞的殺傷作用

如圖5A所表示，紅色熒光代表死細胞，綠色熒光代表活細胞，藍色熒光代表細胞核。正常生長的SW480細胞在熒光顯微鏡下紅色熒光強度較弱，藍色和綠色熒光均較強烈，且藍色和綠色熒光的分布具有高度一致性。隨著DFTP濃度的增加，紅色熒光逐漸增強，死細胞逐漸增多，藍色和綠色熒光均逐漸減弱，活細胞逐漸減少(F=16.38,P<0.001)。

2.8 DFTP對SW480細胞凋亡的促進作用

如圖5B所展示，藍色熒光代表細胞核，綠色熒光代表細胞凋亡水平。正常生長的SW480細胞綠色熒光強度較弱，細胞凋亡數量較少。隨著DFTP濃度的增大，綠色熒光強度也逐漸增大(F=9.485,P<0.001)，細胞凋亡數量增多，這提示DFTP可以促進SW480發生細胞凋亡。

圖4 DFTP對結腸癌細胞增殖能力的抑制作用圖5 DFTP對SW480細胞凋亡的促進作用

3 討論

目前手術切除結腸腫瘤組織結合藥物輔助化療的方法是結腸癌主要的治療方式[3]，但由于結腸癌細胞的增殖速度較快，侵襲轉移能力較強，人體缺乏有效的免疫抑制反應，很容易造成周圍正常器官及組織的損害，導致術后再次復發，致使遠期預后不良。傳統的化療藥物存在毒副作用大、耐藥性強、價格昂貴的問題。雖然隨著醫療條件的改善手術技術的進步和新型藥物制劑的不斷發展，結腸癌的發展趨勢已然得到了有效的控制，但其仍然保持著較高的死亡率，多年來的治療經驗以及研究進展表明影響結腸癌患者患病率及復發率的主要因素是癌細胞的轉移[4]。因此,能夠抑制腫瘤細胞增殖、遷移作用的化療藥物一直是腫瘤學研究的重點，探究影響結腸癌細胞侵襲和轉移的相關分子機制對結腸癌患者的早期診斷和治療以及改善患者預后具有重要的意義[5-6]。本文應用DFTP處理結腸癌系SW480細胞，發現DFTP以濃度依賴性或劑量依賴性抑制SW480細胞增殖并促使細胞凋亡，從而起到抑制結腸癌細胞生長的作用。通常細胞增殖與細胞程序性凋亡是正常的生理過程，并維持在一個平衡狀態[7]，如果打破細胞增殖與凋亡之間的平衡狀態，就可對腫瘤的生長進行有效的干預[8]，因而,可通過干涉細胞增殖及程序性凋亡等途徑對腫瘤進行治療[9-10]。在當前一線抗癌藥物中，靶向細胞周期的單體化合物是重要的來源。兒茶酚對ERK2/c-Myc信號傳導軸有抑制作用，能夠通過誘導肺癌細胞G1期停滯以及與G1-S進展相關的蛋白表達降低來減少肺癌腫瘤在體外和體內的生長[11]。此外，Abliz[12]發現在傳統維吾爾醫學中的一種草藥制劑Savda Munziq(ASMq)的一種多酚也被證實具有抗宮頸癌的作用，富含酚類的ASMq提取物可誘導人宮頸鱗癌SiHa細胞凋亡，能以濃度依賴和時間依賴的方式提高細胞凋亡率；富酚提取物對SiHa細胞的生長抑制和凋亡誘導還與抗凋亡分子Bcl-2表達以及端粒酶和Survivin表達的下調有關。這些發現表明，酚類化合物在未來的臨床治療中具有作為對抗癌癥發生的新型治療劑的潛力。本文結果顯示，在經過DFTP處理后細胞活性受到明顯抑制，其活性與培養時間和處理濃度呈相關性，說明DFTP可以有效抑制結腸癌細胞的細胞活性；在細胞遷移實驗中，經過DFTP處理后的SW480細胞遷移并未受到影響，說明DFTP對于結腸癌細胞SW480的遷移無顯著影響；在EdU細胞增殖檢測實驗中發現在處理濃度為10μM時細胞增殖能力急劇下降，說明DFTP可以降低結腸癌細胞SW480的DNA復制速率；在克隆形成實驗中10μM的DFTP細胞失去克隆形成細胞團落的能力，說明DFTP可以抑制結腸癌細胞的增殖與克隆形成；在經過DFTP處理后，細胞周期中S期顯著下降，而G1和G2期并沒有出現顯著變化，這說明DFTP影響SW480細胞DNA復制(這與前面的EdU實驗結果是一致的)；與此同時，對于細胞周期檢測的實驗結果顯示，當DFTP濃度為20 μM時開始出現細胞死亡現象，并且這種死亡為細胞凋亡。但是本文并未對DFTP的誘導細胞凋亡的分子機制進行深度闡述，這將在下一步工作中進行深入的探究和驗證。

綜上所述，本研究首次揭示了DFTP的抑癌能力和特點，相比于肺癌和腦膠質瘤，DFTP對于抑制結腸癌細胞更為有效。DFTP雖然不影響結腸癌細胞SW480細胞的移動能力，但是可以通過抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡“雙管齊下”的方式對抗結腸癌：通過抑制DNA復制，抑制細胞周期S期向G2期的過渡，從而降低細胞增殖速率，并且可以通過誘導細胞凋亡來殺傷結腸癌細胞SW480。本研究對于開發以酚類化合物單體為先導化合物的抗腫瘤藥物有重要意義，為開發新的結腸癌的治療方法提供了實驗依據。

志謝:感謝中南民族大學藥學院楊小龍教授提供單體化合物DFTP，并為本課題提供了寶貴建議。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。