IL-16在Con A誘導小鼠自身免疫性肝損傷發生發展中的作用*

李春霞 李晨語 于文沛 馬 群 熊化保

(濟寧醫學院免疫學與分子醫學研究所，濟寧 272067)

肝臟是人體重要的免疫器官，含有多種天然免疫細胞及適應性免疫細胞。免疫介導的肝損傷因其免疫細胞失衡、炎性因子的過表達可導致肝細胞或肝組織受損，進而引發急性肝衰竭、慢性肝炎、肝纖維化的發生[1-2]。髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是由骨髓祖細胞和不成熟的髓系細胞組成的異質性細胞群，可通過表達和分泌免疫抑制相關因子發揮強有力的免疫抑制作用，如誘導型一氧化氮合酶( inducible nitric oxide synthase，iNOS)、精氨酸酶-1( arginase 1，Arg-1)等[3-4]，MDSCs在肝臟中的積累可減輕肝損傷[5-6]。白細胞介素16(interleukin-16，IL-16)作為多種細胞分泌的炎性因子，廣泛參與機體的炎癥反應，并與哮喘、腸炎、系統性硬化癥、心臟損傷等疾病密切相關[7-10]，而IL-16是否參與肝損傷未見報道。Con A 作為T細胞分裂原，能夠引發免疫興奮和炎癥刺激，其引起的病理改變與肝細胞損傷的病理生理過程類似，故Con A誘導的小鼠肝損傷是較為理想的免疫肝損傷動物模型[11-12]。本課題借助于IL-16基因敲除(IL-16-/-)小鼠，構建Con A誘導的肝損傷模型，觀察IL-16對肝損傷及MDSCs的影響，進一步探討IL-16是否通過調控MDSCs的募集而影響肝損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 7～8周齡，體質量18～22g，SPF級雄性C57BL/6小鼠，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，利用CRISPER/Cas9基因編輯技術獲得IL-16-/-小鼠，所有小鼠均在SPF級動物房繁殖飼養，符合濟寧醫學院實驗動物倫理委員會要求。

1.1.2試劑及儀器 刀豆球蛋白A(Con A，批號：C2010)購自美國Sigma公司；IL-16、IL-6、IL-12、TNF-α及內參GAPDH的引物均委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成；小鼠IL-16 ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；IL-6、IL-12、TNF-α ELISA試劑盒及流式細胞術相關抗體均購自美國BioLegend公司；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法[terminal dexynucleotidyl transferase( Td T)-mediated d UTP nick end labeling，TUNEL]凋亡檢測試劑盒購自Roche公司；定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qPCR)試劑由南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供，包括 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(貨號：Q111)和 HiScript III RT Super Mix for qPCR(貨號：R323)；兔抗IL-16多克隆抗體購自Abcam公司；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colonystimulating factor，GM-CSF)、IL-6購自Pepro Tech公司；免疫組織化學染色試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。Light cycler 480 PCR儀購自Roche公司；酶聯免疫檢測儀購自Bio-Tek公司；流式細胞儀購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1Con A誘導的肝損傷模型的建立及實驗分組 根據實驗設計將C57BL/6小鼠(WT)及IL-16敲除(IL-16-/-)小鼠分別隨機分為對照組(control組,n=5)和模型組(Con A組，n=7)，Con A組尾靜脈注射Con A(20mg/kg)，建立肝損傷模型，control組尾靜脈注射相同體積的磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffered Saline，PBS),6h后取小鼠血清待測IL-6、IL-12、TNF-α的表達，12h后取血清待測IL-16、ALT、AST，取脾臟、肝臟備用。另外給予小鼠致死劑量的Con A(25mg/kg)尾靜脈注射，觀察小鼠生存率。

1.2.2免疫組織化學技術檢測肝組織中IL-16蛋白的表達 各組小鼠肝組織石蠟切片脫蠟水化，檸檬酸緩沖液微波抗原修復后PBS洗3次，每次5 min；H2O2作用30min 阻斷過氧化物酶；PBS洗3次，每次5min，血清封閉室溫孵育20min；棄去血清滴加IL-16多克隆抗體，37℃過夜；PBS洗3次，每次5min；滴加生物素標記的二抗，室溫孵育30min；辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素室溫孵育20min，PBS洗3次，每次5min；DAB顯色、蘇木素襯染，脫水、透明后，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.3小鼠血清轉氨酶檢測及組織病理學分析 小鼠尾靜脈注射Con A，12h后摘眼球取血，4000r/min，離心10min后取血清，羅氏cobas8000全自動生化分析儀檢測血清中谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)和谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。同時將部分肝組織于4%多聚甲醛中固定，行常規HE染色，顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

1.2.4TUNEL試劑盒檢測肝組織中凋亡細胞 肝組織石蠟切片常規脫蠟、水化；PBS洗滌后滴加蛋白酶K，37℃孵育30min；PBS洗滌后滴加TUNEL反應液，37℃孵育30min；PBS洗滌后滴加防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5小鼠體外MDSCs的誘導 分別分離WT小鼠和IL-16-/-小鼠的股骨及脛骨，剔除肌肉后，用無菌PBS沖洗骨髓腔獲取骨髓細胞。在含100mL/L FBS、40ng/mL GM-CSF、40ng/mL IL-6 的DMEM培養基中培養，4d后收取細胞待測。

1.2.6小鼠肝臟、脾臟單個核細胞的制備 小鼠麻醉后暴露心臟和肝臟，在右心耳充分收集血液，于心尖處注入20ml PBS沖洗肝臟至灰白色。取肝臟至200目銅網上研磨至單細胞懸液，3000r/min，離心10min；棄上清后用約45ml的PBS將細胞重懸，400r/min，離心5min；吸取上清至一新的50ml離心管中，2500r/min，離心8min；棄去上清，用3ml 40% percoll重懸細胞，將重懸后的細胞緩慢疊加至2ml 70% 的percoll的上層。差速離心，2500r/min，離心30min。吸取中間灰白層至15ml離心管中，PBS洗滌2次后，棄去上清，用PBS調整細胞濃度后流式細胞術待測。

取小鼠脾臟充分研磨后獲取單細胞懸液，轉移至15ml離心管中，1500r/min，離心5min；棄上清后懸浮細胞，加入1ml 紅細胞裂解液，混勻后室溫靜置5min；適量PBS終止裂解后離心，棄上清后重懸細胞，PBS調整細胞濃度后流式細胞術待測。

1.2.7實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR) 采用RANiso Plus試劑提取肝組織及體外誘導MDSCs的總RNA，HiScript III RT Super Mix for qPCR試劑盒擴增cDNA。使用Light Cycler 480系統進行實時PCR反應。PCR引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.8ELISA法檢測IL-16、IL-6、IL-12、TNF-α的表達水平 取各組小鼠血液，4000r/min，離心10min后取上層血清，采用ELISA試劑盒檢測血清中IL-16、IL-6、IL-12、TNF-α的水平，實驗操作嚴格按說明書進行。

1.2.9流式細胞術檢測小鼠脾臟、肝臟及體外誘導MDSCs的比例 將制備的小鼠脾細胞、肝細胞及體外誘導的MDSCs轉移至流式管中，每管加入相應熒光標記的流式抗體，混勻后室溫避光30min；PBS洗滌，棄上清，200μl PBS懸浮細胞，過濾后行流式細胞術檢測。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 IL-16在Con A誘導的肝損傷模型中表達增加

WT-Con A組小鼠血清IL-16蛋白水平(160.5±18.93)pg/ml較WT-control組(0.39±0.08)pg/ml明顯增加(t=7.457，P<0.001，圖1A)；WT-con A組肝組織IL-16 mRNA水平(1.91±0.05)較WT-control組(0.89±0.07)升高，差異具有統計學意義(t=11.04，P<0.001，圖1B)。IL-16在WT-Con A組小鼠肝組織中顯著表達(圖1C)。以上結果均表明，IL-16在Con A誘導的肝損傷中表達增加，提示IL-16可能參與Con A誘導的肝損傷。

注：A.ELISA檢測小鼠血清中IL-16的含量；B.qPCR檢測小鼠肝組織中IL-16的mRNA水平；C.免疫組織化學檢測肝組織中IL-16的表達

2.2 IL-16加重Con A誘導的肝損傷

為進一步明確IL-16在Con A誘導的肝損傷中發揮的作用，利用IL-16-/-小鼠建立Con A誘導的肝損傷模型，觀察小鼠生存率及肝損傷程度。結果顯示，IL-16-/-組小鼠的生存率明顯高于WT組小鼠(P<0.05，圖2A)。IL-16-/--Con A組小鼠血清ALT(2331±460.6)U/L、AST(2753±589.8)U/L，含量較WT-Con A組ALT(8122±1886)U/L、AST(6328±1222)U/L降低，差異具有統計學意義(t=3.26，P=0.0098；t=2.789，P=0.0211，圖2B)。另外，小鼠肝臟病理切片HE染色結果顯示，WT-control組及IL-16-/--control組肝小葉結構完整，肝索整齊，肝竇清晰，肝細胞形態正常，細胞核大小均一，胞漿均勻紅染；WT-Con A組表現為肝細胞壞死呈片狀分布，肝索消失，肝竇內大量紅細胞淤積，可見不同程度的淋巴細胞、中性粒細胞浸潤；而IL-16-/--Con A組肝小葉及肝索結構可見，肝竇內有不同程度的紅細胞淤積，淋巴細胞及中性粒細胞稍有浸潤。TUNEL檢測結果顯示，IL-16-/--Con A組肝組織凋亡細胞顯著少于WT-Con A組。以上結果均表明IL-16可加重Con A引起的肝損傷。

注：A.小鼠生存率；B.小鼠血清中ALT和AST水平；C.小鼠肝臟組織形態(HE染色)；D.TUNEL染色檢測小鼠肝組織的細胞凋亡*P<0.05、**P<0.01 vs.WT-Con A組

2.3 IL-16增加肝損傷小鼠炎癥因子的表達

IL-16-/--Con A組血清IL-6(52.35±11.28)ng/ml、IL-12(2.58±0.14)ng/ml、TNF-α(56.51±0.14)pg/ml蛋白水平較WT-Con A組血清IL-6(155±18.16)ng/ml、IL-12(3.37±0.20)ng/ml、TNF-α(195.2±38.19)pg/ml下降，差異具有顯著性(t=4.803，P<0.001；t=2.888，P=0.0202；t=3.986，P=0.0032，圖3A)。IL-16-/--Con A組肝組織IL-6(0.72±0.03)、IL-12(4.14±1.29)、TNF-α(1.14±0.09)mRNA水平低于WT-Con A組IL-6(1.77±0.35)、IL-12(14.45±2.83)、TNF-α(1.68±0.15),差異具有統計學意義(t=3.995，P=0.0072；t=3.525，P=0.0065；t=3.875，P=0.0061，圖3B)。WT-control組及IL-16-/--control組小鼠體內炎癥因子無明顯變化。以上結果表明，IL-16可加重Con A引起的肝損傷炎癥反應。

注：A.ELISA檢測血清中IL-6、IL-12和 TNF-α的水平；B.qPCR檢測肝組織中IL-6、IL-12和 TNF-α mRNA水平

2.4 IL-16調節MDSCs的募集及誘導

如圖4所示，WT-Con A組小鼠肝臟中MDSCs的比例(5.66±0.54)%較WT-control組(1.58±0.16)%增高,差異具有統計學意義(t=5.106，P=0.0014)；而IL-16-/--Con A組小鼠脾臟及肝臟中MDSCs比例(1.48±0.77)%、(9.84±1.06)%明顯高于WT-Con A組(0.59±0.14)%、(5.66±0.54)%(t=5.705，P=0.0002；t=3.516，P=0.0056)。另外，我們在體外誘導了MDSCs，IL-16-/-小鼠來源誘導的MDSCs比例(76.14±0.31)%明顯高于WT小鼠來源的MDSCs(70.78±1.32)%(t=3.968，P=0.0041,圖5A)；qPCR分析與 MDSCs生成及發揮抑制作用的相關分子iNOS、Arg-1發現，與WT來源的MDSCs(1.61±0.32)、(0.94±0.20)相比，IL-16-/-小鼠來源 MDSCs中iNOS mRNA表達水平(2.68±0.32)顯著升高(t=2.394，P=0.0436)，而Arg-1的mRNA表達水平(0.71±0.26)無明顯變化(t=0.7293，P=0.4933,圖5B)。

注：A.流式細胞術檢測脾臟中MDSCs的比例；B.流式細胞術檢測肝臟中MDSCs的比例**P<0.01，***P<0.001 vs.WT-Con A組；##P<0.01 vs.WT-control組

注：A.流式細胞術檢測體外誘導的MDSCs的比例；B.qPCR檢測iNOS和Arg-1的mRNA水平*P<0.05、 **P<0.01、nsP >0.05 vs.WT組

3 討論

免疫性肝損傷是指由于免疫刺激和炎癥反應引起的肝細胞損傷或病變，其發病與多種因素有關，且機制復雜。細胞因子在肝損傷發生發展中發揮著至關重要的作用。IL-16是由多種細胞(包括激活的T細胞、巨噬細胞等免疫細胞和肥大細胞、上皮細胞等非免疫細胞)分泌的一種重要的前炎癥因子，參與腸炎、哮喘等多種疾病的病理過程[7]。目前,IL-16是否參與肝損傷的發生發展尚未可知。

本研究發現Con A誘導小鼠肝損傷后，IL-16在小鼠血清及肝組織中高表達，說明IL-16參與了Con A誘導的肝損傷的發生發展。前期研究表明，下調IL-16的表達有助于某些疾病病情的緩解。例如，中和IL-16可減輕阿霉素誘導的心臟損傷，改善心功能[8]；抗IL-16單克隆抗體可減輕三硝基苯磺酸誘導的小鼠結腸損傷和炎癥反應[13]；IL-16基因敲除后可減輕雞卵白蛋白誘導的小鼠哮喘炎癥[9]。而下調或敲除IL-16基因的表達是否有助于緩解Con A誘導的肝損傷？

我們借助IL-16-/-小鼠進行了進一步研究。結果表明，小鼠IL-16基因的缺失可明顯提高Con A致死劑量誘導的肝損傷小鼠生存率。肝損傷后肝細胞破壞，肝細胞內ALT和AST迅速釋放入血，可引起血清中水平增高，故血清中ALT及AST的活性水平是反映肝損傷程度、評價肝功能的重要指標。在本實驗中，IL-16基因的敲除可顯著降低肝損傷小鼠血清中ALT和AST水平，改善肝組織病理性損傷，減少肝細胞凋亡，說明IL-16的缺失在一定程度上可減輕Con A誘導的肝損傷。另外，肝損傷發生過程中中性粒細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞等炎癥細胞在肝臟中浸潤，產生大量細胞因子加重肝臟損傷。本研究IL-16基因的缺失可顯著降低Con A引起的血清中炎癥因子IL-6、IL-12和 TNF-α的蛋白水平及肝組織中IL-6、IL-12和TNF-α mRNA水平。以上結果均表明，IL-16的缺失有助于緩解Con A誘導的肝損傷病情，也就是說，IL-16可加重Con A誘導的小鼠肝損傷。

為進一步探討IL-16加重Con A誘導肝損傷的機制，我們對WT小鼠及IL-16-/-小鼠肝損傷后肝臟內浸潤的免疫細胞進行了分析。結果發現，對于WT小鼠，Con A組肝臟中Gr-1+CD11b+雙陽性細胞即MDSCs比例明顯高于control組。這與其他報道結果相似[5-6,14]。當IL-16基因缺失后，Con A并不影響小鼠肝臟內浸潤的細胞類型，但肝臟內MDSCs的比例明顯升高。在體外誘導MDSCs實驗中，IL-16缺失后誘導的MDSCs比例及其相關抑制因子iNOS的表達均有不同程度的增加。在炎癥發生時，機體為抑制免疫細胞激活，可誘導MDSCs募集至炎癥局部發揮免疫抑制作用，從而減輕炎癥反應[15]。實驗結果說明IL-16在一定程度上是通過下調MDSCs在肝臟中的募集而加重肝損傷。而MDSCs的募集是一個復雜而漸進的過程，由多種因素控制。一方面，未成熟骨髓細胞擴增為MDSCs可由基底膜基質或腫瘤產生的因子驅動，參與慢性感染和炎癥[16-18]；另一方面，MDSCs的激活可由炎性因子和損傷相關分子模式介導，包括IFN-γ、IL-1β、IL-4等，這些因素主要通過 NF-κB、STAT1 和 STAT6 信號途徑而實現[19-20]。而IL-16作為炎性因子，通過何種途徑對MDSCs的驅動或激活發揮了負調節作用有待進一步研究。

綜上所述，IL-16參與Con A誘導的肝損傷的發生發展，并且通過下調MDSCs在肝組織中的募集而加重肝損傷。本課題不僅為研究IL-16與MDSCs的相互作用提供了新思路，也為研究肝損傷發展的分子機制提出了新見解，因此，IL-16可能成為治療肝損傷的一個新的研究靶點。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。