自噬-溶酶體標記基因LC3B和LAMP2調控序列變異與退行性心臟瓣膜病的關聯性*

逄淑超 閆 波

(1濟寧醫學院附屬醫院，中美轉化醫學合作研究中心，濟寧 272029；2濟寧醫學院精準醫學研究院，濟寧 272067)

伴隨老齡化社會的發展，退行性心臟瓣膜病(Degenerative heart valve disease,DHVD)已逐漸成為我國老年人心臟瓣膜病最常見類型[1-2]，主要表現為鈣化性主動脈瓣狹窄[3]。DHVD與動脈粥樣硬化有類似發病危險因素包括高齡、高脂和高血壓等，其病理特點是炎癥浸潤、脂質沉積、細胞外基質重塑、瓣膜間質細胞轉分化及鈣化等[4]。自噬是細胞利用溶酶體降解長壽命蛋白、老化及受損的細胞器和大分子物質的過程，主要場所為自噬-溶酶體，參與調節細胞動態平衡、細胞分化和生存、衰老等過程，在動脈粥樣硬化、心力衰竭和血管老化等疾病中發揮重要作用[5-6]。我們前期研究顯示冠心病患者自噬-溶酶體標記基因微管相關蛋白輕鏈3(LC3B)和溶酶體相關蛋白2(LAMP2)表達顯著異常，提示自噬-溶酶體參與動脈粥樣硬化的發生[7-8]。多項研究顯示，在人的主動脈瓣膜樣本中，自噬-溶酶體相關基因的表達具有差異，其功能失調嚴重影響瓣膜鈣化程度[9-11]。在一些溶酶體貯積病患者中發現主動脈瓣膜增厚和狹窄，其發病機制可能為炎癥反應、鈣離子平衡改變和脂質沉積相互作用引起瓣膜退行性改變[12]。

目前，DHVD發病的分子機制尚未清楚，本文將探究自噬-溶酶體標記基因LC3B和LAMP2調控序列是否與DHVD發病相關，通過測序分析其調控序列變異與DHVD的關聯性，揭示DHVD的分子機制，為DHVD的分子診斷和臨床預防及治療提供可靠的實驗基礎和理論依據。

1 對象和方法

1.1 對象

選取2018-2020年就診于濟寧醫學院附屬醫院并經臨床明確診斷的247例DHVD患者作為DHVD組，男135例,女112例,年齡(63.02±11.04)歲；同期選取在濟寧醫學院附屬醫院健康體檢中心體檢的健康人群454例為對照組,男235例,女219例,年齡(51.00±12.00)歲。DHVD患者依據以下標準進行臨床診斷：1)主動脈瓣功能障礙的臨床表現；2)超聲心動圖和CT檢查有典型的主動脈瓣膜鈣化；3)排除其他原因，如風濕性心臟病(病理特征為Aschoff小體)、感染性心內膜炎等。本研究已獲得濟寧醫學院附屬醫院醫學倫理學委員會批準，患者本人或者法定監護人知情同意。

1.2 方法

1.2.1樣本采集及DNA提取 所有研究對象抽取空腹外周血3mL，采用密度梯度離心法提取外周血單核細胞。按DNeasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN,USA) 說明書操作，提取單核細胞基因組DNA，-20℃保存。

1.2.2PCR擴增 參照GeneBank中LAMP2基因(NG_007995)和LC3B基因(NG_029030)轉錄起始點上游序列設計啟動子引物，由上海生工生物公司合成。50 μL PCR反應體系：模板DNA 3μL，上游、下游引物(10μmol/ L)各1μL，PCR Mix 25μL，ddH2O 20μL。PCR反應條件：95℃預變性3min；95℃變性30s，退火40或60s，72 ℃延伸40s，共35個熱循環；72℃延伸10min。PCR擴增產物-20℃暫時保存。引物序列見表1。

表1 啟動子引物序列

1.2.3基因分型 所有樣本擴增完畢送至上海生工生物公司測序，以GeneBank中的啟動子序列為野生型參照，利用DNAMAN(Lynnon Biosoft，USA)軟件比對測序結果進行基因分型。

1.3 統計方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計數資料采用卡方檢驗，且理論頻數1≤T<5時用卡方檢驗校正公式，理論頻數T<1時改用Fisher確切概率法進行統計分析；運用logistic回歸分析SNPs與DHVD的關聯性，以優勢比(odds ratio，OR)和95%置信區間(confidence interval，CI)表示，同時對SNPs進行Hardy-Weinberg平衡檢驗；利用在線TRANSFAC2.0數據庫預測轉錄因子潛在的結合位點。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LC3B與LAMP2基因啟動子序列變異情況

篩選測序不合格的結果后，LAMP2基因測序成功的DHVD組201例(男性108例，女性93例)和對照組397例(男性201例，女性196例)；LC3B基因DHVD組212例，對照組390例。兩組共發現29個序列變異位點，經測序驗證確定，LC3B啟動子有6個序列變異位點(g.4085G>A，g.4266G>A，g.4286C>T，g4339G>A，g.4853A>G，g.4903G>T)僅發現于DHVD組，LAMP2啟動子有1個序列變異位點(g.4167A>G)僅存在于DHVD女性患者；在對照組中觀察到11個序列變異包含4個SNP，DHVD組未有這些變異；兩組中都存在的序列變異共有11個包含5個SNP，其中rs42900中AA，CC基因型在DHVD男性患者與對照組的差異有統計學意義(χ2=5.44，P<0.02)。見圖1，表2和表3。

表2 DHVD組和對照組LC3B基因序列變異基因型分析(n)

表3 DHVD組和對照組LAMP2基因序列變異基因型分析(n)

圖1 序列變異的測序色譜圖

2.2 SNPs與DHVD的關聯性分析

選取兩組都存在的 SNPs位點(rs11117269、rs532744297、rs35227715、rs16944733、rs42900、rs28603270)進行HardyWeinberg平衡檢驗，均符合HardyWeinberg平衡，提示樣本來自遺傳平衡的群體。

隨之對SNPs位點進行logistic回歸分析，結果發現rs35227715中等位基因G的致病效應是C的1.36倍(95%CI：1.02～1.81，P=0.04)；DHVD男性患者中rs42900基因型CC的致病效應是AA的0.56倍(95%CI：0.34～0.91，P=0.02)，其等位基因C的致病效應同樣是A的0.56倍(95%CI：0.40～0.79，P<0.01)。其余SNPs的基因型及等位基因均無相關性(P>0.05)。見表4和表5。

表4 LC3B基因SNP與DHVD的關聯性分析(n/%)

表5 LAMP2基因SNP與DHVD的關聯性分析(n/%)

2.3 預測序列變異位點影響的轉錄因子

利用在線TRANSFAC2.0數據庫(https://portal.genexplain.com/)分析發現于DHVD組的序列變異位點g.4085G>A，g.4266G>A，g.4286C>T，g4339G>A，g.4853A>G，g.4903G>T，g.4167A>G，結果顯示序列變異可消除原有轉錄因子的結合位點或者創建新的轉錄因子結合位點，包括SMAD蛋白家族，CAAT區/增強子結合蛋白(C/EBP)，激活增強子結合蛋白2(AP-2)，通用起始子(General initiator，Inr)，性別決定區Y框蛋白10(SOX10)(見表6，圖2)。

表6 預測變異序列影響結合的轉錄因子

圖2 預測序列變異影響結合的轉錄因子

3 討論

DHVD的分子細胞機制本質是瓣膜間質細胞內的動態平衡紊亂，促使其向成骨樣細胞轉化[4]。自噬是一種高度保守的分解代謝錯誤折疊蛋白質和受損細胞器的動態循環系統，以利于細胞的更新和維態[13]。LC3是哺乳動物中酵母細胞Atg8的同源物，是自噬泡形成的標志物，其含量多少可反映自噬的程度[14]。LAMP2是自噬-溶酶體成熟的關鍵調節因子，其基因缺失可引起自噬小體的積聚，導致細胞自噬功能失調[15]。在鈣化性瓣膜間質細胞中，LAMP2基因表達豐富[16]。同時也有報道稱黏多糖貯積癥小鼠模型的心臟瓣膜增厚，LC3和LAMP2的蛋白表達顯著升高，自噬功能失調[17]。在人的瓣膜組織中，檢測到LC3基因表達上調，自噬活動增強[9]。本文研究了LC3和LAMP2基因調控序列變異與DHVD的關聯性，對闡明DHVD發病的分子機制奠定基礎。

針對DHVD患者和健康對照的調控序列DNA，經基因測序分析發現，共有29個序列變異位點，其中7個序列變異位點(g.4085G>A，g.4266G>A，g.4286C>T，g4339G>A，g.4853A>G，g.4903G>T，g.4167A>G)只存在于DHVD組。對所獲得的SNP進行卡方檢驗分析，發現rs42900在男性患者中有差異(P<0.05)，而在女性中無影響，提示rs42900與DHVD患者性別存在關聯。隨之進行logistic回歸分析，結果顯示rs35227715的等位基因G與DHVD相關聯，是DHVD的獨立危險因素，致病風險是1.36倍；DHVD男性患者中rs42900基因型CC和等位基因C與DHVD存在關聯，兩者的致病風險均為0.56倍，提示其在DHVD發病過程中具有保護性作用。在線TRANSFAC2.0數據庫預測結果顯示，序列變異位點g.4085G>A可創建SMAD的結合位點，SMAD蛋白家族在 TGF-β信號轉導起著關鍵的作用，通過R-Smad/Co-Smad形成的異聚體進入細胞核調節靶基因的表達，其成員SMAD3可降低心肌重塑中心肌細胞的凋亡[18]，SMAD4則在心臟中胚層前體細胞的形成中發揮重要作用[19]。g.4266G>A可創建C/EBP的結合位點，C/EBP是一種含“堿性亮氨酸拉鏈”結構的轉錄因子,其功能是促進和維持細胞的分化狀態，有研究稱其在心臟損傷中可調節心外膜的激活，以改善心臟功能[20]。g.4903G>T可創建Inr結合位點，Inr作為核心啟動子的基本要素之一，在轉錄調控過程中有重要的作用[21]。g.4167A>G僅消除了SOX10的結合位點，而SOX10作為一種重要的轉錄因子，在脊神經細胞的分化，早期胚胎發育及心肌再生中發揮重要的作用[22]。由此可見，轉錄因子結合位點的消除或創建可能會改變啟動子的轉錄活性以致改變其基因表達，進而影響自噬水平和功能，從而引起DHVD的發病。

綜上所述，調控序列變異的確定能在分子遺傳學角度揭示DHVD發病機制。本研究基于生物信息學方法預測調控序列變異位點的功能，下一步我們將利用序列變異報告基因檢測，凝膠電泳遷移實驗(EMSA)，自噬-溶酶體系統功能改變等多種生物功能學方法，驗證預測結果的準確性，進而為DHVD 的發生發展機制提供堅實的遺傳學理論。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。