食欲素在細胞氧化應激中的神經保護作用及其機制研究*

李迎帥 曹 飛 王春梅 楊春青 劉 霞 王琴琴△

(1濟寧醫學院精神衛生學院，2濟寧醫學院康復醫學院，濟寧272000)

氧化應激參與帕金森病(Parkinson’s disease，PD)及阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)等神經退行性疾病的發生發展[1]。目前關于氧化應激在PD等神經退行性疾病中的調節機制尚不完全明確。轉錄因子Nrf2能調控下游抗氧化酶的表達，從而參與機體代謝及抗氧化等過程中，促進個體不斷適應變化的環境[2-3]；Nrf2還參與AD及PD等多種神經退行性疾病的病理過程中[2]。

食欲素是一種神經肽，主要是由外側下丘腦神經元分泌，包括食欲素A (Orexin A，OA)和食欲素B(Orexin B，OB)[4]。食欲素系統功能異常參與多種神經退行性疾病如AD及PD的發病過程中[5-7]。

本研究以H2O2誘導的HT-22細胞為體外氧化應激模型探討食欲素在氧化應激過程中的作用，闡明食欲素在氧化應激中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 HT-22細胞系購自上海通派生物公司。培養至含有FBS(10%)的DMEM培養基中，在細胞恒溫培養箱(5% CO2，37℃)中培養，待細胞長滿，傳代于六孔板中，用于后續實驗。

1.1.2藥品和試劑 OA及OB購自Phoenix Pharmaceuticals公司；DMEM購自HyClone公司；Nrf2抗體購自abclonal公司；β-actin抗體、羊抗鼠IgG及羊抗兔IgG購自ZSGB-BIO。

1.2 方法

1.2.1氧化應激細胞模型建立 HT-22細胞種于六孔板中，加入H2O2處理建立體外氧化應激模型。將細胞隨機分為6組：對照組、H2O2組、OA組、OB組、H2O2+OA組及H2O2+OB組。待細胞長至40%～50%時，H2O2組給予H2O2(500μM·L-1)處理，OA組給予OA(10-7M·L-1)處理，OB組給予OB(10-7M·L-1)處理，H2O2+OA組及H2O2+OB組中給予H2O2(500μmol·L-1)+OA/OB(10-7M·L-1)處理，待處理24h后利用顯微鏡觀察各組細胞狀態及數量，并分別拍照，用于后續計數。

1.2.2qPCR檢測各組Nrf2的表達 總RNA提?。捍毎幚硗戤?，吸除培養基并用PBS緩沖液清洗兩遍后，加入一定量的裂解液RZ(TIANGEN公司)，待細胞充分裂解后，收集裂解液至EP管中(RNase-free)。按照總RNA提取試劑盒(TIANGEN公司)的說明書進行提取，將提取的RNA溶于適量的RNase-Free雙蒸水中，待RNA充分溶解后，檢測RNA的濃度。

反轉錄：根據說明書(TIANGEN公司)，取適量提取的總RNA(20μl的反應體系里加入50ng～2μg的RNA)置于EP管(RNase-free)，按稀釋比例加入5×gDNA Buffer，加RNase-free的水補齊至20μl，充分混合均勻后置于42℃水浴鍋中反應3min，結束后取出EP管置于冰上，按照相應的稀釋比例加入10×King RT Buffer、FastKing RT Enzyme Mix及FQ-RT Primer Mix，加RNase-free的水補齊總體系10μl，充分混勻后加入到前面的gDNA步驟的反應體系中，混合均勻后置于42℃水浴鍋中孵育15min，之后95℃孵育3min。反應結束后通過qPCR儀檢測目的基因Nrf2的變化水平。Nrf2 qPCR引物如下：forward:5’-CGTCCCTAGGTCCTTGTTCC-3’;reverse:5’-TCAAATCCATGTCCTGCTGGG-3’。

1.2.3蛋白印跡檢測各組Nrf2蛋白的表達 總蛋白提取:待細胞處理結束，將細胞內的培養基吸除干凈，用PBS緩沖液清洗2遍后，然后將PBS吸干凈，加入適量含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液RIPA裂解20～30min(將樣品置于冰上進行操作)，待細胞充分裂解后，將裂解后的細胞轉移到1.5ml EP管中。于12000g，4℃離心15min。將上清轉移至新的EP管中，按比例加入適量蛋白上樣緩沖液，放于100℃金屬浴中加熱10min，用于后續實驗。

蛋白印跡：將提取的細胞蛋白樣品，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法將蛋白進行分離，之后通過轉膜的方法將蛋白轉移到PVDF膜上，加入1×TBST洗膜5min，然后加入5%的脫脂奶粉進行封閉1～2h，之后吸掉封閉液，加入稀釋好的一抗，放于4℃搖床上，過夜孵育。第二天將一抗回收，加入1×TBST洗膜3次，每次10～15min，倒掉TBST，加入稀釋好的二抗，然后放于室溫孵育1h，之后回收二抗，加入1×TBST洗膜3次，每次10～15min，洗膜完畢后，之后將底物加入到PVDF膜上進行顯色，用proteinsimple儀器采集數據，并使用ImageJ軟件進行灰度分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 HT-22細胞氧化應激模型的建立

本研究利用H2O2誘導的HT-22細胞為模型，結果顯示，與對照組相比，在處理24h的情況下，不同濃度的H2O2引起HT-22細胞數量不同程度地降低(圖1)。其中500μM·L-1的H2O2處理24h能引起HT-22細胞數量降低50%左右。因此本研究后續均采用500μM·L-1H2O2處理的HT-22細胞作為細胞模型。

2.2 食欲素對HT-22細胞死亡的影響

與對照組相比，H2O2組HT-22細胞數量降低約50%，而與H2O2組相比，OA和OB顯著增加HT-22細胞數量(約30%)，差異具有統計學意義(P<0.05)。因此，OA和OB顯著降低H2O2引起的HT-22細胞死亡，說明OA和OB能顯著降低H2O2對HT-22的神經損傷，進而發揮神經保護作用(圖2)。

注：***P<0.001 vs.對照組；#P<0.05 vs.H2O2組； ##P<0.01 vs.H2O2組

2.3 H2O2對HT-22細胞中Nrf2基因表達水平的影響

qPCR結果顯示，與對照組相比，H2O2組Nrf2基因表△△CT達約為-2.064，說明相對于對照組，H2O2顯著升高HT-22細胞中Nrf2的基因表達水平。

2.4 食欲素對HT-22細胞中Nrf2蛋白表達水平的影響

相對于對照組，OA及OB對HT-22細胞中Nrf2的表達無顯著影響，而OA和OB組HT-22細胞中Nrf2的蛋白表達水平約為H2O2組的2倍。說明相對于H2O2組，OA和OB顯著升高HT-22細胞內Nrf2的蛋白表達水平(圖3)，提示OA和OB很可能通過增強HT-22細胞中Nrf2的表達水平，進而發揮神經保護作用。

注：NS (P>0.05) vs.對照組；*P<0.05 vs.H2O2組

3 討論

氧自由基的聚集會造成細胞內蛋白質及DNA等的損傷，進而引起組織及器官的功能異常，從而導致機體疾病的產生和發展[8-9]。氧化應激參與多種神經系統的發生過程中[1]。已有研究顯示，食欲素參與到多種氧化應激相關神經退行性疾病的病理過程中[1]，然而其在氧化應激中的具體作用機制尚不明確。本研究利用體外H2O2誘導的HT-22細胞的氧化應激模型發現，H2O2顯著降低HT-22細胞的數量，OA及OB能顯著降低H2O2誘導的HT-22細胞的死亡，進而在細胞氧化應激模型中發揮神經保護作用。

H2O2可引起細胞成分破壞，引起氧化應激，導致細胞死亡[10]。H2O2是用來建立氧化應激模型的常用藥物，有研究者發現600μM·L-1的H2O2處理24h能引起HT-22細胞數量降低50%左右[10]。這在一定程度上和本研究的實驗結果是一致的。Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉錄因子家族成員[2]，參與氧化應激過程中，并在HT-22細胞的氧化應激模型中發揮一定的作用[11-12]。本研究中，與對照組相比，H2O2處理會引起HT-22細胞數量的顯著下降，說明H2O2對HT-22細胞有一定的神經毒性；與H2O2組相比，OA及OB處理均能顯著增加HT-22細胞的數量，說明OA及OB能夠減輕H2O2的神經毒性作用；與對照組相比，H2O2顯著增加HT-22細胞中Nrf2的基因表達水平，提示Nrf2在H2O2誘導的氧化應激中的潛在作用；與H2O2組相比，OA和OB顯著增加HT-22細胞內的Nrf2蛋白的表達水平。一方面提示OA及OB對Nrf2表達水平的調控作用，另一方面本研究也提示食欲素系統與Nrf2信號通路的相關性。

前期研究顯示，OA能顯著降低氧化應激引起的SH-SY5Y細胞損傷[13]，這也進一步支持本研究的結論。本研究提示，Nrf2很有可能參與到食欲素介導的神經保護作用。正常生理條件下，Keap1會與Nrf2結合引起Nrf2進入降解途徑，當外界條件改變如某些氧化應激相關刺激等存在時，會引起Nrf2從復合物中分離出來，進而入核，Nrf2入核之后會引起一些抗氧化酶等的產生，從而發揮抗氧化過程[2]。本文結果顯示，H2O2顯著增加HT-22細胞中的核因子Nrf2的基因表達水平，但是H2O2對HT-22細胞內Nrf2蛋白表達的影響需要進一步探究；而食欲素顯著增強HT-22細胞內Nrf2蛋白的表達，因此我們推測食欲素很有可能是通過增強HT-22細胞內Nrf2的表達及入核，進而引起抗氧化應激相關因子的產生，從而降低H2O2引起的HT-22細胞的死亡[2]。而Nrf2在其中的具體作用機制需要進一步采用動物實驗和細胞實驗去闡釋。

綜上，本課題研究結果顯示食欲素能增強H2O2引起的HT-22細胞的Nrf2的表達水平，并降低H2O2引起的HT-22細胞的神經損傷，發揮神經保護作用。而關于食欲素對Nrf2的具體調控機制還需要進一步探究。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。