UFLC法測定黃芪桂枝五物湯與桂枝水提物中桂皮酸的含量

崔 悅，王文正，范琢玉，湯鑫淼，馮 波，關 皎，朱鶴云

(吉林醫藥學院藥學院，吉林 吉林 132013)

黃芪桂枝五物湯出自漢代張仲景所著的《金匱要略》，方中含黃芪、桂枝、芍藥、生姜和大棗五味藥材，具有益氣溫經，補氣通陽，和血通痹等功效?，F代臨床主要是用于治療風濕性關節炎、類風濕性關節炎、糖尿病、頸椎病、腦血栓以及心絞痛等[1-5]。黃芪桂枝五物湯君臣佐使配伍明確，其中黃芪為君，桂枝為臣，芍藥為佐，生姜、大棗為使。各藥味分工明確，相輔相成，極大地發揮了各自藥效。在黃芪桂枝五物湯中，桂枝為臣藥，起到了解表和營、通陽散寒的作用。桂枝為樟科植物肉桂Cirmarnomum cassia Presl的干燥嫩枝，其主要化學成分包括：有機酸類化合物、萜類化合物、黃酮類化合物、糖苷類和苷元化合物等[6]。文獻報道，桂枝具有多種藥理活性，能夠緩和腸胃刺激、強心、抗炎、抗血小板凝集和改善微循環等。在臨床實踐中桂枝可以用于組成多種中藥經典方劑，廣泛應用于臨床各科疾病的治療[7-10]。桂皮酸是桂枝中的主要活性成分，研究表明，桂皮酸具有解熱、鎮痛、抑菌、抗氧化、抗病毒、保護血管、利尿等作用。目前，桂枝中桂皮酸的含量測定方法主要為HPLC法[11-13]。近年來，超快速液相色譜法(ultra-fast liquid chromatography，UFLC)由于具有分離速度快、分析時間短等優點，已廣泛地應用到了中藥成分的含量測定中[14-15]。本研究建立了一種快速準確的方法用于對黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸的含量測定，為黃芪桂枝五物湯的質量控制和配伍規律研究提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

超快速液相色譜儀(Prominence UFLC型，日本島津公司)；超聲儀(KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(CPA 225D型，德國賽多利斯儀器有限公司)；粉碎機(FW80型，天津市泰斯特儀器有限公司)；旋轉蒸發儀(N-1300型，日本東京理化器械株式會社)；渦旋混勻器(Vortex 3型，德國IKA公司)。

甲醇、乙腈(美國Thermo Fisher)，甲酸(天津大茂化學試劑廠)，純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。除甲醇、乙腈、甲酸為色譜級外，其他均為分析純。桂皮酸對照品(>98%，成都普菲德生物技術有限公司官，批號：18092601)。黃芪、桂枝、芍藥、生姜、大棗(吉林大藥房)，以上藥材經吉林醫藥學院李景華副教授鑒定均為藥材真品。

1.2 色譜條件

Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm，2.2 mm，日本島津)；色譜柱溫度：35 ℃；檢測波長：290 nm；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL；流動相：0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫程序如下：0～5 min，10%～25%B；5～10 min，25%～35%B；10～15 min，35%～40%B。桂皮酸對照品、桂枝水提物樣品、黃芪桂枝五物湯樣品及缺少桂枝的陰性樣品色譜圖見圖1。

1.3 黃芪桂枝五物湯的制備

取黃芪藥材9 g、桂枝藥材9 g、白芍藥材9 g、生姜藥材18 g、大棗藥材4枚于1 L圓底燒瓶，向其中加入10倍量體積的水加熱回流2次，每次1 h。過濾后合并兩次濾液，并使用旋轉蒸發儀濃縮到50 mL，4 ℃保存待用。

1.4 桂枝水提物的制備

取桂枝藥材9 g于1 L圓底燒瓶，其余操作同“1.3”。

1.5 陰性樣品溶液的制備

取黃芪藥材9 g、白芍藥材9 g、生姜藥材18 g、大棗藥材4枚于1 L圓底燒瓶，其余操作同“1.3”。

1.6 溶液的制備

1.6.1對照品溶液的制備

取桂皮酸對照品適量于5 mL容量瓶中，以甲醇為溶劑進行溶解并定容至刻度，得1.0 g/L桂皮酸對照品溶液，4 ℃保存待用。

1.6.2待測溶液的制備

分別取“1.3”“1.4”“1.5”項下各提取物0.5 mL，于不同50 mL錐形瓶中，向其中加入甲醇溶液25 mL，采用超聲法提取30 min，續濾液經0.22 μm微孔濾膜濾過，得各待測溶液。

1.7 分析方法的驗證

1.7.1線性關系

取“1.6.1”項下桂皮酸對照品溶液適量于5 mL量瓶中，以甲醇為溶劑制得桂皮酸對照品溶液，濃度依次為0.5、1、2、4、10、20 mg/L，進樣分析。線性回歸計算時，橫坐標X為對照品濃度(mg/L)，縱坐標Y為峰面積，得回歸方程。

1.7.2精密度試驗

取“1.6.1”項下桂皮酸對照品溶液(4 mg/L)，按“1.2”項下色譜條件連續進樣(n=6)。計算桂皮酸峰面積的RSD。

1.7.3穩定性試驗

取同一批次黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物，按“1.6.2”項下方法處理，于室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，計算其峰面積的RSD。

1.7.4重復性試驗

取同一批次的黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物各6份，按“1.6.2”項下制得待測溶液，進樣分析并計算桂皮酸的含量和RSD。

1.7.5回收率試驗

精密量取已知含量的黃芪桂枝五物湯樣品(桂皮酸含量為0.132 mg/mL)和桂枝水提物樣品(桂皮酸的含量為0.193 g/L)各9份，每份0.25 mL，分別向各樣品中加入相當于樣品中桂皮酸苷含量80%、100%、120%的對照品溶液各3份，按“1.6.2”項下方法制得待測溶液，進樣分析，并計算桂皮酸的回收率和RSD。

1.8 含量測定

按“1.6.2”項下方法分別制備6批黃芪桂枝五物湯和黃芪水提物待測溶液，進樣分析并計算桂皮酸含量。

2 結 果

2.1 分析方法驗證

2.1.1線性關系

經線性回歸計算桂皮酸的回歸方程為

Y=8.1×104X-1.6×104(r=0.999 7)

即桂皮酸在0.5～20 mg/L線性關系良好。

2.1.2精密度試驗

經計算桂皮酸峰面積的RSD為0.42%，即儀器具有良好的精密度。

2.1.3穩定性試驗

經計算黃芪桂枝五物湯和黃芪水提物中桂皮酸峰面積的RSD分別為0.19%和1.1%，說明上述樣品在24 h內穩定。

2.1.4重復性試驗

經計算黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸含量的平均值分別為0.132 mg/L(RSD=2.1%)、0.183 mg/L(RSD=1.4%)，即方法具有良好的重復性。

2.1.5桂皮酸的回收率

黃芪桂枝五物湯樣品中桂皮酸的平均RSD為0.9%,平均回收率為98.1%;桂枝提取液樣品中桂皮酸的平均RSD為0.97%,平均回收率為的98.6%。

2.2 含量測定

6批黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸含量結果見表1。

表 1 黃芪桂枝五物湯和桂枝提取液中桂皮酸的含量(%)

3 討 論

3.1 流動相的優化

流動相的種類對于待測物的分離和分析具有重要意義。適宜的流動相種類和比例有助于待測物的分析與測定。本研究參考已有文獻，分別考察了甲醇-水、甲醇-0.2%醋酸水、乙腈-水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水共5種流動相體系，結果表明，乙腈-0.1%磷酸水作為流動相時能夠獲得較好的分離效果，分析時間為15 min，且藥材中無其他色譜峰的干擾。

3.2 檢測波長的選擇

實驗中對檢測波長進行了考察，二極管陣列檢測器可進行全波長掃描，并可獲得所測成分的最大吸收波長，有助于待測物的檢測。實驗中發現：桂皮酸的吸收峰位于290 nm，為最大吸收波長。綜合考慮雜質色譜峰影響、基線、色譜峰峰形、最大吸收等因素，最終選擇290 nm作為檢測波長。

3.3 黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸含量比較

通過對6批黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸含量進行測定，結果發現，相比于桂枝水提物，黃芪桂枝五物湯中桂皮酸的含量減少，即配伍以后合煎液中桂皮酸的含量低于單煎液，也就是說黃芪桂枝五物湯中桂皮酸的提取減弱。課題組前期研究表明，相比于黃芪水提物，黃芪桂枝五物湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量明顯增加，有正向促進作用。綜合本實驗與其他文獻研究結果可以看出：在某些情況下，配伍可促進有效成分的溶出，也可能抑制有效成分的溶出，具體的機制仍有待進一步研究。

綜上，本研究建立了一種快速、準確、靈敏的UFLC法測定黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸的含量。結果表明，黃芪桂枝五物湯相比于桂枝水提液中桂皮酸的含量減少，可為黃芪桂枝五物湯的進一步研究與開發提供參考依據。