椰毒假單胞菌酵米面亞種檢測方法研究進展

梁美丹，尹瑋璐，黃志深，蔣佳希，張明明，肖 劍

（廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511400）

椰毒假單胞菌酵米面亞種（Psedomonas cocovenenanssubsp.farinofermentans），最初發現于1977年的東北酵米面中毒食品中，在2003年被劃分為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli）的一個病原型，該菌主要存在于谷物類發酵制品（如發酵制成的玉米面等）、薯類制品、變質的銀耳和環境中[1]。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）可產生毒黃素（Toxoflavin，TF）和米酵菌酸（Bongkrekic Acid，BA）兩種毒素，米酵菌酸由于不產生臭味及異味，被污染的食品肉眼上無法分辨，且高溫烹飪不能去除，人體攝入微量的米酵菌酸即可引起高致病性的食品中毒，最初多發生于制作面食等東北地區。據不完全統計，20世紀中期以來，由該菌產生的米酵菌酸毒素引發的食物中毒事件已在我國涉及東北三省、云南省、浙江省、廣西和廣東省等16個省[2-10]，其中廣東省首起米酵菌酸中毒案例報道于2018年[11]，至2020年共5起相關案例[12]。有研究報道，該菌產生的毒素引發食品中毒病死率為68%～89%[10]，其致病性強，死亡率高，是迄今為止在我國發病率和死亡率極高的食源性致病菌[13]。本文對椰毒假單胞菌酵米面亞種的檢測技術方法進行了綜述。

1 檢測技術

1.1 微生物法培養技術

目前，我國對椰毒假單胞菌酵米面亞種的檢驗方法主要是《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）檢驗》（GB 4789.29—2020）[14]國家標準法。該方法需要根據樣品類型進行不同的前處理，首先將樣品進行增菌，隨后在不同的平板中分離菌株，可疑菌落進行初步生化及鏡檢，椰毒假單胞菌酵米面亞種的許多特點與洋蔥假單胞菌相似[15]，需要專業人員確認；隨后將菌株純化培養、生化鑒定，陽性結果需做毒性試驗，該方法檢測周期較長，無法給食品的安全性提供及時準確的判斷。

1.2 基因測序技術

基因測序是基因檢測的方法之一，通過讀取序列信息可以對物種進行分類、分型、溯源，并從基因序列中尋找具有研究價值的片段。16S rRNA基因是研究生物系統發育及分類的框架基礎，基因擴增的產物測序經比對后可確定菌株的發育關系及種屬。焦振泉等[16]對不同來源樣品的椰酵假單胞菌的16S rDNA測序，確定了椰酵假單胞菌與唐菖蒲伯克霍爾德氏菌等的親緣關系。曲春楓等[17]對代表菌株的基因片段進行16S rRNA基因擴增及測序分析，確定椰毒假單胞菌為伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）屬分類下的一個種。王崗等[18-19]對椰毒假單胞菌酵米面亞種基于16S rRNA基因進行測序分型，然后構建溯源數據庫，同時建立了椰毒假單胞菌酵米面亞種熒光標記擴增片段長度多態性（FAFLP）分型方法，最后通過實驗比較確定FAFLP分型的準確性高于VITEK 2 GN和16S rDNA。除此之外，黃庭軒等[20]通過recA序列分析比較了伯克霍爾德菌屬中72種不同種標準株的序列以及唐菖蒲伯克霍爾德菌種內4個致病變種及環境分離株的recA序列分析，發現recA序列分析不僅能很好地鑒別伯克霍爾德菌屬內不同的種，對唐菖蒲伯克霍爾德菌種內變種的區分也有參考價值。彭子欣等[21]利用基因擴增及測序技術研究唐菖蒲伯克霍爾德菌椰毒致病型菌株Co14毒力相關基因，測定基因組序列后通過同源序列比對，在菌株Co14基因組染色體1上發現米酵菌酸和毒黃素生物合成相關基因簇，根據基因簇中基因的關系預測米酵菌酸和毒黃素的生物合成過程。陳榮橋等[22]則以Co14作為參比基因對分出的34株唐菖蒲伯克霍爾德氏菌野生菌株進行全基因組測序，基于多核苷酸多態性（Single Nucleotide Poiymorphism，SNP）數據構建進化樹以研究案例菌株溯源關系。董銀蘋等[23]通過基因組測序技術及熱圖分析，研究唐菖蒲伯克霍爾德菌椰毒致病變種分離株中攜帶bon基因簇情況，該研究的DBJ菌株基因組成也和Co14菌株類似，米酵菌酸產毒基因簇在G2染色體內，且包含了13個基因。通過基因測序及分型所得的信息為椰毒假單胞菌酵米面亞種的研究提供理論基礎。

1.3 普通PCR技術

聚合酶鏈式反應（Polymase Chain Reaction，PCR）是1985年發明的分子鑒定技術，并于1993年獲得諾貝爾獎。趙夢馨等[24]設計研究比較3種檢測方法對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的鑒定效果，結果顯示，相比傳統生理生化鑒定方法，MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法在鑒定中更為快速、準確。根據現有數據庫信息，普通PCR及測序技術可實現椰毒假單胞菌酵米面亞種的準確鑒定，但基因擴增后，需通過凝膠電泳、產物純化、基因測序等技術才能得到最終序列信息，時間成本消耗較大，不便于快速應用。

1.4 實時熒光PCR技術

實時熒光PCR（Quantitative Real-time PCR）技術是一種將結果快速可視化的檢測手段，染料法簡單方便、成本較低，而探針法靈敏度高、檢測快速，相對具有更強的特異性。林捷等[25]根據椰毒假單胞菌酵米面亞種16S～18S rRNA基因片段序列設計一對特異性引物和一個TaqMan探針，該方法法抗干擾能力強，菌液的靈敏度為1×102CFU·mL-1，DNA的靈敏度為250 fg·μL-1。王曉雯等[26]基于米酵菌酸生物合成的基因bonM設計特異性引物和探針，構建唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒假單胞菌酵米面亞種探針法實時熒光PCR反應體系，結果菌液檢測的靈敏度為 6.5×102CFU·mL-1，DNA 檢測的靈敏度為 4.8×10-4ng·μL-1。相比普通PCR檢測，實時熒光PCR技術操作更簡單快捷，節省時間成本，可以滿足現場快速準確高通量的檢測需求。

1.5 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是 2000年由 NOTOMI等[27]開發的一種新的快速核酸擴增方法。馬曉燕等[28]根據公布的椰毒假單胞菌16S～23S rRNA基因序列設計引物構建LAMP檢測反應體系，并將LAMP法與PCR法進行比較，結果表明LAMP檢測方法具有較高的特異性和敏感性，椰毒假單胞菌的檢出限為5.4 CFU·mL-1，是PCR方法的1 000倍，經椰毒假單胞菌人工污染的銀耳樣品檢出限為76 CFU·g-1。環介導等溫擴增技術不需要特異性探針即可實現較高特異性，設備要求較低、檢測時間短，具有高特異性和等溫快速擴增的特點，是快速檢測應用價值極高的技術。

1.6 微滴式數字PCR技術

微 滴 式 數 字 PCR（Droplet Digital Polymerase Chain Reaction，ddPCR）是基于目標核酸分子的絕對定量技術，該技術無須依賴對照樣品和標準曲線可實現精準的絕對定量檢測，具有特異性強、靈敏度高、可實現準確定量等優點[29]，在微量的檢測中具有較大優勢。李會杰等[30]選取椰毒假單胞菌中具有高度種屬特異性且高度保守的16S～23S rRNA序列作為靶序列設計引物及探針，構建微滴式數字PCR檢測體系，該方法重復性好、靈敏度高，針對含不同菌液濃度的樣品，該方法的檢出限為361 CFU·mL-1，而用于比較的實時熒光PCR方法無法檢出該濃度污染的樣品。在同等條件下，微滴式數字PCR技術的高靈敏度可保證其應用于檢測微量高毒力致病菌的準確性，降低了食品中微量毒性物質對消費者的威脅。

2 結語

椰毒假單胞菌酵米面亞種及其毒素自20世紀70年代在我國首次發現至今，已有國家標準實行日常監督檢測，但是傳統的微生物方法檢驗周期長、操作步驟煩瑣，難以滿足在食物中毒及應急事件中快速檢測的需求。隨著生物、化學領域技術的快速發展，分子生物學檢測技術已作為一種快速檢測方法被廣泛應用于致病菌、病毒的檢測中。因此，今后的研究重點主要針對于椰毒假單胞菌酵米面亞種快速準確的檢測技術方法、不同食品中椰毒假單胞菌酵米面亞種的生長規律、風險情況、產毒機制及預防措施，有效地從原料儲藏、生產加工、銷售等環節預防和降低由該菌及其毒素污染引發的食物中毒。