采用更精準、非靶向鑒別手段，保證食品真實性
——探索高通量基因測序技術未來發展之路

□ 文 張聰

3月15日晚，央視“3·15晚會”曝光了一系列問題食品，其中包含5家食品企業用低價木薯粉和玉米粉混制冒稱“紅薯粉條”“山藥粉條”等造假摻偽亂象。最終，當地監管部門依法查封涉事生產經營場所，查扣涉事原料及產品，責令停止生產經營活動，企業負責人全部被公安機關帶走調查，并出臺了相應的整治工作方案。此次事件，使“食品真實性”問題再一次被推上風口浪尖。

什么是食品真實性？

提到食品真實性，也許很多人會感到一頭霧水，近年來在國際社會上廣受關注的熱門名詞“食品真實性”到底是什么?

事實上，食品真實性和食品安全、食品質量并列，是食品的三大屬性之一。與食品安全性相比，近年來食品真實性問題引發的事件在國內外也造成了一定的轟動：2013年愛爾蘭食品安全局揭露的非法“馬肉摻假”丑聞，幾乎牽涉到歐洲所有的國家；再如，受利益驅動，香米中摻雜更便宜的品種、將豬肉上色當作牛肉售賣、選購煙臺蘋果但其實際產地并非煙臺、蜂蜜中添加果葡糖漿……食品造假事件在人們的生活中屢見不鮮，生產以次充好的產品，標示虛假的產地、生產廠名、廠址等，均屬于食品真實性問題。

食品真實性鑒定技術發展的時代背景

隨著食品造假技術的演變，采用常規手段越來越難以檢測食品的真實性，導致其成為全球共治的監管難題，亟須更有針對性的精準鑒別手段。自2013年歐盟爆發“馬肉風波”以來，歐盟將食品真實性技術研究列入Horizon2020項目重點研究領域；2014年，食品科學界將食品真實性單獨列出，與食品安全和食品質量并駕齊驅，成為消費者關注的熱點。在我國，政府也高度重視真實性鑒定問題—2017年，科技部正式發布《“十三五”食品科技創新專項規劃》，首次明確提出了“食品反摻假控制技術”專項研究項目，支持食品真實性技術的發展。

龐大的檢測需求極大地催生了食品真實性鑒定技術的發展，一些對于鑒定結果要求較高的機構也開始運用高通量基因測序技術在該領域進行試水。那么，與其他鑒定方法相比，高通量基因測序技術有著怎樣的優缺點？國內使用這一技術進行食品真實性鑒定的水平如何？發展前景又是怎樣的呢？帶著這些問題，《食品安全導刊》雜志特設“高通量基因測序技術用于食品真實性鑒定”專題，邀請中國農科院質標所畜產品質量安全研究室主任陳愛亮、廣西壯族自治區食品藥品檢驗所微生物室副主任甘永琦、國家蛋白質科學基礎設施（北京）北大分中心蛋白質核心支撐平臺技術主管李桂瀾、SGS中國區健康食品行業負責人楊潞芳博士這4位專家，以及華大智造中國區市場部總監雷瑩共同探討食品真實性鑒定的相關問題及高通量基因測序技術的發展。

食品真實性現狀及不同的檢測技術

我國當前的食品質量安全狀況逐步好轉，但總體形勢依然嚴峻，食品造假摻偽等情況時有發生。陳愛亮表示，食品摻假是基于經濟利益驅動的用低值食品成分冒充高值食品成分的行為，因此一般相對價值較高的食物更容易被摻假，如用鴨肉冒充羊肉。實際上，食品摻假現已廣泛發生在各種動植物食品中，除了上述的鴨肉冒充羊肉，還有豬血冒充鴨血、牛奶冒充羊奶、普通奶冒充A2奶、油魚冒充鱈魚、意蜂蜜冒充土蜂蜜、玉米油冒充橄欖油等等，這些屬于物種成分摻假；此外，還有產地來源造假，如假冒拉菲紅酒、鹽池灘羊肉等。這里要說明的是，食品摻假不僅僅在中國，在國外也是廣受關注的食品安全問題。由于食品摻假的查處難度大，監管成本高，故已成為全球性的挑戰。

那么，一般會選擇采用怎樣的檢驗方法對摻假食品進行辨別？陳愛亮老師也給出了答案?！搬槍Σ煌膿郊傩问?，需要用到不同的檢驗方法。目前來說，用于食品摻假的鑒定方法主要有4類，一是色/質譜、核磁方法，主要通過分析食物代謝物的組成成分進行食品真實性鑒定；二是DNA分析法，即通過測定食物DNA對食品物種來源進行鑒定；三是元素分析法，通過測定食品中穩定同位素及礦物元素比值，對食品的產地來源進行鑒定；除此以外還有紅外光譜等技術?！标悙哿晾^續說道，“其中，DNA分析法中又包括熒光定量PCR法、DNA條形碼和高通量測序方法等，且DNA條形碼和高通量測序會用到基因測序儀。實際上，DNA分析法是目前公認的食品摻假物種鑒定最穩定和可靠的方法之一?！?/p>

在食品真實性鑒別方面，高通量測序技術雖然已經得到了部分應用，但由于該技術數據量大，結果分析要求高，缺乏相關的高通量測序分析方法標準，因此在國際上并未大規模普及。據了解，與國際相比，國內高通量測序技術在食品真實性鑒定方面的應用報道較少，且大多處于研究起步階段，尚未在企業質檢中心等廣泛推廣普及。從檢索相關文獻資料的情況來看，近年來，我國相關數據庫中“高通量基因測序技術在食品檢測中的應用”名錄下已有千余篇文獻研究，表明該領域的研究已有一定基礎，還有較大的發展空間。

高通量基因測序技術的優勢所在

高通量基因測序技術是一次能對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定的技術，其經過將待測的目標DNA片段化、加接頭，制備測序文庫，通過對文庫中DNA片段進行大規模平行測序，檢測對應的信號，最終獲取序列信息。因此，即使食品摻假的手段再“高明”，也難逃它的“法眼”。

例如，蜂產品摻假包括完全用糖漿和香精勾兌的人造蜂蜜、在天然蜂蜜中加入果葡糖漿等各種糖漿等的混摻蜂蜜，以及直接喂食蜜蜂糖水的劣質蜂蜜；除此之外，還有蜜源造假，即用雜花蜜冒充單一花品種蜜，用意蜂蜜冒充中蜂蜜等?！皩τ诿墼丛旒?，一般可以通過檢測蜜源植物或蜜蜂物種特異性的DNA進行鑒定。由于蜂蜜中的植物來源可能存在多種且未知的情況，利用高通量測序技術可以實現樣品中各種物種源性成分的快速鑒定，與傳統的PCR鑒定方法相比，具有非靶向、高通量及定量分析的優勢?！标悙哿两忉屨f：“其實高通量測序技術最大的優勢之一就是對于混合生物制品中的所有物種成分進行全景掃描，同時給出各物種成分的含量，因此對于食品企業復雜食品原料質控具有重要的意義。比如出口阿拉伯食品企業、中成藥企業等對復雜原料物種成分的鑒定，利用高通量測序技術可以提高鑒定的準確率和效率?！?/p>

再如，肉類加工食品在生產過程中原料需經絞碎等處理，配以輔料與添加劑，通過熏、煮或炸等特殊工序而具有良好的外觀和風味。由于消費者難以通過感官分辨產品中的肉類與配料表是否一致，所以部分商家為了降低成本，會在產品中有目的地替代或添加價格低廉的肉類。對此，甘永琦說道：“由于常規檢測方法每次只能確定或排除一種已知的動物源成分，無法適用混合肉制品的組成比例分析及未知摻假肉類的鑒定，與摻假手段的隱蔽性和復雜性相比具有嚴重的滯后性，難以滿足對肉制品摻假造假檢測的需要。因此，在食品真實性鑒定方面，肉類加工食品也會較多地應用到高通量測序技術?！睂Υ?，甘永琦也提出了他的解決方法—將DNA條形碼和高通量測序技術相結合，創新研發出DNA宏條形碼技術，其在分析食品中動物源性成分具有多方面優勢：一是對生物混合體系具有強大的分析能力，可同時檢測標識成分、混偽品、有毒動物或受保護動物的成分，以及在生產過程中引入的其他動物雜質，從而保證肉制品的有效性、安全性與合法性；二是對于物種的鑒別具有唯一性，可以從基因角度對不同物種進行分析并能準確將其界定；三是可進行生物混合體系中各物種成分的相對定量分析，通過測序將所有物種的序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），利用生物信息軟件與數據庫進行比對分析。

政策支持和市場機遇為發展賦能

利用高通量測序技術進行食品真實性鑒定是該技術近年來發展的新領域，在國內，SGS于2017年底便開始為企業提供動物性食品、植物性食品及魚類產品的二代測序服務。歐美等國也已通過高通量測序技術實現了對肉品DNA混合物的物種成分分析、蜂蜜的真偽鑒別等。此外，高通量測序技術在深加工食品的鑒定中也得到了很好的應用，實現了對糖果中物種成分的鑒別。目前，這一技術的研究重點為圍繞數據庫比對、閾值設定、生物信息學分析等方面提高物種鑒定的效率和準確性。

國際標準化工作方面，2021年10月，國際標準化組織發布ISO 22949-1-2021，規定了食品和飼料產品中動物物種檢測和鑒定中DNA測序方法性能的一般要求。楊潞芳介紹道，“經專家多年研討，ISO 22949-1-2021形成了測序方法的整體框架和通用要求，包括引物設計、數據庫構建、方法評價、實驗室測試等各個環節，從樣品制備到核酸提取，再到一代/二代測序的流程，直至測序結果表述，總體來說是一項流程完整的通用測序規定。雖然高通量基因測序技術已經在生物、醫學、大健康等領域有了較為成熟的應用，但在食品領域的發展尚屬起步階段?？梢灶A見的是，作為食品與飼料領域有關DNA測序方法的首個ISO標準，這一標準的出臺將為該技術在食品和飼料領域特別是食品真實性鑒定方面的廣泛應用鋪平道路?！?/p>

在我國，國家層面出臺的各項相關政策也正在持續發力。楊潞芳表示，《“十四五”市場監管科技發展規劃》中提出，在食品真實性鑒別及溯源技術研究方面，要研究食品中未知摻假物的非靶向篩查、精準定量、產地溯源、身份標識及品質識別技術，建立完善經濟利益驅動摻假（EMA）數據庫，構建全鏈條智能追溯系統，來解決食品真實性原料質量管控和溯源瓶頸問題。她說道：“在特殊食品及新技術食品安全監管關鍵技術研究中，同樣也提到要對未知與非食用物質風險高通量篩選和評價，這無疑是享有高通量、非靶向及定量分析優勢的高通量基因測序技術發展的一個契機。要想實現以上目標，需要多學科領域人才的協同創新，如食品學科、化學學科、分子生物學科、生物信息學科等，進而整合各方資源實現行業長足發展。而該目標的實現對于某個企業或機構來說難度不言而喻，所以將其作為國家政策對該技術進行指引和號召，將更強有力地推動我國高通量基因測序技術在食品真實性鑒別方面的發展?！?/p>

事實上，在使用高通量測序技術進行食品真實性鑒定時，幾位專家也在實際操作中遇到了一些痛點問題。

第一，無具體的國標方法可以參考。據李桂瀾介紹，在使用該技術進行食品真實性鑒定方面，因國家并未出臺具體的國標方法，國內外研究學者們通過在實際操作中不斷的探索，最終形成了幾種較為一致的檢測準確度的鑒定方法，如使用16s和12s核糖體RNA的高通量測序分析以及DNA條形碼技術進行肉類的摻假檢測。

第二，對測序產生的海量數據分析能力要求高。高通量測序技術具有高通量、非靶向和定量分析的優勢，可以對食物樣品中的所有潛在物種源性成分一次性全部鑒定出來，并給出相對含量。但也正是由于高通量測序能夠生成大量的基因測序數據，因此對測序大數據的分析技術要求非常高，除了高通量測序數據的常規分析外，對于物種鑒定，還涉及比對數據庫的權威性、物種認定的同源性閾值設定、測序reads數的百分比閾值設定等多個方面，需要根據不同的食物類型進行實驗研究來最終確定。

第三，高通量測序儀器及配套耗材價格昂貴。與其他鑒定技術相比，高通量測序試劑總體來說成本較為昂貴，因此從儀器、試劑盒等配套乃至整個供應鏈的國產化比率提高都顯得尤為重要。

針對上述挑戰，亟需從以下幾個方面著手進行解決。首先，應該篩選穩定可靠的各種食物物種核心DNA條形碼及輔助條形碼序列，建立權威可靠的物種DNA條形碼數據庫；其次，針對不同類型食物物種成分，開展模擬摻假鑒定研究，開發物種鑒定分析軟件，制定合理的同源性比對閾值以及摻假定量分析閾值，提高物種鑒定的準確率；最后則是圍繞食品真實性鑒定制定相關的國家標準，包括DNA條形碼數據庫標準、高通量基因測序方法標準以及數據處理等規范等。同時，還應加速基因測序硬件國產化。測序儀在整個產業鏈中擁有極高的技術壁壘和應用價值，為中下游測序服務提供技術和工具的支撐，測序儀的國產化可以打破競爭壁壘，快速促進行業的發展。

國產儀器品牌華大智造的崛起之路

高通量測序儀是基因測序“皇冠上的明珠”，從測序技術研發、驗證到測序儀器的生產制造是一個系統工程，因此測序儀器的性能受到多種因素影響。談及儀器品牌選擇的問題，幾位專家均較為看好國產品牌的發展。李桂瀾認為，就整體情況而言，國產儀器品牌基本上可以滿足其日常的測序需求，并已在實踐中得到驗證，希望國產品牌商可以朝著提升用戶服務與體驗的方向發展。陳愛亮提出，原本市場上的高通量基因測序儀是以進口品牌為主，但近幾年以華大智造為代表的國產品牌也逐漸發展成熟起來且性能越來越穩定好用，還具有價格優勢，所以比較看好國產測序儀的發展。甘永琦表示，如果國產儀器的性能可以與進口比肩，則更傾向于國產儀器，原因是國產儀器性價比高，實驗成本更低。

據悉，在國產測序儀器品牌中，華大智造已基本實現對進口產品的同步與超越。華大智造總部位于中國深圳，業務布局遍布六大洲80多個國家和地區，已在全球多個國家和地區設立科研、生產基地及培訓與售后服務中心，累計服務超過 1 300家用戶，是全球少數幾家具有自主研發并量產臨床級高通量基因測序儀能力的企業之一。

為了深入了解國產儀器的發展情況，本刊也邀請到華大智造中國區市場部總監雷瑩參與本話題，她表示，就技術本身而言，有別于其他技術路線的PCR指數擴增，華大智造獨有的DNBSEQ測序技術采用RCA滾環擴增，每次擴增錯誤不會累積，具有更高的準確性和更低的標簽跳躍率。同時，規則陣列芯片技術能夠提供更高的信號密度，更低的重復序列率，大幅提高檢測的準確性。另一方面，華大智造已經具備量產臨床級高通量基因測序儀的能力，這為充分發揮DNBSEQ測序技術的優勢提供了保障。

如今，華大智造推出不同數據通量、測序讀長的測序儀器 型號，包 括DNBSEQ-E、MGISEQ-200、MGISEQ-2000、DNBSEQ-T7及DNBSEQ-Tx系列高通量測序儀，覆蓋SE50-SE400、PE100-PE300等 多 種讀長模式，可以實現從微生物基因組到動植物基因組的全場景測序應用，這為高通量測序技術在食品真實性應用方向的全鏈條國產化奠定了良好基礎。特別是SE400讀長的測序模式，非常適合高通量宏條形碼測序，已成功支持了多項宏條形碼測序的研究?！巴瑫r，為了降低設備使用門檻及提升易用性，華大智造還配套研發了自動化樣本制備系統和數據分析工具，實現樣本處理、基因測序、數據分析的全流程便捷高效。后續，面對目前實際操作中遇到的痛點問題，華大智造希望與行業各方一道，共同建立可靠的物種DNA條形碼數據庫、開發配套的物種鑒定分析工具、推進相關國家標準及技術規范的制定。最后，我們企業自身還將繼續突破與超越，持續推出性能更優、操作更便捷、滿足不同應用場景的國產測序儀器?！崩赚撊缡钦f道。

未來發展前景展望

通過與幾位專家進行的深入交流采訪，可以看出高通量測序技術在進行食品真實性鑒定領域已占有一席之地。高通量測序技術憑借其高通量、非靶向以及定量分析等其他技術無可比擬的優點，在食品真實性鑒別領域正在得到越來越廣泛的應用。

隨著食品真實性鑒定的需求越來越多，高通量測序技術操作進一步簡化，生物信息學分析進一步自動化等，作為食品真偽鑒別的終極武器，相信在未來基于高通量測序的檢測方法將在食品真實性鑒定領域具有更大的發展空間，或將成為食品真偽鑒別中不可或缺的重要技術之一，為食品安全監管及執法機構提供有效的技術支撐。