外泌體在重要臟器缺血再灌注損傷中的治療作用研究進展

曾可君 楊煜輝 胡喆

1.廣東醫科大學第一臨床醫學院，廣東湛江 524000；2.廣東醫科大學附屬醫院麻醉科，廣東湛江 524000

外泌體是一類獨特的細胞外囊泡，是細胞分泌的納米級膜顆粒，可以在血液中向全身傳遞信號，其內部的信息主要包括蛋白質和RNA 有效載荷，通過內陷形成包裹細胞質內容物，當這些多泡內泌體融合到細胞表面后，外泌體被釋放到細胞外空間，并在細胞間傳遞信息，這種載物分子的傳遞能夠調節受體細胞的功能，從而調節疾病的過程[1]。外泌體作為細胞間通訊的強大載體，一直是基礎和臨床研究的熱點。除了研究最為廣泛的間充質干細胞來源的外泌體，其在重要器官缺血再灌注損傷中的作用及其靶向修飾治療顯示出良好臨床應用前景，本文將對其最新進展進行綜述。

1 外泌體的生物發生與組成

1.1 外泌體的生物發生

細胞外囊泡是由所有細胞分泌的膜囊泡，包括凋亡小體、脫落微囊泡和外泌體[1]。外泌體是從多種細胞和組織中產生的納米級（30～100 nm）膜性胞外小泡，其由細胞膜連續內陷包裹DNA、RNA、脂質、代謝物及胞漿和細胞表面蛋白等各類信號分子所形成[2-3]。外泌體在很長一段時間內一直被認為是細胞清理廢棄物的“垃圾袋”[4]。隨著研究的不斷深入，人們發現外泌體能夠介導細胞之間的通訊及物質傳遞，并在疾病的診斷、預后與治療中發揮重要作用。

1.2 外泌體的組成

外泌體的釋放及其介導的信號傳遞和交叉對話存在于多種病理生理狀態下，因此，外泌體具有應用于特定疾病的診斷、預后和治療的潛力。外泌體富含能夠傳遞細胞間通信信息的生物活性基因組和非基因組生物分子，生物化學上，其具有其特征性蛋白，包括CD63、CD14、TSG101、熱休克蛋白等[5]。除此之外，由于可被釋放到細胞外空間，外泌體還可以通過旁分泌或自分泌的方式運輸脂質、mRNA 和蛋白質等信號分子，結合不同的組織微環境及外泌體含量，可改變受體細胞的生物學行為，這種外泌體介導的反應既可促進也可抑制疾病[6]。除了治療潛力外，外泌體還具有幫助疾病診斷的潛力。外泌體能夠準確體現其“發生細胞”的來源及其生理病理狀態，由于其存在于所有生物體液中，通過采集體液樣本，可以很容易地獲得其中內容物的組成，并進行多組分分析，可幫助癌癥或其他疾病的診斷和預后判斷。

2 外泌體的藥物裝載與靶向修飾

外泌體的治療作用取決于封裝在其中的藥物成分及遞送效率。首先一個關鍵挑戰是如何有效地將藥物打包成外泌體。一般來說，裝載治療藥物的主要策略有3 種：①操縱母細胞中的基因表達，從而間接改變外顯體或外顯體模擬物中的蛋白質或RNA；②將治療性成分導入母細胞中，以便將其釋放到外泌體中；③直接向外泌體裝載藥物或分子。目前，具有應用前景的裝載藥物包括低分子化學藥物，如純化蛋白、短肽及核酸等[7]，超聲處理、電穿孔、轉染、孵育、擠出、皂苷輔助裝載、轉基因、凍融循環、熱沖擊、pH 梯度法和低滲透析等方法被用于將這些藥物裝載到外泌體中[8]。

與此同時，傳統基因運送載體（如質粒、病毒）具有載體毒性、運送效率低、炎癥反應等諸多缺陷，而天然的外泌體載體保留了其尺寸小、無毒、親細胞等特性，與生物體具有高度的生物相容性，更適合作為藥物運送載體。然而，天然外泌體進入體內后優先分布于肝、腎、脾等器官，很快被清除[9]。因細胞膜的空間走向與外泌體質膜極為相似，若利用目的細胞膜上的特異跨膜蛋白，如心肌歸巢肽，將其修飾于外泌體膜表面，可使外泌體獲得靶向性，提高治療效果。Kanki等[10]利用噬菌體展示技術篩選出一個組分為9 個氨基酸的歸巢肽，其可特異性地靶向到缺血后恢復灌流的心肌細胞中。但是，修飾于外泌體表面的歸巢肽有被蛋白酶降解而失去其靶向性的自身缺點。最近的改良方法是在歸巢肽的N 端融合1 個由5 個氨基酸殘基組成的糖基化序列，保護歸巢肽不被降解，同時增強歸巢肽在胞內及外泌體上的表達，從而提高其靶向運送的能力[11]。近年來，外泌體的裝載多樣化與不同器官靶向修飾不斷有突破，未來有一定的臨床應用前景。

3 外泌體應用于缺血再灌注損傷治療的研究進展

缺血和再灌注引起的組織損傷會導致多種疾病的發生與發展，包括心肌梗死、缺血性腦卒中、急性腎損傷、外傷、循環停止、睡眠呼吸暫停綜合征。缺血再灌注損傷也是器官移植，心胸、血管及普通外科手術的主要挑戰。缺血器官內代謝供需失衡導致嚴重的組織缺氧和微血管功能障礙。隨后的再灌注進一步增強了先天性和適應性免疫反應及細胞程序死亡的激活[12]。近年來發現，外泌體治療應對心、腦、腎等重要器官缺血和再灌注損傷有很好的效果。

3.1 外泌體與心肌缺血再灌注損傷

急性心肌梗死是世界范圍內心血管疾病死亡的主要原因。及時再灌注一直被認為是治療缺血性心臟病最有效的方法。然而，再灌注本身可能導致心肌損傷的加重。隨著藥物溶栓、經皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路移植術等再灌注療法的廣泛應用，找到預防缺血再灌注損傷的有效手段已成為當務之急。

源自干細胞的外泌體已被證明具有促進血管生成和組織修復的強大能力。然而，天然外泌體的短半衰期和清除速率過快導致病變區域的治療劑量不足。有研究發現，一種導電水凝膠可結合源自人臍帶間充質干細胞的外泌體，將此結合物注射到大鼠缺血再灌注損傷心臟后，水凝膠有效延長了外泌體在缺血心肌中的滯留時間，心臟功能得到了顯著改善[13]。另有研究發現，用單核細胞模擬物修飾間充質干細胞來源的外泌體，可利用單核細胞的募集特征，提高對受損心肌的靶向效率，在血管生成過程中促進內皮成熟并在缺血再灌注損傷后調節巨噬細胞亞群[14]。而用FNDC5預處理的骨髓間充質干細胞可以分泌更多的外泌體，且其處理所得外泌體在體內抗炎、抗凋亡、極化M2巨噬細胞等方面具有更好的治療效果[15]。然而，間充質干細胞經常從老年或患病患者身上采集，且分離的外泌體通常含有較多雜質。Takov等[16]研究發現，人胎兒羊水干細胞來源的外泌體的心臟保護和促血管生成活性優于間充質干細胞來源的外泌體，在灌注前注射高純度的人胎兒羊水干細胞來源的外泌體可使大鼠梗死面積減少（38±9）%。同時該研究結果還顯示，在體外模擬缺血再灌注損傷模型中，人胎兒羊水干細胞來源的外泌體對分離的原代心肌細胞無保護作用，表明其具有間接的心臟保護作用。脂肪細胞分泌的外泌體同樣可減輕小鼠心臟缺血/再灌注損傷。研究發現，能量緊張狀態的脂肪細胞能夠釋放含有氧化受損線粒體的外泌體，其在心臟組織中誘導短暫的線粒體氧化應激，導致心臟產生補償性抗氧化信號以保護心肌細胞免受急性氧化應激，從而減輕心臟缺血再灌注損傷[17]。這項研究表明，外泌體能夠介導組織之間的功能性線粒體轉移，這些脂肪細胞外泌體可能提供了有效的心臟保護生理途徑以對抗缺血應激。除細胞器外，外泌體中的非編碼RNA 也是重要的遞送分子。研究認為，來自間充質干細胞的外泌體中的miR-25-3p通過靶向促凋亡蛋白和EZH2 減輕了缺血再灌注損傷[18]。在小鼠原代主動脈內皮細胞來源的外泌體上發現高表達的LINC00174，其介導外泌體抑制心肌細胞的凋亡、空泡形成和自噬，改善了缺血再灌注導致的心肌損傷[19]。外泌體對心肌保護或損傷的分子機制并未完全闡明，仍需結合多組學研究以進行更深入的探討。

3.2 外泌體與腦缺血再灌注損傷

缺血性卒中是由于大腦動脈狹窄導致流向大腦的血液減少所致，溶栓劑已被用于臨床誘導閉塞的腦動脈再灌注。然而，腦損傷在再灌注后可繼續發展為缺血再灌注損傷。大鼠大腦中動脈閉塞模型已被廣泛應用于研究腦缺血再灌注損傷。由于未修飾的外泌體靶向性較差，將其靜脈注射到缺血腦區中仍然是一個挑戰，近期研究發現，利用連接晚期糖基化終末產物受體結合肽的外泌體可作為低氧特異性的載體，用于抗miR-181a 寡核苷酸（AMO181a）的鼻腦給藥，比未修飾的外泌體更有效地將AMO181a 運送到小鼠腦神經瘤細胞，下調異常增高的miR-181a 表達，上調Bcl-2 的表達，顯著抑制梗死面積[20]。另有研究發現，在該模型下生長相關蛋白-43 表達增加，負載槲皮素的單克隆抗體生長相關蛋白-43 偶聯外泌體可以通過外源性生長相關蛋白-43 與受損神經元表達的生長相關蛋白-43 相互作用而特異性地靶向作用于受損神經元，比單純負載槲皮素的外泌體治療的大鼠腦梗死體積更小，神經功能恢復更明顯[21]。Tian等[22]發現，由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-4C 肽與乳膠黏附素融合的重組融合蛋白可自動結合到外泌體膜上，通過大鼠尾靜脈注射人神經祖細胞來源的天冬氨酸-乳膠黏附素融合外泌體能靶向作用于缺血腦區，并顯示出較強的抗炎作用。然而在臨床患者當中，腦缺血或再灌注的損傷無可避免，因此，如何應對缺血后腦功能恢復也是目前重點研究方向。利用來源于干細胞的具有修復功能的外泌體是一種新的康復策略，如Dumbrava等[23]報道，間充質干細胞分泌的外泌體可促進老年大鼠大腦中動脈遠端閉塞后的神經功能恢復和大腦重塑，有效地減少了年輕和老年大鼠的運動協調缺陷，促進幼年和老年大鼠腦梗死周圍血管生成。星形膠質細胞則可以通過釋放包含在細胞外囊泡中的細胞介質來加速中風后的基礎恢復[24]，人羊水干細胞來源外泌體在腦缺血再灌注模型中能夠激活促生存和抗凋亡途徑，發揮神經保護作用[25]。

3.3 外泌體與腎缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷是急性腎損傷的主要原因。近年來對缺血再灌注所致急性腎損傷的病理生理學研究表明，免疫反應對腎臟缺血再灌注損傷和修復有重要影響。最近研究指出，小鼠靜脈注射負載核因子κB 抑制劑的外泌體后，可降低其缺血后腎臟的核因子κB活性，并顯著降低腎缺血再灌注術后的血清尿素氮、肌酐和中性粒細胞明膠酶相關脂鈣蛋白水平，減少細胞凋亡，與單純抑制組比較，負載核因子κB 抑制劑的外泌體治療還顯著影響了缺血后腎臟免疫細胞的數量，降低了中性粒細胞、單核/巨噬細胞和T 細胞的比例[26]。干細胞來源的外泌體同樣是腎缺血再灌注損傷的前沿防治方式。研究發現，人尿源性干細胞可通過其外泌體中miR-146a-5p 靶向核因子κB 信號[27]。在大鼠腎缺血再灌注模型中，尿源性干細胞可以通過外體miR-146a-5p 靶向白細胞介素-1 受體相關激酶1 的3’端非編碼區，抑制核因子κB p65 的核轉位和炎癥細胞的浸潤，從而保護腎功能。Cao等[28]發現，間充質干細胞來源外泌體能有效地向缺血腎歸巢，并主要聚集在近曲小管，其中高度富集的miR-125b-5p 可通過抑制腎小管上皮細胞中p53 蛋白的表達靶向腎小管上皮細胞的周期阻滯和凋亡，改善急性缺血性腎損傷，促進腎小管修復。外泌體在腎缺血性損傷后血管愈合中同樣發揮重要作用，研究發現，間充質干細胞來源的外泌體可促進大鼠腎缺血再灌注損傷后的血管愈合，外泌體涂層支架在植入28 d 后可加速再內皮化，減少支架內再狹窄[29]。

4 總結與展望

綜上，臨床對于延長外泌體的循環時間、提高靶向性及優化外泌體來源細胞都有了新的研究進展。由于外泌體是細胞天然來源而產生的，與脂質體比較，能更有效地進入靶細胞，并且在循環中的保留率更高，從而延長了治療性物質在體內的循環時間。研究表明[30]，外切體上的CD47 會產生一個“自我保護”的信號，保護其不被吞噬，并限制其從循環中清除。這些穩定且循環時間長的內源性納米載體為藥物運輸提供了保護，使其免于降解，并增加了藥物向靶組織的傳遞。工程外泌體上富集的配體可用于誘導或抑制受體細胞中的某些信號傳導，或將外泌體靶向特定的細胞類型，實現更精準地治療。與此同時，外泌體RNA 可以被血源性核糖核酸酶保護而不被降解，再加上其與脂質體比較，系統保留性更好，這可以使外泌體在較遠的位點發揮功能。除了用于治療心、腦、腎缺血再灌注損傷，外泌體在脊髓[31]、肝臟[32]、肺[33]、腸道[34]缺血再灌注損傷的治療中同樣發揮一定的作用，但目前相關報道仍較少，仍需要進一步分析探索其詳細作用機制。除此之外，目前還沒有標準化的外泌體分離純化技術及包裝技術，且包裝后的外泌體能否被機體耐受、廣泛用于臨床治療，仍需反復研究。