二代測序技術在血管性血友病診斷中的應用

楊 文，周澤平

(昆明醫科大學第二附屬醫院 血液內科，云南 昆明 650000)

血管性血友病(von Willebrand disease，VWD) 是最常見的常染色體遺傳出血性疾病，主要是由于血管性血友病因子(von Willebrand factor, VWF)基因突變所致。國外報道VWD發病率約為1/1 000[1]，但我國尚無明確流行病學資料。VWF是血漿中參與凝血過程的大分子多聚體糖蛋白，依據VWF水平和功能可將VWD分為定量異常和定性異常(見圖1)，定量異常包括1型和3型，定性異常僅包括2型，而2型又被分為2A，2B，2M和2N四種亞型。這三種類型和各亞型之間具有不同的生理病理機制，臨床表現、治療方法也有各自特點。VWD的診斷主要基于陽性家族史、不明原因的出血及異常的實驗室檢測結果[2-4]。國際血栓與止血協會出血評估工具有助于醫生了解病情，但不具備特異性，需要進一步完善實驗室檢查。而常規的篩查試驗，如血細胞計數、活化部分凝血活酶時間和凝血酶原時間等，在大多數VWD患者中可能是正常的。準確診斷VWD還需做以下檢查: VWF抗原(von Willebrand factor antigen，VWF：Ag)，瑞斯托霉素誘導血小板聚集試驗(ristomycin-induced platelet aggregation，RIPA)，瑞斯托霉素輔因子活性測定(von Willebrand factor ristocetin cofactor，VWF:RCo)，VWF膠原結合活性(VWF collagen binding，VWF：CB)，VWF與凝血因子VIII結合能力(VWF and coagulation factor VIII binding activity，VWF：FVIIIB)，凝血因子VIII活性(coagulation factor VIII coagulant activity，FVIII：C)，VWF多聚體分析，去氨加壓素(1-deamino-8-D-arginine vasopressin, DDAVP)試驗，VWF前導肽(VWF propeptide, VWFpp)測定和VWF基因測序，但是這其中有很多耗時且技術性強的實驗操作在大多數醫院并沒有常規開展。此外，由于VWF基因突變外顯率低、患者臨床表現異質性大、實驗室檢測變異性高及 VWF 水平易受外界因素干擾(如遺傳、激素、環境、衰老等)，診斷變得更加復雜，甚至導致誤診[5]。盡管傳統使用的Sanger等測序法可以識別VWF基因突變位點，有助于診斷，但存在耗時長、成本高、低通量等缺點，并未在臨床廣泛開展。隨著分子診斷技術的發展，二代測序技術(next-generation sequencing，NGS)應運而生，它具有高通量、高靈敏度、價格低廉等眾多優點，現已被證明是遺傳性疾病基因診斷的有效手段之一[6]。近年來，NGS在VWD診斷中廣泛應用，為臨床診療決策提供了更多可靠的依據。本文就NGS在VWD診斷中的應用進行綜述，旨在為臨床診斷提供依據。

1 NGS原理

NGS又稱高通量測序，是一種新興的分子診斷技術?，F有的二代測序平臺包括但不限于Roche/454、Illumina/Solexa GenomeAnalyzer、Polonator、Ion Torrent。不同的平臺，測序原理有所不同，但其核心工作原理都是邊合成邊測序，即用4種不同的熒光分子標記脫氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP)，在DNA分子進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增時，每一種新添加的dNTP會釋放不同的熒光信號，測序儀通過捕獲這些熒光信號，并導入特定計算機軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。

圖1 VWF的分子結構與VWD各類型的突變定位

2 NGS在VWD診斷中的應用

2.11型VWD 1型VWD最多見(占75%)，為常染色體顯性遺傳，其特點是血漿VWF水平僅為正常人的20%～50%。1型患者的基因突變位點散布于整個VWF基因，從啟動子10到外顯子52[7]，主要集中在28號外顯子，常見的突變形式為錯義突變(占75%)。突變體主要影響VWF合成或分泌以及血漿VWF清除效率，如D3區C1149R可以降低VWF的分泌，D4區C2257S可以影響VWF合成，同時，D4區L2207P會導致VWF在細胞內滯留[8]。還有一些突變會使血漿 VWF 清除速率顯著加快，如W1144G、I1416N[9]。目前已測序的1型患者突變率為70%[10]，剩余30%雖然沒有發現基因突變，但這些患者可能涉及到更為復雜的遺傳因素，比如內含子及其他遺傳位點的突變。

大多數1型患者為單個突變的顯性遺傳，但由單個突變導致出血的患者僅占5%～10%[11-12]。這表明除遺傳缺陷外，還存在其他因素與低水平VWF相關，比如ABO血型就是其中的一種。1987年Gill等[11]就報道了O型血的人比正常人VWF水平低，這對于O型血患者診斷VWD非常重要，因為O型血在1型VWD中出現的比例高達65%[12]。VWFpp位于VWF分子結構的D1和D2區域，通常它與成熟的VWF被等比例地分泌到血液中，但兩者的半衰期不同，VWFpp和VWF: Ag比值可以反映體內VWF的合成、分泌及清除狀況[13]。VWFpp和VWF: Ag比值升高提示VWF清除增快，這在1C型VWD患者中更加明顯(1C型是1型VWD中的特殊亞型)[14]。此外，修飾基因也會影響VWF水平。CLEC4M是一種凝集素受體，以往研究證明它可以清除血漿VWF[15]，但最近一項瑞典的研究發現CLEC4M還可以清除血漿中已經結合了FVIII的VWF[16]。STXBP5基因曾被證實其編碼的突觸融合蛋白結合蛋白-5可通過抑制內皮細胞胞吐導致低水平的VWF。后來Lind-Hallden等[17]又進一步發現了STXBP5基因中的p.N436S變異與1型VWD相關。Sabater-Lleal等[18]還發現了11個可能影響VWF水平的修飾基因：PDHB/PXK/KCTD6,SLC39A8,FCHO2/TMEM171/TNPO1,HLA,GIMAP7/GIMAP4,OR13C5/NIPSNAP,DAB2IP,C2CD4B,RAB5C-KAT2A,TAB1/SYNGR1,ARSA。但是上述新基因在VWD中的功能特征有待進一步研究。

2.22型VWD

2.2.12A型VWD 2A型是2型VWD中最常見的一種，多數為常染色體顯性遺傳，其特點是高-中分子量VWF多聚體缺失，導致血小板依賴性的功能減弱，大多數患者VWF活性和VWF:Ag比值降低。幾乎所有2A型VWD患者都可以檢測出異常突變，其中約73%的突變位于28號外顯子[19]。2A型VWD與50多種不同的錯義突變有關，這些錯義突變位于VWF不同的結構域，其發病機制有以下3種：血漿VWF裂解蛋白酶(ADAMTS13)敏感性增強(A1和A2結構域)，VWF二聚化或多聚化缺陷(D1-D2和CK結構域)，VWF在細胞內滯留(D3結構域)[20]。各結構域的致病機制和熱點突變不同(見表1)。

表1 VWD各類型的實驗室檢測特點、熱點突變及致病機制

2.2.22B型VWD 2B型VWD為常染色體顯性遺傳，此型是由于VWF基因的A1區突變導致VWF與血小板膜表面糖蛋白(glycoprotein，GP)Ib受體親和性增加所致，這種突變會導致血小板過度聚集并出現消耗性減少，高分子量VWF多聚體降低甚至缺失。低濃度的瑞斯托霉素(<0.5 mg/ml)誘導血小板聚集是2B型VWD的主要特征，同樣也是診斷的主要方法之一[21]。2B型VWD與血小板型血管性血友病(platelet-type von Willebrand disease，PT-VWD)有類似的表型，但后者是由于GP1BA基因發生功能性突變，導致血小板膜表面GPIb結合VWF能力增加，通常使用NGS可幫助鑒別兩者[22]。目前國際VWF突變數據庫(http://www.ragtimedesign.com/vwf/mutation)已發現50多種2B型突變，這些突變都位于28號外顯子，且多數突變已被證明具有致病性。幾乎所有2B型突變為錯義突變，其中R1306W、R1308C、V1316M和R1341Q為熱點突變，約占2B型突變的80%[23]。這些突變位點與VWF多聚物減少和A1結構域的結合能力增強有關。Maas等[24]報道了一種特殊類型的2B突變P1266L，此突變與高分子多聚物水平和血小板減少無關。

2.2.32M型VWD 2M型VWD為常染色體顯性遺傳，其發病機制為A1結構域突變導致對血小板膜表面GPIb的親和力降低，RIPA減低，但VWF：Ag含量與多聚體分析正常。2M型VWD的突變類型包括錯義突變(93%)和缺失突變(7%)，其中多數突變發生在28號外顯子，其余的位于外顯子17，27，30，31和52。臨床上2M型很容易誤診為2A型，因為兩者的實驗室檢測結果相似。高分子量VWF的減少是2A型的重要特征，所以全面的表型分析有助于2M型和2A型的鑒別。此外，有研究發現A3結構域的錯義突變可使VWF與膠原蛋白的結合能力下降，進而削弱血小板的黏附能力，導致2M型VWD[25]。

2.2.42N型VWD 2N型VWD發病機制為VWF基因D’區和D3區突變，導致VWF結合FVIII的能力減弱，血漿FVIII失去保護而被降解，FVIII水平顯著降低(<10%)。目前所觀察到的2N型突變大約有60種，約95%為錯義突變，主要位于18～20號外顯子，另外一些位于4、9、17、24～27外顯子。不同于大多數常染色體顯性遺傳的VWD類型，2N型是隱性遺傳，兩個突變位點可以是純合的單一突變、不同的雜合突變、錯義突變與無效突變的雜合。不同突變類型可能會影響患者的FVIII水平。Michiels等[26]發現純合子p.Arg816Trp(R816W)突變通常與臨床嚴重的2N型VWD相關。另一項意大利的研究表明，純合子2N型VWD患者FVIII水平和VWF和FVIII：Ag比值明顯降低，而這些參數在復合雜合子中顯示正?；蚪咏27]。Casonato等[28]建議常規檢測VWF:FVIIIB，因為這不僅可以幫助可疑2N型VWD的診斷，還能防止誤診。2N型患者的臨床表現和實驗室檢查與輕/中度A型血友病幾乎相同，極易混淆，以往主要通過詳細的家族遺傳史或實驗室檢測VWF與FVIII結合能力(VWF:FVIIIB)來區分兩者，但隨著NGS的普及，對VWF基因上的FVIII結合位點進行測序可以做到準確診斷。

2.33型VWD 3型VWD非常罕見(<1%)，為常染色體隱性遺傳，主要是由于兩條VWF等位基因發生純合或雙重雜合突變導致血漿VWF完全缺乏和FVIII活性顯著降低(1%～9%)，患者通常伴有嚴重的出血表現。研究表明，除了傳統的隱性遺傳模式外，大約40%～50%的3型VWD還表現出共顯性遺傳[29]。國際血栓與止血協會科學標準化委員會的VWF基因突變數據庫中已報道了110余種不同的3型突變，包括插入、無義和錯義突變以及部分或全部VWF基因缺失。這些突變散布在整個VWF基因，其中28號外顯子突變占比最大，最常見的無義突變為R1659X。由于3型VWD患者的VWF基因存在眾多突變位點，這也直接導致了此型患者出血嚴重程度的差異性。加拿大一項對3型VWD患者進行出血評分的研究表明，VWFpp發生突變的患者比其他地方突變的患者出血更嚴重[29]。相比1型和2型VWD，3型VWD臨床表現嚴重、血漿VWF絕對缺乏、FVIII水平極低，從而更容易診斷。但是完善二代測序仍是必要的，特別是3型患者家庭計劃生育小孩時，NGS可以幫助全面了解父母的VWF基因，做到從源頭上控制致病基因的傳遞，防止缺陷兒的出生。

3 小結

VWD的診斷是一個臨床難題。盡管通過表型分析足以確定大部分患者的VWD類型，但表型分析不能充分解釋部分患者的病情，仍需要進一步完善基因測序。無論是診斷2N型VWD，還是鑒別2B型與2M型或PT-VWD，NGS都發揮出了其明確的優勢。3型VWF基因突變位點存在異質性，特別是VWF基因部分或全部缺失時，DNA測序不能提供有效診斷，可能還需要其他的診斷策略，如多重連接依賴式探針擴增技術[30]或cDNA Southern印跡法尋找異常的雜交特征。1型VWD突變位點在整個VWF基因的廣泛分布限制了NGS的效果，但在與其他類型的VWD鑒別時，基因測序仍然是排除潛在1C型或2型的最快方法。綜上，NGS高通量、快速、靈敏的特性補充了傳統測序方法的不足，在診斷和鑒別VWD方面有很高的臨床應用價值。未來，隨著測序技術的進一步發展，有望實現真正的個體化醫療，造福更多的患者。