刺激響應型水凝膠修復關節軟骨的研究進展

衡 田，趙安莉，陳泓汝，陳 攀，王睿松，張 馳，2 綜述 孫富華，2 審校

1.西南醫科大學康復醫學系（瀘州 646000）；2.西南醫科大學附屬醫院康復醫學科（瀘州 646000）

關節軟骨是覆蓋在關節表面的一層彈性組織，有吸收震蕩、緩沖應力、潤滑關節表面、防止磨損等重要作用，其損傷可能會導致關節功能惡化[1]。關節軟骨損傷來源于運動損傷、炎癥、衰老、腫瘤等多種因素，是一種退行性疾病。臨床研究表明，60%的膝關節鏡檢查病人表現為軟骨損傷，15%的60歲以上人群表現出軟骨損傷的臨床癥狀[2]。如軟骨損傷治療不及時或者治療方法不當，將會導致骨關節炎（osteoarthritis，OA）[3]。OA 雖然不是致命的疾病，但卻是致殘的主要原因，全球超過3.03億人面臨OA帶來的痛苦，給社會造了重大的經濟負擔[1]。

臨床上用于治療關節軟骨損傷的方法很多，主要分為保守治療和手術治療。保守治療主要包括藥物治療、減輕體重、改變生活方式、康復訓練、局部封閉、理療、支具保護等[4]。手術治療包括關節鏡下灌洗與清創術、軟骨下鉆孔與微骨折成形術、移植修復等[5]。然而這些治療方法只是暫時緩解癥狀，沒有再生軟骨的功能。由于關節軟骨不存在血管、神經和淋巴組織，出現缺損后難以自我修復[6-7]。因此，對損傷關節軟骨進行修復重建以恢復關節功能，在臨床治療中非常必要。

干細胞刺激、同種自體或異體移植等方法，會引起軟骨退化或二次傷害等[8]。利用組織工程技術將藥物、生長因子或者細胞與生物材料結合形成人工軟骨，使其具有類天然細胞外基質(ECM）的結構[9]，機械性能和微環境可與天然軟骨匹配，已成為軟骨修復的重要途徑[10-11]。水凝膠是一類具有彈性、表面光滑且含水量高的生物材料，通過物理或化學交聯可形成類ECM 的三維網絡結構，具有良好的生物相容性、親水性和生物可降解等特性[12-13]。關節腔注射富血小板血漿（PRP）是近年來臨床治療關節炎和軟骨損傷的新技術，但是力學強度差，生長因子釋放速度不可控等缺點使其在應用中仍受到限制[14]。水凝膠體系中，刺激響應型水凝膠是生物醫藥應用領域中最重要的類型。刺激響應型水凝膠不僅具有傳統水凝膠的特性，還具有可調控的環境刺激響應性，因此還被稱為智能水凝膠，已被廣泛用于制備可原位形成和生物降解的組織工程支架[15-16]。近些年來，刺激響應型水凝膠在組織工程領域得到了迅速發展，許多新型、有效的水凝膠材料被設計出來并用于制備組織工程支架[17]。本文根據刺激環境不同，從內部（組織環境）和外部環境刺激兩個方向，對刺激響應型水凝膠在關節軟骨修復中的應用進行介紹。

1 內部刺激型

1.1 pH響應型

pH響應水凝膠由聚電解質構成，其結構中含有酸性(羧酸或磺酸鹽)或堿性(銨鹽)基團[18]，這些基團可以根據pH變化而釋放或接受質子，從而使水凝膠發生性能的變化[19]。此類水凝膠主要分為兩類，一類帶有弱酸性基團，可隨pH 的升高而溶脹性能下降；一類則帶有弱堿性基團，可隨pH的下降而溶脹性能下降。這一特點使pH 響應型水凝膠已被用作智能藥物遞送系統治療軟骨損傷，可實現微創治療，將聚合物水溶液注射到病灶組織，通過組織部位pH刺激原位形成凝膠網絡結構[20]，達到緩釋藥物的功能，以減少病人痛苦及相關臨床并發癥，甚至構建成組織工程支架用于促進軟骨再生[21]。

WANG 等[22]利用甲基丙烯酸羥乙酯、乙烯基吡咯烷酮和甲基丙烯磷酸膽堿合成了一種pH 敏感型水凝膠，流動態聚合物可在pH為6.0～7.4范圍內轉化為凝膠態。研究中發現，該水凝膠體系可作為糖皮質激素的智能載體，對類似骨關節炎的炎癥環境具有一定的治療效果。另外，pH敏感型水凝膠還可以作為組織工程軟骨用于修復損傷部位。YU 等用[23]羧甲基殼聚糖(CMCS)和自主合成的動力劑Dy制備了新型水凝膠，其具有良好的pH 敏感膨脹性能及自愈合性能。這種水凝膠在不同的pH下表現出不同的溶脹性能，而且自我修復能力對環境沒有依賴性，可作為組織支架促進損傷軟骨修復。但目前pH 敏感型水凝膠在體內修復軟骨的研究還較少，有待進一步深入研究。

1.2 離子響應型

離子響應型水凝膠一般是利用聚合物流體對體內外離子強度的響應，實現由溶液向凝膠的形態轉變。目前，研究者一方面可以利用特制的水凝膠對體內離子的識別，實現水凝膠性能的調節或者目標藥物的靶向性；另一方面還可以在聚合物溶液中添加特定的離子，實現水凝膠的凝膠化，形成類軟骨基質結構，以促進軟骨再生。

關節軟骨損傷部位常伴隨內源性一氧化氮（NO）的出現，可以用NO 作為智能藥物釋放體系的觸發離子。XIONG等[24]利用二氫吡啶的衍生物對丙烯酰胺進行交聯處理，合成了一種新型的亞硝酸鹽（NO2-）響應的水凝膠。在大鼠關節炎模型中，體內不同濃度NO2-觸發下，實現水凝膠中藥物的按需釋放，有利于關節炎的治療。NO 的局部富集進一步會導致嚴重的炎癥反應，消耗過量的NO 是治療關節炎的一種方法。YEO等[25]合成了一種能夠消耗NO的智能丙烯酰胺水凝膠，可特定識別NO 并發生反應，通過清除NO 降低炎癥水平，并顯示出良好的生物相容性。通過小鼠骨關節炎模型發現，水凝膠可通過消耗NO有效治療關節炎。

海藻酸鹽作為一種常用的生物相容性良好、毒性低、凝膠能力強的生物材料，可以與鈣離子（Ca2+）發生反應形成穩定的凝膠。PARK 等[26]利用Ca2+作為觸發離子，海藻酸鹽/透明質酸鹽水凝膠可以調節ATDC5細胞的軟骨分化并維持軟骨細胞表型，可應用于軟骨再生。

1.3 電響應型

電響應型水凝膠以電流作為環境信號來誘導水凝膠的響應，溶液中的離子在電場作用下發生定向遷移，導致凝膠的內外兩側出現離子濃度差，繼而引起滲透壓的差異，促使水凝膠發生體積和性能的變化[27]。因而使用電活性支架和生物物理刺激（如電刺激和滲透刺激）修復關節軟骨組織可治愈因外傷、骨關節炎或運動相關損傷引發的軟骨缺損。

軟骨是一種帶有電荷的多孔結構，具有獨特的力學性能的結構組織。傳統的三維細胞培養環境無法表現出自然組織所表現出的復雜物理反應。在這項工作中，軟骨中帶電環境的復制是使用基于聚乙烯醇和聚丙烯酸的聚電解質水凝膠實現的[28]。微孔物理交聯冷凝膠的力學響應和形貌與由相同聚合物制成的熱處理化學凝膠進行了比較，這是pH依賴性膨脹的結果。與熱處理的化學交聯凝膠相比，物理冷凝膠的彈性模量隨著電荷激活和膨脹而增加，這可以解釋為在大電荷密度下聚合物鏈發生靜電硬化。同時，由于電荷的存在，這兩種材料對流體流動的滲透性都受到了損害。反應低溫凝膠所表現出的軟骨力學行為可以在其他聚電解質水凝膠體系中重現，用于制造用于組織修復的仿生細胞支架。

聚電解質水凝膠作為電響應型水凝膠的重要成員，可以用作脫細胞支架，以替代受損組織，也可以用作細胞種子成分，以促進軟骨組織的再生和形成。OFFEDDU 等[27]基于聚乙烯醇和聚丙烯酸合成的一種聚電解質水凝膠，和其中嵌入的膠原支架之間的滲透、靜電和界面現象與天然軟骨的力學行為類似，可用于軟骨細胞的3D培養，并利用其帶電環境實現軟骨的再生。FAROOQI 等[29]將水凝膠支架用作人工細胞外基質，并施加電刺激以促進缺陷部位的增殖，分化和細胞生長。提供了一種用于軟骨組織工程的電活性水凝膠的仿真模型，然后計算了電刺激對用作軟骨修復植入物的圓形水凝膠樣品的影響，并對軟骨組織和接種細胞的水凝膠支架的直接或間接電刺激進行了探究，研究發現通過對電刺激兩種類型的都可能對軟骨組織工程學方法有益。

2 外部刺激型

2.1 溫度響應型

溫度響應型水凝膠是指聚合物溶液在特定溫度條件中（一般是生理溫度）可轉變為凝膠狀態的生物材料，如聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）、殼聚糖（CS）和泊洛沙姆等[30-32]。此類水凝膠的三維網狀結構可利用溫度的變化進行調節，既可作為智能藥物遞送系統，又有利于細胞的負載和生長，在軟骨修復中具有獨特的優勢。

PAN等[14]將黑磷納米片（BPNs）摻雜于富血小板血漿（PRP）/殼聚糖水凝膠，制備了新型納米溫敏水凝膠。在近紅外照射下可控制BPNs降解產物的釋放，為成骨分化提供充足原料，促進骨組織再生。體內外研究發現，PRP 能有效改善間充質干細胞在殼聚糖熱敏水凝膠上的粘附，增加細胞容量。在小鼠關節炎模型中，水凝膠可控釋放的藥物可降低關節的水腫程度，良好的潤滑可減少摩擦保護關節軟骨。ROTHRAUFF 等[33]將胃蛋白酶可溶性脫細胞肌腱、甲基丙烯酸酯（GelMA）功能化軟骨細胞外基質與甲基丙烯酸/明膠溫度響應水凝膠作對照。當植入骨髓間充質干細胞(MSCs)并在軟骨細胞培養基中培養時，與非甲基丙烯酸ECM 水凝膠相比，甲基丙烯酸ECM 水凝膠的收縮較少。通過基因表達、生化成分和組織學分析，GelMA水凝膠在形成過程中，更有利于蛋白聚糖和II 型膠原的沉積。其作為軟骨組織工程，可以發揮與胃蛋白酶溶解軟骨和肌腱水凝膠相當功效的能力。

水凝膠類ECM 的三維結構有利于細胞的黏附和生長，可開發性能優異的軟骨組織工程支架。WANG等[34]用透明質酸（HA）修飾PNIPAAm 制備了一種可注射溫敏水凝膠。體外研究表明，兔脂肪干細胞（rADSC）在這種水凝膠中表現出更高的活力以及軟骨分化能力。進一步將負載rADSC的水凝膠注射到兔關節滑膜腔中，通過糖胺聚糖（GAG）和II 型膠原的組織形態染色結果發現，這種新型的載細胞水凝膠更有利于軟骨形成。MELLATI等[35]的研究也發現，利用CS和PNIPAAm 的共聚合成的溫敏型水凝膠可以模擬天然關節軟骨的帶狀組織。研究中將其作為間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的載體，微條紋環境可以調控細胞的排列和伸展。通過GAG 和膠原的組化染色發現，微圖案化區域可形成類軟骨淺表區結構組織，而沒有圖案的區域形成類似軟骨的中間區。利用溫敏型水凝膠裝載細胞，通過仿生結構設計，可構建模擬軟骨多區域的組織工程支架。

2.2 光響應型

光響應型水凝膠可在一定波長的光，如紫外光(UV)、可見光和近紅外光（NIR）等，誘導下交聯形成凝膠結構或發生降解，分為光交聯型水凝膠和光降解型水凝膠。光交聯型水凝膠因其較強的原位成型能力，與力學性能、生物相容性良好的膠原等材料配伍可與天然軟骨的力學匹配，常被用作制備組織工程支架[36]。

ZHOU等[37]利用明膠丙烯酸甲酯（GelMA），氧化葡聚糖（ODex）和明膠開發了一種雙網絡水凝膠(M-OG)，類似于天然軟骨ECM，該水凝膠可通過動態共價交聯和紫外（UV）光交聯，形成雙層交聯網絡，具有優異的力學性能和快速恢復能力。為模擬體內環境，研究中建立兔髕骨軟骨缺損模型，并將水凝膠填充在缺損處，組織學評估顯示其具有較強的粘附性和組織整合性。

為增強與原生軟骨組織的整合性，LIM等[38]利用三(2,2-聯吡啶)二氯釕(II)和過硫酸鈉作為引發劑，合成了一種可見光響應的雙功能化酪胺-甲基丙烯酰明膠(GelMA-Tyr)。將預水凝膠溶液在紫外光照射下注射到不規則軟骨缺損處，驗證了該水凝膠的擠壓打印性能和原位成型能力。通過與天然軟骨中的蛋白質結合，實現水凝膠與組織的整合性。因此，可以為軟骨的再生提供適宜的環境。

2.3 磁響應型

磁響應型水凝膠通常是指將磁性納米顆粒（MNPs）摻雜于聚合物水凝膠中制成的無機/有機復合材料，其同時兼有水凝膠的眾多優良特性和磁性材料的磁響應特性。通過外界磁場的刺激作用，磁性納米粒子在水凝膠內自由振動，調節網孔結構，調控生物相容性和藥物釋放速度，可促進軟骨修復[39-40]。

HUANG 等[41]以四氧化三鐵（Fe3O4）、聚乙烯醇（PVA）和Ⅱ型膠原（COLII）為原料，以一定的原料配比制備了新型磁性納米復合水凝膠。不同摻入量的Fe3O4使復合水凝膠表現出可調節的物理性能、溶脹性能和細胞相容性，Fe3O4/PVA/COLII的配比為5:95:5時，納米復合水凝膠具有良好的綜合性能，為臨床治療軟骨組織缺損提供了新的途徑。磁性納米粒子的存在同樣可調節細胞的生長行為。BONHOME-ESPINOSA等[42]制備了利用纖維蛋白-瓊脂糖水凝膠包埋磁性納米粒子制備出新型三維磁性生物材料。磁性納米顆粒的加入可以控制其溶脹性能，為人透明軟骨細胞體外存活和增殖提供適宜環境。因此在水凝膠中負載細胞構建透明軟骨樣工程組織，并可用于軟骨修復。

2.4 機械響應型

機械響應型智能水凝膠在軟骨修復中的應用仍處于起步階段。此類水凝膠在外部機械應力的刺激下，聚合物可在流動態和凝膠態之間轉變，觸發點相較與其他刺激簡單，易操作[43]。

LEONE等[44-45]利用羧甲基纖維素為基礎材料進行酰胺化處理，50%的羧基被轉化成氨基，流變學表征發現，交聯處理得到的水凝膠(CMCA)表現出粘彈性，使其可用于軟骨的填充。進一步的研究顯示，該水凝膠具有顯著的機械應力響應性能在去除機械應力后，水凝膠可以恢復其原始形狀，這一發現證明了它們具有可注射的潛力。通過體外研究發現，正常人關節軟骨細胞可以在該水凝膠上良好的生長，水凝膠上的軟骨細胞產生了更多的膠原蛋白和蛋白聚糖的細胞外基質成分。在兔軟骨損傷模型中，通過與透明質酸水凝膠作對比，組織學切片結果顯示，CMCA修復的缺損部位形成了一層混合纖維軟骨具有規則而光滑的表面，軟骨細胞在新的透明軟骨中呈現簇狀和柱狀，與天然軟骨類似。該水凝膠在體內修復軟骨缺損中具有良好的性能。

3 小結與展望

刺激響應型水凝膠因其良好的力學匹配性、生物相容性和獨特的智能調控性使其在軟骨修復領域得到廣泛應用。由于關節軟骨不含血管導致關節軟骨中營養交換或軟骨前體細胞循環受到限制，阻礙了受損區域的愈合過程，智能水凝膠為關節軟骨損傷的修復提供了新的方法，其可通過內外環境因素的刺激，在損傷部位完成原位填充。刺激響應性能及類細胞外基質結構可滿足智能給藥并促進軟骨修復，而生物可降解性可為再生軟骨提供充足空間，并通過新陳代謝排出體外，刺激響應型水凝膠實現了在時間尺度和空間尺度上對軟骨損傷的治療。此類水凝膠通常滿足以下性能：①與關節軟骨匹配的彈性模量；②促軟骨細胞ECM的形成，抑制肥大軟骨細胞的形成和礦化；③提供軟骨再生的空間和養分。

軟骨在發生損傷后體內環境的變化往往是微弱的，設計更靈敏的觸發點是pH、離子響應型水凝膠的重要發展方向。另外機械應力、磁和熱等觸發因子是從外部控制，如何更精準、適時施加刺激因子是應用中的關鍵。無論是內部還是外部刺激型水凝膠，單一的性能都難以滿足軟骨修復的臨床需求。因此，從材料設計角度，可開發多種觸發點型的水凝膠，如pH-溫度敏感型等，以適應關節軟骨修復不同階段的性能；從結構構建角度，可選擇合適的加工方式實現4D 打印，使其滿足不同的軟骨缺損形狀或程度的需要。

隨著醫學以及生物功能材料的發展，刺激響應型水凝膠在軟骨損傷中的應用不再局限于單一的藥物遞送，利用結構和性能的設計，使其在軟骨的缺損修復和功能替代方面擁有了廣泛的應用前景。

（利益沖突：無）