小反芻獸疫診斷技術

劉天梅

（青海省尖扎縣畜牧獸醫站，青海 尖扎 811200）

現階段規?；B殖中，由小反芻獸疫病毒引發的小反芻獸疫是一種“三高（高傳染、高發病、高死亡）”的RNA病毒性傳染病，在損害養殖戶經濟效益的同時也不利于畜牧業可持續發展目標的實現。鑒于此，本文主要系統化剖析了小反芻獸疫的流行病學，并就診斷技術展開了深入探討，以便于保證小反芻獸疫預防和消滅工作的高效化開展。

1 流行病學

小反芻獸疫的致病原為小反芻獸疫病毒，與其它病毒相比在形狀上，小反芻獸疫病毒多為粗糙的圓形或橢圓形，在pH5.75~9.6結構相對穩定，若周邊環境pH值低于4或高于11，則會失活。作為一種急性、烈性以及接觸性RNA病毒性傳染病，小反芻獸疫的致死率極高，是世界動物衛生組織規定的A類動物疫病類型。

2 臨床癥狀

小反芻獸疫的潛伏期通常為1周左右，發病后的臨床表現主要為體溫升高（高于41℃）、精神萎靡、眼角處有大量分泌物（漿液性逐漸變成膿性）、毛發凌亂、食欲不佳、口鼻干燥、口腔粘膜干酪樣病變、舌面和咽部潰瘍、舌背面糜爛、齒齦出現糜爛、口腔黏膜充血、流出大量流涎、乳頭壞死、血水樣腹瀉、孕動物出現流產。經剖析可知，患病的牲畜內部變化也極為明顯，具體表現為硬顎至網胃和瘤胃交界處出現潰瘍、盲腸和結腸結合處出現斑馬樣條紋、肺出血、淋巴結腫大以及脾壞死。

3 診斷技術

3.1實驗室診斷

3.1.1 AGID 在實驗室診斷中，與其它診斷技術相比，經濟性、便捷性是“AGID”診斷技術的顯著特點。在診斷時首先診斷工作人員可用病畜的腸黏膜、淋巴結等組織制備標準PPRV抗原，并通過高免牲畜獲得抗血清，再以“瓊脂凝膠”為媒介，將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠中，而后將其放在一定溫度下，待一段時間后查看是否有“與陽性對照抗原一樣的沉淀線”。這種診斷技術在應用時，往往只能檢測烈性PPR抗原，相對地由于溫和型PPR抗原本身含有較少的病毒含量，在進行檢測時難以出現與陽性對照抗原一樣的沉淀線。

3.1.2 捕獲酶聯免疫吸附試驗 小反芻獸疫病毒的結構蛋白主要包括N、P、M、F、H以及L，而捕獲酶聯免疫吸附試驗的檢測對象主要是病毒中的用多種抗N蛋白單克隆抗體。在檢測時，檢測工作人員可對牲畜糞便簡單化處理后進行檢測，特異性和敏感性是這種檢測技術的顯著優勢，但檢測成本相對較高也是這種檢測技術存在的現實問題。

3.1.3 CIEP 在病毒抗原檢測中，“CIEP”診斷技術的合理化應用具有便捷性的顯著特點。在檢測時，檢測工作人員可以水平電泳槽中（槽內裝滿0.1 mol/L醋酸巴比妥緩沖液）的凝膠為載體，在正極加血清、負極加抗原，電泳0.5h后左右觀察。這項技術在具體化應用時，雖然能快速檢測病毒抗原，但卻無法有效區分PPRV和牛瘟病毒的感染。

3.1.4 反轉錄聚合酶鏈式反應 在實驗室診斷中，“反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）”是一種常見的分子生物學檢測方法，與其它診斷技術相比，特異性、靈敏性是這種檢測技術的顯著優勢。在檢測時，檢測人員可設計三對位于F基因的引物進行RT-PCR擴增及擴增片段的T載體克隆、序列分析，而后在通過建立區分小反芻獸疫疫苗毒與基因四系野毒的RT-PCR檢測方法用以檢測病毒，但這種檢測方式在使用時卻存在漏檢病毒引物位點變異病毒的劣勢，增加了后期防治工作難度。

3.1.5 LAMP 在對小反芻獸疫診斷時，LAMP也是一種比較常用的方法。當前，有研究人員已經針對N基因的保守區域構建起了具體的檢測方法。在對反應體系進行優化之后發現，LAMP在檢測效率方面得到了顯著提升。通常來說，從核酸提取到檢測結果的獲取只需要60~80min。同時，隨著技術的進步LAMP在特異性和靈敏度方面展現出了明顯的優勢，即使出現同屬病毒和類似病毒也不會發生交叉反應。除此之外，LAMP還可以達到可視化的效果。操作時，首先要將小反芻獸疫病毒的RNA核酸提取出來，并使用分光光度來測定濃度，然后保存在-80℃的環境中。在按照試劑盒的說明書進行操作之后，要對小反芻獸疫病毒N基因序列進行生物信息學分析，并設計LAMP引物。最后通過最佳引物篩選試驗得到反應的最佳引物，之后可以根據實際需要開展特異性試驗和敏感性試驗。

3.1.6 IFAT IFAT指的是間接免疫熒光抗體試驗。在診斷小反芻獸疫病毒時，操作人員可以基于病毒特異性單克隆抗體來構建試驗，將感染發病早期和后期病料中的病毒抗原提取出來，完成鑒別和診斷。與此同時，技術人員還可以將重組小反芻獸疫病毒中的F蛋白作為抗原免疫基礎，制作多克隆抗體，以捕獲病料中的抗原。同時還需通過間接免疫熒光抗體試驗對小反芻獸疫病毒進行特異性診斷。

3.2血清學診斷

3.2.1 中和試驗 相比實驗室診斷，“血清學診斷”方式的使用不僅具有極高的診斷效益，與此同時在推動畜牧業可持續發展中也發揮了重要作用。作為國際貿易指定的試驗方式，“中和試驗”在具體化應用過程中，工作人員需嚴格按照如下診斷流程進行操作，即：經過滅活待檢血清倍比稀釋→加入103TCID50/mL的病毒懸液→置于37℃下1h→每個梯度中取出0.2mL混合物于轉管內→加入1mL Vero細胞懸液→置于37℃倒置培養→3d后棄去出現CPE的培養管→更換維持液→旋轉培養1周→檢測。這項檢測技術雖然具有靈敏、特異的優勢，但卻無法用以大規模臨床檢測。

3.2.2 分子生物學與膠體金技術 在血清檢測中，“特異性好、能夠檢測微量病毒”是“分子生物學與膠體金”診斷技術的顯著優勢，在檢測時，具體檢測作業流程如下：對小反芻獸疫病毒N基因的高度保守區設計兩條特異寡核苷酸探針→形成“生物素化探針-靶核酸-納米金探針”復合物通過生物素-親和素系統→固定在固相載體上→銀染放大信號。

3.2.3 酶聯免疫吸附試驗 （1）競爭酶聯免疫吸附試驗 當動物感染了小反芻獸疫病毒之后，它們的血清單體中會產生專門針對這種病毒的N蛋白和H蛋白。競爭酶聯免疫吸附試驗就是針對這兩種蛋白質而進行檢測的技術，它可以通過單克隆抗體的形式來完成檢測。與傳統的檢測方法相比，酶聯免疫吸附試驗具有方便、快捷的特征，即使是在野外也可以對大量的樣品進行診斷，敏感性為94.5%、特異性為99.4%。但競爭酶聯免疫吸附試驗無法對小反芻獸疫病毒和牛瘟病毒進行區分，因此需要其他的方法作為輔助來進行區分。（2）間接酶聯免疫吸附試驗 間接酶聯免疫吸附試驗在操作的時候要先將抗原吸附到酶標板上，然后向其中加入小反芻獸疫病毒的特異性血清。在經過孵育之后加入酶結合物和底物，并對血清中所含有的特異性抗體檢測。小反芻獸疫病毒中的N蛋白中，第454~472位的氨基酸序列呈現出了免疫原性，這是該病毒特異性的體現。與此同時，小反芻獸疫病毒的B細胞表位在第452~472的區域，該區域的多肽抗體可以對病毒進行特異性識別。間接酶聯免疫吸附試驗就是在這個基礎上所產生的，它可以將小反芻獸疫病毒和牛瘟病毒進行鑒別，實現了診斷效果的提升。但這種方法在實際操作的過程中容易受到其他蛋白的干擾和影響。（3）夾心酶聯免疫吸附試驗 在夾心酶聯免疫吸附試驗操作的過程中，需要先將待檢測樣品與特異性抗體融合，形成免疫復合物，然后將其與預先包被在酶標板上的捕獲抗體結合，在這之后就可以按照常規的方法，在樣品中加入酶結合物和底物檢測。這種檢測方法的原理是利用了小反芻獸疫病毒N蛋白表位的單抗。這種試驗方法的特異性能夠達到92.8%，敏感性則為90%左右，實驗結果的獲得時間通常在2h左右。

4 小反芻獸疫的預防

4.1免疫預防對小反芻獸疫防控，要堅持預防為主的原則。該病具有較強的感染性，一旦有動物發病，就會在短時間內傳染給其他動物，在不加控制的情況下會大規模的暴發。因此，養殖場要做好免疫預防的工作，通過接種小反芻獸疫疫苗的方式來達到免疫的效果?，F有疫苗的有效期通常為3年，相關人員需要按照規定的時間和流程來為養殖場動物接種疫苗，在疫苗到期的末端還要及時續免。

4.2加強疫情的排查與檢測在小反芻獸疫防治的過程中，地區防疫部門要發揮應有的作用，除了對養殖戶進行宣傳之外，還要定期做好疫情的排查和監測工作。根據小反芻獸疫在每5~6年會流行一次的情況，在流行區復發時間，防疫工作者需要做好疫情的監測與記錄，為養殖人員提供指導。同時，還要與屠宰部門相互配合，做好及時有效的檢測與預防。如果發現疑似病癥及時做好實驗室確診的工作。

4.3做好應急防控準備由于小反芻獸疫的傳染性比較強，在發生疾病時做好應急防控準備是十分有必要的。具體來說，防疫部門要提前構建起應急防控體系，在疫情發生之后啟動應急預案，對整個疫區進行隔離。對急性小反芻獸疫患病動物，要進行撲殺，并對尸體進行無害化處理。除此之外，還要對養殖場進行監督與管理，要求其做好殺菌與消毒的工作，避免疫情進一步的擴散。

5 結語

在牲畜規?；B殖中，小反芻獸疫診斷技術雖然已經十分成熟，但隨著疫病的頻發，為保證畜牧業的可持續發展，建立便捷、快速、安全的檢測體系落實檢測工作，是高效化預防“小反芻獸疫”的有效渠道。