海南降香黃檀（黃花梨）樹籽中總黃酮含量的超聲波輔助提取

傅琪彥 符秀娟 林麗珍 丁兆建

（1.海南職業技術學院 海南 ?？?570216；2. 瓊臺師范學院 海南 ?？?571127）

我國特有的瀕危藥用植物降香黃檀，其樹干和根的干燥心材是一味珍貴的傳統中藥降香，含有的主要成分為黃酮類化合物。眾所周知，降香黃檀樹齡達10年左右開始形成心材，轉化速度慢，20~30年后才有一定收獲價值；但其一般5年就可開始結籽，之后每年均可收獲，不像獲取心材那樣需要砍伐林木。降香黃檀籽在海南民間也像心材那樣被普遍利用，具有降血壓血脂、舒筋活血和鎮痛消炎等功效，然而，對降香黃檀樹籽中黃酮類成分的提取和利用的研究仍不多見。

本文應用超聲波提取法，以降香黃檀樹籽為研究對象，對其中黃酮類成分進行提取分離和測定，研究提取工藝參數如乙醇濃度、溶劑用量、超聲作用時間、提取溫度和提取次數對提取得率的影響，探索一種快速簡便的降香黃檀籽黃酮提取方法，挖掘降香黃檀的應用價值，為其開發利用提供科學依據，從而有效保護海南降香黃檀的林木資源。

1.實驗材料與儀器

實驗用的降香黃檀樹籽在海南省屯昌縣采集，挑選其中粒大飽滿完好無損的樹籽，烘箱烘干后整理，然后粉碎過60目篩，粉末在4℃環境密封保存。

主要儀器：普析UV-1810APC紫外可見分光光度計、SDO-1018T超聲波發生器、BL-200型高速多功能粉碎機、TDL-50B型 臺式離心機、DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱。

藥品：蘆?。藴势罚?，95%乙醇（分析純）、硝酸鋁、亞硝酸鈉等。

2.實驗方法

2.1 提取工藝

將上述得到的降香黃檀籽粉末浸泡到不同濃度、不同溶劑用量倍數的乙醇溶液中，不同溫度下水浴加熱于超聲波發生器中，進行不同功率和時間的超聲波作用，所得溶液用離心機在4000r/min條件下作用15分鐘，上清液抽濾后，定容得到所需的提取液。

2.2 降香黃檀籽中含有黃酮類化合物的確定

取 1.0g 降香黃檀籽粉末，加入95%乙醇25.0mL在65℃中超聲提取30min，離心后取適量的上清液于兩支試管中，分別進行鹽酸-鎂粉反應和三氯化鐵反應，看是否有黃酮類化合物的特征顯色反應。降香黃檀籽醇提取液加入鹽酸-鎂粉后顯紅色，加入 5%三氯化鐵醇溶液后出現深褐色沉淀，表現出明顯的黃酮類化合物的特征顏色反應。對照試驗排除了假陽性。

2.3 分光光度計波長范圍的確定

用 50%乙醇溶解精確稱取的20mg 蘆丁標準品，定容至 100mL，得到 200μg/mL 的蘆丁標準溶液。另在50mL 50%乙醇中加入3.00g 降香黃檀籽粉末，于65℃超聲提取30min，離心后取上清液，再重復將濾渣層提取一次，合并兩次提取液，定容至 100mL。

取上述 1.0mL蘆丁標準溶液和 1.0mL 降香黃檀籽提取液，分別加入0.3mL 5%NaNO2溶液，搖勻后靜置 6min，加入 0.3mL 10% Al（NO3）3溶液，再搖勻后靜置6min，加入 4.0mL 4%NaOH 溶液，50%乙醇定容至 10mL，放置10min，用分光光度計測量460～550nm范圍內的吸光值。

結果表明，在堿性條件下蘆丁和降香黃檀籽黃酮提取液與NaNO2-Al（NO3）3-NaOH生成紅色鋁螯合物，其在510nm波長附近都有最大吸收峰。實驗發現，上述供試品的吸光值在30min內較穩定，之后吸光值下降較快。為得到穩定可靠的吸光值，本實驗在加入顯色劑10min內測定，選取測定的吸收波長為 510nm。

2.4 標準曲線的繪制

取2.3節中配制的蘆丁標準溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，分別置于不同的10mL容量瓶中，然后依次加入0.3mL 5%NaNO2溶液、0.3mL 10%Al（NO3）3溶液，最后再加入4.0mL 4%NaOH 溶液，每種溶液加入后均需搖勻并靜置 6min再加入后一種溶液，最后用50%乙醇定容至刻度，搖勻放置 10min。

準備好的樣品用分光光度計在 510nm波長處測吸光度，以空白溶液為參比，作蘆丁濃度-吸光度標準曲線（見圖 1），得回歸方程y=0.0112x-0.0003，R2=0.9982。式中y為吸光度A值，x為蘆丁濃度C（μg/mL），測定范圍為 10～60μg/mL。

圖1 蘆丁濃度與吸光度標準曲線

2.5 原料中總黃酮得率的測定 方法

為了測定降香黃檀籽中黃酮（包括黃酮 、異黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇、雙黃酮等）的總含量，可使黃酮結構中相鄰羰基、羥基與金屬離子絡合而顯色，根據顯色深淺，即吸光度A值大小，依據蘆丁標準品曲線建立的回歸方程，計算總黃酮含量。

精密稱取5.0g降香黃檀籽樣品粉末，浸泡于一定濃度乙醇溶液60min，而后在水浴中進行超聲波提取，離心，上清液減壓抽濾，收集濾液，用50%乙醇溶液定容，制得供試品溶液，測其在510nm吸收波長下吸光度A。用2.4節的蘆丁標準曲線回歸方程計算供試品溶液中總黃酮濃度C（μg/mL），從而計算超聲波輔助提取降香黃檀籽粉末中總黃酮得率W %。

式中：W%—供試品中提取總黃酮的得率（%），C—供試品溶液中總黃酮的濃度（μg／mL），n—稀釋倍數，V—供試品溶液定容體積（mL），m—降香黃檀籽粉樣品的質量（g）。

3.結果與分析

運用單因素試驗法研究影響得率的工藝關鍵參數，測量了各參數與總黃酮提取得率的關系。稱取5.0g降香黃檀籽樣品粉末，固定其他條件，分別考 察單因素，如乙醇濃度（20%、40%、50%、60%和80%）、樣品粉末 與 溶 劑 用 量（10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍）、超聲波功率（120W、130W、140W、150W、160W、170W、180W）、超聲作用時間（10、20、30、40和50min）、提取溫度（35、45、55、65、75℃）和提取次數（1-3次）對總黃酮得率的影響。

3.1 乙醇濃度的影響

在固定其他條件時，分別考察影響總黃酮得率的關鍵單因素乙醇濃度（20%、40%、50%、60%和80%），按照2.5節的方法操作，計算得率。

由圖2可見，隨著乙醇濃度從20%逐步增加，降香黃檀籽總黃酮的得率也快速增加，得率最大值對應的乙醇濃度為60%；當乙醇濃度繼續增加并升至70%時，總黃酮提取得率反而緩慢降低。因此選定60%乙醇作為降香黃檀籽總黃酮的最佳提取溶劑濃度。分析原因認為主要是提取溶劑極性發生變化造成的影響，根據相似相溶原理，只有在一定的極性即合適的乙醇和水的混合比例下，黃酮類成分才能比較充分地溶解出來。

圖2 乙醇濃度對提取降香黃檀籽總黃酮得率的影響

3.2 提取溶劑用量的影響

在固定其他條件時，分別考察樣品粉末與溶劑用量（10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍）與降香黃檀籽總黃酮得率的關系。

隨著溶劑用量從10倍逐步增加，總黃酮的得率也快速增加，得率最大值對應的溶劑用量為25倍；當溶劑用量繼續增加并達到30倍，總黃酮得率仍有所提高。通常認為，提取過程中乙醇溶劑量越大，有效成分越能充分溶解，因此提取量也越大。圖3中當溶劑用量大于30倍，得率曲線趨緩并形成平臺，是因為此時有效成分的溶解和擴散已達到平衡，增加乙醇溶劑不會增加有效成分的溶解，反而是增加了溶劑成本以及后續工藝中提取液的過濾濃縮和溶劑回收難度。當選定60%乙醇作為降香黃檀籽總黃酮的最佳提取劑濃度時，最佳溶劑用量選擇為25倍。

圖3 提取溫度對黃酮得率的影響

3.3 超聲功率的影響

固定其他條件時，分別考察超聲功率（120W、130W、140W、150W、160W、170W、180W）與降香黃檀籽總黃酮得率的關系。

當功率在120W到180W之間變化時，得率在一定范圍內波動，趨勢變化不大，說明超聲功率的大小對黃酮得率的影響不大?？梢赃x取較低的120W常見功率進行提取。

3.4 超聲作用時間的影響

在固定其他條件時，分別考察超聲作用時間（10、20、30、40和50min）與降香黃檀籽總黃酮得率的關系。

當提取時間從10min增加至 30min 時總黃酮得率顯著提高，當提取時間超過30 min后總黃酮得率曲線顯示出緩慢變化的平臺。與溶劑用量增加的變化規律相似，當提取時間超過30min 后，黃酮類化合物在料液之間的傳遞基本達到動態平衡，繼續增加提取時間不會有更多有效成分析出，因而得率增加的效果不大。綜合考慮總黃酮的得率及提取時間成本，降香黃檀籽總黃酮的最佳提取時間選定為30min。

3.5 提取溫度的影響

在固定其他條件時，分別考察提取溫度（35、45、55、65、75）與降香黃檀籽總黃酮得率的關系。

圖3可見，提取溫度對總黃酮得率影響較大的溫區在35℃至65℃之間，此時隨溫度提升總黃酮得率提高得較快，但溫度超過65℃之后提取效果的增加就不大明顯了。因為，適當高的溫度可以促進植物組織軟化和膨脹，蛋白質和酶易被破壞和凝固，增加有效成分的溶解及擴散速度，有利于有效成分的提取。但溫度過高，會造成料液中一些熱不穩定成分的氧化和破壞。對比數據可以認為，降香黃檀籽總黃酮的最佳提取溫度為65℃左右。

3.6 提取次數的影響

在固定其他條件時，分別考察提取次數（1~3次）與降香黃檀籽總黃酮得率的關系。結果表明，要獲得較高的降香黃檀籽總黃酮得率，需要進行至少2次提取。第1次的得率為 3.12%，原料中剩余的黃酮類成分還較多；在第2次提取時得率達到 3.64%，此時原料中黃酮類成分已剩余不多。而提取3次時總黃酮得率幾乎沒有太多增加。因此，選定降香黃檀籽總黃酮的最佳提取次數為2次。

4.結論

對海南降香黃檀（黃花梨）樹籽中總黃酮含量進行超聲波輔助提取的優化測試，運用單因素試驗法獲得了提取工藝的關鍵參數。實驗中采用紫外分光光度計，以蘆丁作標準品，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 作顯色劑，建立了降香黃檀籽總黃酮含量的簡易測定方法。運用單因素試驗法獲得優化的關鍵工藝參數為：乙醇濃度為 60%、溶劑用量為25倍、提取時間為3 0min、提取溫度為65℃、提取次數 2次。在這一條件下，降香黃檀籽總黃酮的最高得率能達到 3.64%。查詢文獻，不同來源的降香總黃酮含量為2.51%~5.82%。因此，與降香黃檀心材相比，黃酮含量較高的降香黃檀籽是一種未被利用的原料，其黃酮類化合物需要進一步研究以便開發利用。

超聲波輔助提取具有高效、節能和工藝簡單的優點，充分利用總黃酮含量較高的降香黃檀籽，將有利于提升對海南降香黃檀林木資源的保護。