LAMA3在泛癌中的表達水平及其與泛癌預后、免疫微環境的相關性分析

張夢杰，劉俊麗，楊 娜，楊 玲，韓繼明*

（1.延安大學醫學院，陜西 延安 716000；2.空軍軍醫大學生物化學與分子生物學教研室，陜西 西安 710032）

層粘連蛋白是基底膜的重要組成部分，對調控腫瘤的黏附和遷移具有重要作用［1］。層粘連蛋白332（Laminin 332，LM332）是層粘連蛋白中研究最多的亞型，包含α3、β3和γ2［2］。α3亞基由基因層粘連蛋白3（Laminin subunit alpha3，LAMA3）編碼，該基因變異會影響LM332異源三聚體的組裝，進而影響層粘連蛋白的生物活性［3］。并且在前列腺癌患者中LAMA3基因表達沉默，在卵巢癌患者中LAMA3基因表達低于正常組織［4］。此外，研究［5-6］證明LAMA3基因在鱗狀細胞癌中的高度表達可能與腫瘤的侵襲性增加有關。盡管LAMA3與腫瘤之間的關系得到廣泛的關注，但是在多種腫瘤預后及免疫微環境調控中的作用目前仍不清楚。本研究首先分析LAMA3在泛癌中的表達水平；其次研究LAMA3在泛癌中的預后價值；然后分析其與腫瘤浸潤免疫細胞（tumor-infiltrating immune cell，TIIC）、腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）和微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）之間的相關性，并進行免疫基因共表達分析。

1 材料與方法

1.1 LAMA3在泛癌中的差異表達

通過基因型和基因表達量關聯數據庫（The Genotype-Tissue Expression，GTEx）、腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫、以及癌癥細胞系百科全書（The Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）獲取泛癌數據并提取相應的臨床信息，使用R包中的RMA功能，過濾整個數據，刪除缺失和重復的結果，并通過log2（TPM+1）進行轉換。

1.2 LAMA3表達與泛癌患者預后的相關性分析

預后分析數據從TCGA數據庫和國際腫瘤基因組聯盟（The International Cancer Genome Consortium，ICGC）數據庫下載，分析了LAMA3在33種腫瘤中的表達與總生存率（overall survival，OS）的關系。根據LAMA3表達值的中位值，將患者分為LAMA3高表達組和低表達組后，采用Kaplan-Meier法繪制各腫瘤患者的生存曲線。

1.3 LAMA3表達與泛癌中腫瘤浸潤免疫細胞的相關性分析

LAMA3表達與泛癌免疫浸潤細胞的相關性通過腫瘤免疫估計資源2.0（TIMER2.0；//http：//timer.cistrome.org/）數據庫進行分析。

1.4 LAMA3表達與TMB和MSI之間的相關性分析

從TCGA數據庫下載泛癌的TMB和MSI信息，TMB計算的是每種腫瘤中每百萬堿基對的總突變率，MSI計算的是每百萬堿基對重復序列缺失或插入的總發生率。使用“cor.test”命令分析LAMA3與TMB及MSI的相關性，并繪制雷達圖。

1.5 LAMA3與免疫檢查點基因的共表達分析

LAMA3表達與免疫檢查點基因的共表達分析采用R包的“limma”進行，并通過R包繪圖。

1.6 統計學方法

采用Wilcox秩和檢驗分析泛癌中LAMA3的表達差異。采用對數秩檢驗評估預后分析Kaplan-Meier曲線之間的差異。采用Spearman檢驗評估LAMA3表達與免疫細胞浸潤評分、TMB和MSI之間的相關性。采用Person檢驗評估LAMA3表達與免疫基因表達之間的相關性。采用R軟件（版本4.1.0）進行統計分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。所有圖表均通過R包“ggplot2”和“forestplot”繪制。

2 結果

2.1 泛癌中LAMA3 mRNA表達的差異

本研究首先分析了LAMA3在正常人不同組織中mRNA的表達水平，結果表明LAMA3在31種正常組織中表達且表達水平差異較大，在血液和脊髓中幾乎不表達，在肺、子宮和陰道中的表達水平最高，在其它組織中的表達水平接近（圖1A）。并且LAMA3僅在21種腫瘤細胞系中表達，與正常組織的表達范圍相比較窄（圖1B）。與癌旁組織相比，LAMA3在浸潤性乳腺癌（invasive breast cancer，BRCA）、結腸癌（colon adenocarcinoma，COAD）、膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、前列腺癌（prostate adenocarcinoma，PRAD）、子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）中顯著低表達，而在膽管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）、食 管癌（esophageal carcinoma，ESCA）、頭頸鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、腎乳頭狀細胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）、肝細胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）、胃腺癌（stomach adenocarcinoma，STAD）中顯著高表達（圖1C）。結合TCGA和GTEx數據庫的泛癌數據進行分析，27種腫瘤中有22種表達差異顯著。與正常組織相比，LAMA3在BRCA、GBM、腦低級別膠質瘤（brain lower grade glioma，LGG）、LUAD、卵巢漿液性囊腺癌（ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）、PRAD、皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）、睪丸生殖細胞腫瘤（testicular germ cell tumors，TGCT）、甲狀腺癌（thyroid carcinoma，THCA）、UCEC、子宮癌肉瘤（uterine carcinosarcoma，UCS）腫瘤組織中顯著低表達，而在CHOL、COAD、ESCA、HNSC、腎嫌色細胞癌（akidney chromophobe，KICH）、KIRC、KIRP、急性髓細胞樣白血?。╝cute myeloid leukemia，LAML）、LIHC、PAAD、STAD腫瘤組織中顯著高表達（圖1D）。

圖1 LAMA3在各種組織和腫瘤中的表達水平

2.2 LAMA3表達與泛癌患者預后的相關性分析

本研究進一步分析了LAMA3與泛癌患者預后OS之間的關系。Kaplan-Meier生存曲線顯示，LAMA3高表達與6種腫瘤預后不良密切相關，包括膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）（OS：P＜0.05）、宮頸鱗癌和腺癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC）（OS：P＜0.05）、HNSC（OS：P＜0.05）、LAML（OS：P＜0.000 1）、LUAD（OS：P＜0.000 1）和PAAD（OS：P＜0.000 1）（圖2）。

圖2 LAMA3與泛癌預后顯著相關的Kaplan-Meier生存曲線

2.3 LAMA3表達與腫瘤浸潤免疫細胞的相關性分析

本研究通過TIMER2.0分析了泛癌中LAMA3表達與腫瘤浸潤免疫細胞的相關性。結果顯示LAMA3與多種免疫細胞浸潤程度呈正相關，包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的浸潤評分，其中顯著相關性最高的腫瘤類型分別為COAD、PRAD、SKCM（圖3），表明LAMA3的高表達可能與免疫細胞增加的浸潤水平有關。

圖3 LAMA3 mRNA表達與TIIC的相關性

2.4 LAMA3表達與TMB和MSI的相關性分析

在腫瘤的研究中，TMB和MSI都是有效的預后預測標志物和免疫治療反應指標。本研究進一步探討了LAMA3表達與TMB和MSI之間的關系，結果顯示LAMA3表達與11種腫瘤的TMB存在顯著相關性，與BLCA（P＜0.05）、BRCA（P＜0.05）、CESC（P＜0.05）、DLBC（P＜0.05）、HNSC（P＜0.05）、LGG（P＜0.05）、PRAD（P＜0.05）、SKCM（P＜0.05）、THCA（P＜0.05）呈負相關；與PAAD（P＜0.05）、THYM（P＜0.05）呈正相關（圖4A）。其中DLBC系數值最低，THYM系數值最高，說明LAMA3表達與DLBC的低突變狀態呈正相關，與THYM的高突變狀態呈正相關。LAMA3表達與MSI相關性分析表明，有6種腫瘤的MSI與LAMA3表達水平存在顯著相關性，如DLBC（P＜0.05）、GBM（P＜0.05）、HNSC（P＜0.05）、LGG（P＜0.05）、LUSC（P＜0.05）、SKCM（P＜0.05）。其中LAMA3表達與GBM、LUSC和LGG呈正相關，與DLBC、HNSC和SKCM呈負相關（圖4B）。

圖4 LAMA3 mRNA表達水平與泛癌TMB和MSI的相關性

2.5 LAMA3表達與免疫檢查點基因的共表達分析

本研究進一步通過基因共表達分析探討LAMA3與免疫相關基因之間的關系，結果顯示共有47個免疫檢查點基因與LAMA3共表達（圖5）。LAMA3在泛癌中的表達與OS均有顯著的相關性，在HNSC、LUAP、PAAD中LAMA3表達與CD44和CD276均呈正相關。并且在COAD中LAMA3表達與39種免疫檢查點基因間有顯著的共表達，與其中38種免疫基因呈正相關性；與腫瘤壞死因子TNFRSF25呈負相關。即LAMA3可能通過調節免疫檢查點活性來調控腫瘤免疫應答。

圖5 LAMA3 mRNA表達水平與免疫檢查點基因共表達的相關性分析

3 討論

研究結果表明LAMA3在不同組織中廣泛表達，在血液和骨髓中幾乎不表達，在肺中表達水平最高?？紤]到層粘連蛋白的作用，LAMA3在血液和骨髓中幾乎不表達屬于正?，F象。與正常的組織相比，與骨髓相關的癌細胞系LAMA3表達水平上調。結合TCGA和GTEx數據集的泛癌數據進行分析，研究發現LAMA3基因PAAD、COAD等腫瘤中顯著高表達，在BRAC、LUAD等腫瘤中顯著低表達。預后相關分析顯示，在LAML、PAAD中，LAMA3的高表達與患者的預后不良有關。已有研究發現LAMA3在卵巢癌中的表達水平低于正常組織和癌旁組織［4］。另一項研究發現LAMA3在胰腺癌中顯著高表達并與不良預后密切相關［6］。除此之外，研究證明LAMA3是口腔癌的早期標志物［7］。這些研究結果與本文分析結果一致?？傊?，LAMA3可能作為腫瘤早期診斷，或者評估患者預后風險的指標。

腫瘤浸潤性淋巴細胞是反映前哨淋巴結狀態和患者存活的獨立預測因子。研究結果顯示LAMA3的表達與多種腫瘤的免疫細胞浸潤顯著相關，評分最高的是COAD、PRAD、SKCM。腫瘤中免疫細胞的浸潤程度能夠影響腫瘤的治療效果，并且在乳腺癌中可用于腫瘤的風險分級［8］。在腫瘤的研究中，TMB和MSI都是有效的預后標志物和免疫治療反應指標，能夠指導COAD患者的臨床治療［9］。本研究發現LAMA3的表達與11種腫瘤的TMB和6種腫瘤的MSI有關。TMB能夠通過T細胞引發適應性免疫反應，通過增加新抗原表達來增強腫瘤免疫反應［10］。此外，MSI-H腫瘤中PD-L1的表達水平升高，尤其是在腫瘤浸潤免疫細胞上［11］。因此LAMA3基因可能通過影響TMB和MSI進一步調節腫瘤免疫，成為免疫治療新的靶點和評價免疫治療效果的重要指標?；蚬脖磉_分析結果表明LAMA3可能通過與多種免疫檢查點基因相互作用來調節腫瘤免疫。已有研究證實，TNFRSF9激動劑與PD-L1單抗聯合使用可以有效地激活和擴增腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞，增強對腫瘤的控制和殺傷，參與各種腫瘤的調控，包括PAAD和LIHC［12］。綜上所述，LAMA3可能通過與多種免疫細胞相互作用參與腫瘤的發生發展。

總之，LAMA3在泛癌中的差異表達與腫瘤患者的生存率有關，特別是在PAAD中，并且與TMB、MSI、TIIC和多種免疫相關基因密切相關。因此本研究推測，LAMA3不僅可作為泛癌的預后指標，還能作為免疫治療反應評估的生物標志物。