水稻qPC1基因啟動子功能性變異位點的鑒定及其轉運功能

彭 波,邱 靜,彭 娟,何璐璐,孔冬艷,孫曉宇,劉 巖,阿新祥,靳可心,孫艷芳,龐瑞華,周 偉,趙金會,汪全秀

(1. 信陽師范大學生命科學學院/大別山農業生物資源保護與利用研究院,河南 信陽 464000;2. 信陽市植保植檢站,河南 信陽 464000;3. 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所/農業部云南稻種資源觀測實驗站,昆明 650223)

【研究意義】水稻是世界上最重要的糧食作物之一,全球有超過一半的人口且我國有近2/3的人口以稻米為主食[1-2]。稻米蛋白質是優質蛋白,是人類能量及營養物質的重要來源,改良稻米的營養品質對于改善人類自身的營養與健康具有重要作用。前期,Peng等[3]采用圖位克隆策略,已分離克隆到一個正調控水稻種子蛋白質含量的功能基因qPC1(又稱OsAAP6基因),且發現qPC1基因的功能性自然遺傳變異位點集中在其啟動子區的順式作用元件,但尚不清楚其功能性變異位點及其分子調控機制。進一步進行大田試驗,其結果表明在一定范圍內,增加田間氮肥濃度,qPC1基因有利于提高水稻籽粒中的氨基酸含量與蛋白質含量,進而改善稻米的營養品質[4]。因此,針對水稻重要品質性狀qPC1基因,鑒定其功能性變異位點,開發qPC1分子標記,并探討其轉運功能,為深入揭示qPC1分子調控機制,進而利用qPC1基因開展優質水稻新品種的分子設計育種具有重要的理論意義與潛在的育種價值?！厩叭搜芯窟M展】過去幾十年,稻米品質方面的理論研究取得了重要進展,主要圍繞其遺傳基礎與分子調控機理、稻米品質的影響因素與分子改良、基因的分離克隆與功能解析等方面[5-10]。相對于水稻產量不斷提高,優質稻米遺傳改良的育種實踐相對進展緩慢。這是因為稻米品質性狀是一個復雜的數量性狀,同時受多個基因與環境因素的共同影響[2,11-13]。因此,培育優質水稻新品種是目前國內外育種學家共同追求的重要目標之一。水稻qPC1基因屬于氨基酸轉運蛋白基因家族中的一員,氨基酸轉運蛋白是一類能夠介導氨基酸跨膜轉運的膜蛋白,在植物生長發育過程中發揮著重要功能[14-16]。目前,針對擬南芥中的轉運蛋白研究較多,其中研究最深入的是氨基酸透性酶(Amino acid permease, AAP)家族和類似賴氨酸和組氨酸轉運蛋白(Lysine-histidine-like transporters, LHTs)家族,這些家族成員參與了擬南芥體內多種生長發育過程[17-18]。在水稻中,氨基酸轉運蛋白基因家族有85個成員,分布于水稻的12條染色體上[19]。其中,氨基酸通透酶參與調控水稻的產量及其品質等多種生物學性狀。如OsAAP1、OsAAP3、OsAAP4和OsAAP5與水稻產量性狀密切相關[21-23]。qPC1(OsAAP6)可影響水稻中多種氨基酸的分布,是水稻種子蛋白質含量和營養品質的正向調節因子[3-4]。OsAAP7和OsAAP10在水稻中均參與氨基酸的轉運,且在OsAAP10突變體中直鏈淀粉含量與食味值顯著下降[24-25]。OsAAP14和OsAAP15參與調控水稻產量,且OsAAP15能夠提高極端氮濃度下水稻的產量,可能在水稻育種中具有重要的應用前景[26-27]。水稻OsAAP16在根、葉、花和種子中高表達,并參與轉運多種氨基酸[24]。因此,OsAAPs參與了水稻根系中氨基酸的吸收與轉運,并參與調節水稻的產量與品質?！颈狙芯壳腥朦c】前期,Peng等[3]通過qPC1基因啟動子一系列5’端缺失DNA片段與GUS基因融合表達分析,并對qPC1基因5’-UTRs和啟動子區域(～1.8 kb)進行比較測序,結合197份來自廣泛地理范圍的水稻種質資源材料中的種子蛋白質含量測定,結果發現qPC1基因5’-UTR的3個潛在順式元件所在的兩處變異位點(-7～-12 bp、-32 bp)似乎與水稻種子蛋白含量緊密相關?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用基因定點突變、水稻原生質體瞬時轉化技術和雙熒光素酶報告法鑒定qPC1基因啟動子功能性變異位點,并利用缺陷型酵母互補試驗與水稻根部氨基酸吸收試驗解析qPC1的轉運功能,以期為水稻新品種的分子設計育種提供新的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

缺陷型酵母互補試驗使用酵母菌株24433c和22Δ8AA(中國農業大學李學賢教授課題組惠贈),以及酵母載體pDR195。TA克隆載體pMD18-T和EscherichiacoliDH5α購自Solarbio公司;本研究前期已獲得水稻qPC1超量表達陽性[OX(+)]和對照[OX(-)]材料,qPC1抑制表達陽性[RNAi(+)]和對照[RNAi(-)]試驗材料,以及珍汕97與南洋占重組自交系群體[3, 28]。其中,珍汕97為秈稻品種(OryzasativaL. ssp.indica),南洋占為粳稻品種(OryzasativaL. ssp.japonica)。

1.2 試驗方法

1.2.1 雙熒光素酶報告載體的構建 根據載體pGreenII 0800-LUC多克隆位點特征(SmaI-BamH I-SpeI-XbaI-NotI-SacII),結合qPC1基因啟動子定點突變序列特征(表1),選擇BamH I和NotI兩個酶切位點分別加到qPC1啟動子5’引物端和3’引物端。利用Primer 5.0軟件設計并檢測引物(表2)。分別以珍汕97和南洋占幼嫩水稻葉片為材料,采用PCR法擴增目的序列以及定點突變序列,并分別連接到pGreenII 0800-LUC載體。將上述連接產物轉化至DH5α中,擴繁并提取質粒pGreenII 0800-LUC-1、pGreenII 0800-LUC-2、pGreenII 0800-LUC-3、pGreenII 0800-LUC-4,即得到最終雙熒光素酶報告載體。

表1 qPC1基因定點突變序列

表2 qPC1基因定點突變引物

1.2.2 水稻原生質體的分離及轉化 取出20～30棵遮光條件下生長9～12 d的中花11水稻幼苗,切除根部后,將水稻幼莖切成0.5 mm長后迅速置于0.6 mol/L甘露醇中平衡10 min后提取其原生質體。分別吸取10 μL質粒(pGreenII 0800-LUC-1、pGreenII 0800-LUC-2、pGreenII 0800-LUC-3、pGreenII 0800-LUC-4)加至無菌的1.5 mL離心管中,然后緩慢輕柔加入100 μL原生質體懸浮液,輕輕旋轉混勻。緩慢沿著離心管壁加入110 μL PEG-CaCl2溶液,將4種質粒分別轉入中花11原生質體內,室溫避光培養12～16 h。

1.2.3qPC1基因啟動子活性檢測 根據熒光素酶報告基因檢測試劑盒E1910(Premega公司)說明書,將原生質體離心,然后每管加入100 μL 1×PLB后劇烈震蕩、破碎細胞。螢火蟲熒光測定:12 000 r/min,離心5 min,取10 μL上清液置于預處理過的96孔白色酶標板中,每孔細胞加入LAR II 50 μL,吹打混勻。將96孔白色酶標板放入酶標儀中測定熒光,保存數據并導出。海腎熒光的測定:移出酶標板,向每孔細胞中加入Stop &Glo?Reagent 50 μL,吹打混勻。將96孔白色酶標板放入酶標儀中測定熒光,保存數據并導出。試驗設置空白對照,空載體對照,生物學重復3次,技術重復4次。數據處理:每個孔的熒光值(相對活性)=螢火蟲熒光值/海腎熒光值。根據檢測pGreenII 0800-LUC-1、pGreenII 0800-LUC-2、pGreenII 0800-LUC-3、pGreenII 0800-LUC-4在水稻原生質體內熒光素酶報告基因的表達活性,間接測定對應qPC1啟動子活性。

1.2.4 缺陷型酵母表達載體的構建 根據qPC1基因cDNA序列,在qPC15’引物端和3’引物端分別添加限制性內切酶NotI與BamH I序列,采用Bio XM軟件設計對應的引物,其引物序列qPC1-F:5’-ATTTGCGGCCGCGAGTATGGACGTGGAGAAGGT GGAGA-3’,qPC1-R: 5’-CGCGGATC CCACCAGCAACTAGTACGAGTACAGCAACA-3’。提取珍汕97的RNA,采用反轉錄試劑盒(Takara公司,Prime ScriptTMRTMaster Mix)反轉錄qPC1的cDNA。將其cDNA連接至pMD19-T(Takara公司)載體上得到pMD19-qPC1,然后轉化至DH5α(Solarbio,C1100)中,37 ℃過夜培養。提取質粒pMD19-qPC1與酵母pDR195空載體,并進行雙酶切(NotI與BamH I),將qPC1基因的cDNA序列連接至pDR195,得到pDR195-qPC1。

1.2.5 水稻根對溶液氨基酸吸收試驗 在光照培養箱中,水稻qPC1轉基因(超量表達和RNAi抑制表達)種子在生根培養基上無菌生長20 d后,每個家系3株長勢一致的小苗進行根吸收試驗。吸收溶液是水稻生根培養液但不含氮元素,且用20種氨基酸取代,這些氨基酸的濃度均為50 mmol/L。在吸收試驗前對根進行氮饑餓處理2 d,根對氨基酸的吸收速率以6 h內溶液中氨基酸減少的速率來計算,其中溶液中氨基酸含量采用L-8800全自動氨基酸分析儀測定。3次重復,每次溶液中氨基酸含量測定2次。

2 結果與分析

2.1 雙熒光素酶報告載體的構建

以水稻品種珍汕97和南陽占DNA為模板,利用定點突變的特異性引物(表1,含有酶切位點BamH I和NotI)進行PCR擴增,分別獲得長度為693、440、691、231 bp的qPC1啟動子片段,然后分別克隆至pMD18-T載體上。經菌液PCR鑒定得到目的條帶大小與預期一致的陽性克隆(圖1)。送陽性克隆菌液測序,經測序篩選得到完全無突變的正確序列后,將其分別提取質粒(圖2),并克隆至終載體pGreenII 0800-LUC上。經菌液PCR鑒定和測序正確后,對其終載體分別提取質粒并進行瓊脂糖凝膠檢測和雙酶切鑒定(圖3),雙熒光素酶報告載體pGreenII 0800-LUC-1、pGreenII 0800-LUC-2、pGreenII 0800-LUC-3、pGreenII 0800-LUC-4均構建成功且結果良好。

1、3、4、5泳道同為pMD18-T-1(693 bp);7～12泳道同為pMD18-T-2(440 bp);13～14、16～18泳道同為pMD18-T-3(691 bp);19～24泳道同為pMD18-T-4(231 bp)。The 1, 3, 4 and 5 lanes are the same products of pMD18-T-1 (693 bp); The 7-12 lanes are the same products of pMD18-T-2 (440 bp); The 13-14 and 16-18 lanes are the same products of pMD18-T-3 (691 bp); The 19-24 lanes are the same products of pMD18-T-4 (231 bp).

1～2泳道同為pMD18-T-1(3385 bp)質粒;3～4泳道同為pMD18-T-2(3132 bp)質粒;5～6泳道同為pMD18-T-3(3383 bp)質粒; 7～8泳道同為pMD18-T-4(2923 bp)質粒。The 1-2 lanes are the same plasmids of pMD18-T-1 (3385 bp); The 3-4 lanes are the same plasmids of pMD18-T-2 (3132 bp); The 5-6 lanes are the same plasmids of pMD18-T-3 (3383 bp); The 7-8 lanes are the same plasmids of pMD18-T-2 (2923 bp).

2.2 水稻原生質體轉化及啟動子活性檢測

前期研究結果表明,水稻qPC1基因啟動子區有2個共同的自然變異位點(-7～-12 bp,-32 bp),3個潛在順式作用元件,是引起qPC1基因表達與籽粒蛋白質含量存在差異的主要原因[3]。根據-7～-12 bp,-32 bp兩個位點存在的4種突變情況設計定點突變引物(表1,圖4),構建雙熒光素酶報告基因的載體,瞬時轉化水稻中花11原生質體,通過測定熒光素酶活性進而間接測定qPC1啟動子活性。

將構建好的雙熒光素酶重組載體pGreenII 0800-LUC-1、pGreenII 0800-LUC-2、pGreenII 0800-LUC-3、pGreenII 0800-LUC-4和空載體pGreenII 0800-LUC使用無內毒素質粒提取試劑盒提取高濃度質粒,將雙熒光素酶重組質粒和對照空載體分別轉化至水稻中花11原生質體中,分別檢測其熒光素酶活性。結果發現pGreenII 0800-LUC-1和pGreenII 0800-LUC-2的啟動子活性無顯著差異(圖5),說明當-7 bp處的CACAGA堿基存在時,-32 bp處的堿基突變對轉錄活性影響不大;pGreenII 0800-LUC-3和pGreenII 0800-LUC-4的啟動子活性差異極顯著,說明當-7 bp處的CACAGA堿基缺失時,-32 bp處的堿基G突變為C使轉錄活性顯著增加;pGreenII 0800-LUC-1和pGreenII 0800-LUC-4的啟動子活性相比,pGreenII 0800-LUC-4的轉錄活性極顯著增加(P<0.001);pGreenII 0800-LUC-2和pGreenII 0800-LUC-3的啟動子活性相比,pGreenII 0800-LUC-3的轉錄活性顯著增加(P<0.01)。以上結果表明水稻qPC1啟動子轉錄起始位點上游-7 bp位置處的6 bp(CACAGA)缺失時,qPC1啟動子活性顯著增加;且當-7 bp處的CACAGA堿基缺失,-32 bp處的堿基G突變為C時,OsAAP6基因啟動子活性最強。

M為5000 bp大小的DNA標記;A圖中1～2、3～4、5～6泳道分別為pGreenII 0800-LUC-1、pGreenII 0800-LUC-2和pGreenII 0800-LUC-3雙酶切產物;B圖中1～2為pGreenII 0800-LUC-4雙酶切產物。M: DNA marker 5000 bp DNA ladder; A: 1-2、3-4、5-6 are double digested products of pGreenII 0800-LUC-1, pGreenII 0800-LUC-2 and pGreenII 0800-LUC-3, respectively; B: 1-2 are pGreenII 0800-LUC-4 double enzyme cleavage products.

圖4 水稻qPC1啟動子定點突變位點Fig.4 The site directed mutations in the promoter of qPC1 gene in rice

平均值+標準誤差;**P<0.01;***P<0.001;NO表示無顯著差異。Mean ± sem; **P<0.01; ***P<0.001; NO means no significant difference.

2.3 qPC1功能性分子標記的開發與應用

針對qPC1基因的功能性變異位點,設計對應的分子標記(命名為PB13,表3),并利用分子標記PB13對珍汕97與南洋占的重組自交系群體部分單株進行PCR擴增及測序分析。結果顯示,供試單株中有9株來自珍汕97qPC1基因型(231 bp),14株來自南洋占qPC1基因型(237 bp),其余24株為雜合基因型單株(圖6)。前期研究結果表明,來源于珍汕97qPC1基因型單株中種子蛋白質顯著高于來源于南洋占qPC1基因型的單株[3, 28],且珍汕97qPC1基因序列在其啟動子-7～-12 bp位置處,相對于南洋占qPC1基因存在1個6 bp(CACAGA)的缺失。因此,上述試驗結果為后期利用qPC1基因進行分子設計育種提供了重要的功能性分子標記。

表3 qPC1基因功能性分子標記

2.4 缺陷型酵母表達載體的構建

以珍汕97的RNA為模版反轉錄得到其cDNA,利用含有酶切位點(NotI和BamH I)的引物進行PCR擴增,得到預期DNA片段(1543 bp)(圖7-A)。將此DNA片段連接至終載體pDR195,經測序和雙酶切檢測(圖7-B),其中泳道1～5表示提取的質粒,大小在7.8 kb左右(與理論大小吻合),泳道6為NotI和BamH I雙酶切pDR195-qPC1質粒后的條帶,大小分別為6.3和1.5 kb左右(與理論大小吻合),即完成缺陷型酵母表達載體pDR195-qPC1構建。

1～47為珍汕97(ZS97)與南洋占(NYZ)的重組自交系群體內的單株,其中1、7、14、18、29、42、44、46和47號樣品是珍汕97的基因型;2、3、6、11、12、15、22、24、26、31、38、40、41和43號樣品是南洋占的基因型,其余的樣品是珍汕97與南洋占雜合基因型。1-47 are individual plants within the recombinant inbred population of Zhenshan 97 (ZS97) and Nanyangzhan (NYZ), among which samples 1, 7, 14, 18, 29, 42, 44, 46 and 47 are genotypes of Zhenshan 97, samples 2, 3, 6, 11, 12, 15, 22, 24, 26, 31, 38, 40, 41 and 43 are genotypes of Nanyangzhan, while the remaining samples are heterozygous genotypes of Zhenshan 97 and Nanyangzhan.

A:1～2泳道為qPC1 cDNA片段;B:1～4泳道為pDR195-qPC1質粒;5泳道為pDR195-qPC1質粒雙酶切結果。 A: The 1-2 lanes are the same products of qPC1; B: The 1-4 lanes are the same plasmids of pDR195-qPC1; The line 5 is the double-enzyme digestion of pDR195-qPC1.

2.5 缺陷型酵母生長情況檢測

將上述構建好的缺陷型酵母表達載體pDR195-qPC1轉入酵母突變體細胞22Δ8AA(qPC1-22Δ8AA),并將pDR195空載體分別轉入酵母突變體菌株22Δ8AA(pDR-22Δ8AA)和酵母野生型菌株24433c(pDR-24433c)作為陰性與陽性對照。然后在YNB培養基上培養,結果顯示上述3種酵母生長情況良好(圖8),即載體均已轉入酵母細胞,可以進行后續的氨基酸缺陷型酵母互補試驗。

2.6 qPC1在酵母體內轉運功能分析

氨基酸缺陷型酵母22Δ8AA對于吸收精氨酸、瓜氨酸、GABA、天冬氨酸、脯氨酸或谷氨酸6種氨基酸存在缺陷,利用酵母22Δ8AA這種特性能夠在酵母體內檢測qPC1轉運功能。將上述構建好的3種酵母(pDR-22Δ8AA、pDR-24433C和qPC1-22Δ8AA)轉入酵母完全培養基YPAD中擴繁并篩選。結果顯示,qPC1-22Δ8AA酵母生長情況與pDR-24433c酵母陽性對照相似,但明顯好于pDR-22Δ8AA陰性對照。在含1 mmol/L谷氨酸和天冬氨酸、以及3 mmol/L精氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和L-瓜氨酸的培養基上,qPC1-22Δ8AA酵母生長情況更好,與pDR-22Δ8AA陰性對照存在明顯差異。在含3 mmol/L谷氨酸培養基上,pDR-22Δ8AA陰性對照在稀釋1000倍時基本不再生長,但qPC1-22Δ8AA酵母在1000和10 000倍時依然生長良好。因此,qPC1-22Δ8AA酵母在供試的6種培養基上均能生長,即qPC1蛋白在體內能夠轉運多種氨基酸,轉運谷氨酸的能力最強(圖9)。

2.7 qPC1參與水稻根部氨基酸的吸收與轉運

為探究qPC1是否參與水稻根部氨基酸的吸收與轉運,將qPC1超量表達(OX)和抑制表達(RNAi)以及對應的對照水稻苗期根部浸入含有20種氨基酸培養液中,根對氨基酸的吸收速率以6 h內溶液中氨基酸減少的速率來計算。結果表明,相對于qPC1超量表達陰性OX (-)植株,脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸和總氨基酸含量在qPC1超量陽性OX (+)植株中顯著升高,甲硫氨酸則明顯下降(圖10-A),而在qPC1抑制表達(RNAi)轉基因植株中的情況卻完全相反(圖10-B),即qPC1能夠促進水稻根對多種氨基酸的吸收,且對蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸和酸性氨基酸具有較快的吸收與轉運速率。

A:pDR-24433c;B:pDR-22Δ8AA;C:qPC1-22Δ8AA。

a: OD600值為1.0; b: 稀釋10倍;c: 稀釋100倍; d: 稀釋1000倍; e:稀釋10 000倍。a: OD600 value of liquid bacterial germ is 1.0; b: Liquid bacterial germ is diluted 10 times;c: Liquid bacterial germ is diluted 100 times; d: Liquid bacterial germ is diluted 1000 times; e: Liquid bacterial germ is diluted 10 000 times.

3 討 論

水稻qPC1基因是一個控制稻米蛋白質含量高低的正調控因子,定位于水稻第1染色體上,即qPC1表達水平高時能合成并積累更多的水稻種子儲藏蛋白和總的必需氨基酸,最終提高稻米營養品質[3]。大田試驗結果表明,隨著田間氮肥濃度增加,qPC1表達量逐漸升高,促進稻米中蛋白質、總必需氨基酸和總氨基酸的積累,有利于稻米營養品質的提升[4, 29]。前期研究發現,qPC1基因(又稱OsAAP6)在啟動子區的變異是引起稻米蛋白質含量變異的主要原因[3]。通過分析197份世界微核心種質資源qPC1基因序列發現,qPC1啟動子區存在3個共同的多態性變異位點,且其中2個多態性位點存在3個潛在的順式作用元件,它們是轉錄活化因子結合的靶位點[3]。本研究定點突變qPC1啟動子翻譯起始位點上游-7和-32 bp這2個位點,并將其克隆至雙熒光素酶報告基因載體pGreenII 0800-LUC上,將4種重組表達載體瞬時轉化至水稻原生質體,檢測熒光素酶的活性。結果顯示qPC1啟動子區-7～-12 bp處6 bp的缺失,能夠促進qPC1啟動子活性顯著增加。因此,qPC1啟動子翻譯起始位點上游-7和-32 bp處即為qPC1基因的功能性變異位點,并針對該位點設計了對應的分子標記PB13進一步進行了驗證,本研究結果為后期全面揭示水稻種子蛋白質含量的分子調控機理提供了重要依據。

氨基酸轉運蛋白廣泛參與植物生長發育過程,其中擬南芥AtLHT1能夠針對組氨酸和賴氨酸進行特異性轉運[30],玉米中ZmAAP4可以在體內轉運谷氨酸和脯氨酸[31]。作為氨基酸轉運蛋白家族成員的一個亞家族,氨基酸通透酶在植物體內能夠轉運多種氨基酸,參與調控水稻產量與品質。例如,OsAAP1基因通過增加中性氨基酸的攝取和再分布來改善水稻的生長和種子產量[20]。OsAAP4基因參與調節中性氨基酸的分配,能夠提高水稻分蘗數及其產量[22]。OsAAP5主要轉運堿性氨基酸(賴氨酸和精氨酸)[23]。OsAAP7能夠轉運甘氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸[24]。OsAAP10在水稻中參與中性和酸性氨基酸的轉運,并且影響直鏈淀粉含量與食味值等品質性狀[25]。除了天冬氨酸和β-丙氨酸,其余的氨基酸都能被OsAAP16轉運[24]。qPC1(OsAAP6)是水稻種子蛋白質含量和營養品質的正向調節因子[3-4],但尚不清楚其轉運功能。為探究qPC1的轉運功能,將qPC1轉入氨基酸缺陷型酵母,結果發現qPC1-22Δ8AA酵母在供試6種培養基上均能生長,即qPC1蛋白能夠轉運多種氨基酸。為進一步探究qPC1在水稻體內的轉運功能,利用qPC1超量表達和抑制表達材料進行水稻根部氨基酸的吸收試驗,結果顯示qPC1參與水稻根部多種氨基酸的吸收與轉運。水稻根部氨基酸的吸收試驗和缺陷型酵母的互補試驗結果均表明,qPC1蛋白參與多種氨基酸的轉運,暗示qPC1蛋白是一種廣譜性氨基酸轉運蛋白,這為全面解析qPC1基因的生物學功能提供重要線索。

A和B分別表示qPC1超量表達和RNAi抑制表達轉基因植株根部氨基酸的吸收試驗結果。 (+) 和 (-)分別表示在T2 代轉基因陽性和陰性植株;“*”和“**”分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。數據以平均值±標準偏差顯示,差異基于雙尾t-測驗,3次生物學重復。插入的表示總氨基酸。A and B represent the absorption results of amino acids in the roots of transgenic plants with qPC1 overexpression and RNAi inhibition, respectively. (+) and (-) represent transgenic positive and negative plants in T2 generation, respectively; ‘*’ and ‘**’ indicate significant differences at the 0.05 and 0.01 levels, respectively. The data is displayed as mean ± standard deviation, with differences based on a two tailed t-test and three biological replicates. The inserted represents the total amino acids.

4 結 論

水稻qPC1啟動子區-7～-12 bp位置為其功能性變異位點,設計對應的功能性分子標記PB13并進行驗證。qPC1基因參與多種氨基酸的轉運,這為后期全面解析qPC1分子調控機制及其利用qPC1基因進行水稻新品種的分子設計育種提供了重要理論依據。