醫用小型豬選育方法和應用進展

連玉舉,張致遠,廖曉波,魏紅江,印遇龍*,劉 梅*

(1.湖南農業大學動物科學技術學院,長沙 410128;2.中南大學湘雅二醫院胸心外科,長沙 410011;3.云南農業大學動物醫學院 云南省小型豬基因編輯與異種器官移植重點實驗室,昆明 650201)

模式動物是指科學家用特定的動物物種,揭示某種具有普遍規律的生命現象或藥物作用的一類動物[1]。在人類疾病研究中,使用合適的動物模型是至關重要的。嚙齒動物,如小鼠、大鼠等都是常用的模式動物。但由于遺傳及解剖學差異,這些模式動物并不能完全反映人類病理生理特征,尋找新的更合適的模型是重要的研究思路之一。大量研究表明,小型豬在生理學、解剖學、營養代謝、藥物代謝和疾病發展等方面相較于嚙齒類動物與人類更相似[2-3]。且小型豬與人類共同擁有大量與肥胖、糖尿病、閱讀障礙癥、帕金森病和阿爾茨海默病等疾病相關的遺傳變異[4]。由此可見,小型豬作為醫用模式動物應用于人類疾病研究中有著巨大的潛在價值。但是醫用小型豬的系統性綜述還較少。因此,本文將系統綜述小型豬的生物學特性、品種資源及選育方法,分析目前國內外小型豬的研究現狀及主要應用進展,以期相關領域的同行系統了解醫用模式動物及選育方法進展,明晰中國小型豬的種質資源保護及開發為醫用模式動物的重要性,推動小型豬研究在醫用模式動物領域的蓬勃發展。

1 小型豬生物學特性

小型豬(miniature pig)屬于哺乳綱、偶蹄目、野豬科、豬屬、豬種動物,染色體數目2n=38。小型豬品種眾多,由于遺傳背景、地緣環境等因素的不同造成了生長和繁殖性能的差異。小型豬抗逆性強,對不良的生態和飼料條件有很強的適應能力,對飼料要求簡單,飼養較粗放,自然環境下平均壽命超過10年,在15年左右[5]。小型豬和微型豬按照體重進行區分,一般12月齡體重為45～65 kg的豬為小型豬,12月齡體重在25～35 kg的豬稱為微型豬。

1.1 解剖學差異比較

小型豬與人類在心血管系統、消化系統、呼吸系統、代謝系統、泌尿系統有很大的相似之處。圖1展示了小型豬與人類的內臟結構對比,在心血管系統中,小型豬心臟的形狀、解剖結構,大動脈的結構和位置關系,血流動力學特征及調節方式都與人類極為相似;此外,小型豬的冠狀動脈也由單獨發出的左冠脈系統及右冠脈系統構成,且大多數為右冠優勢型,冠脈的走形、分布及營養心肌的范圍與人類基本一致[6-7]。在消化系統上,有研究表明4月齡的五指山小型豬胃的形態以及十二指腸長度與人基本相似[7],其肝的大小雖有差異,但是肝的橫徑、縱徑和厚度與人類基本一致[7]。在泌尿系統中,小型豬腎的大小與人類近似一致。廣西巴馬小型豬的輸尿管略呈紆曲狀,起始部位較粗,而后逐漸變細,連接膀胱處最細;人類的輸尿管有3個狹窄處,與廣西巴馬小型豬略有差異[6]。在皮膚類疾病的研究中,小型豬與非人靈長類實驗動物具有等同作用,鄭必祥等[8]通過對比巴馬小型豬與人的背部全層皮膚,發現二者的真皮厚度、表皮厚度近乎一致。此外,小型豬脖子和腿的活動范圍有限,不能舔或撓它們自身的背,這相較于嚙齒類、非人靈長類等模式動物具有明顯優勢。

圖1 豬與人的解剖平面圖Fig.1 Comparison for anatomical plane of pig and human

小型豬相較于嚙齒類實驗動物和非人靈長類實驗動物,雖然不如嚙齒類實驗動物體型小、生長快、便于實驗操作,但也存在一些作為模式動物不可替代的優勢。與嚙齒類動物相比,小型豬和人的親緣關系更近。在器官大小和生理構造上,小型豬可以補充許多嚙齒類動物不適合開展的動物模型實驗。例如,大鼠因沒有膽囊而無法開展的部分消化試驗;大鼠因食管與胃小彎的褶皺能阻止胃內容物反流而不能進行的嘔吐試驗[9]。小鼠因皮膚無汗腺,依賴尾巴的四根血管調節溫度。豚鼠的心臟前端有出入心臟的大血管,與人類的心臟結構差異較大。再者,嚙齒類動物生命周期較短,無法充分模擬一些病程長的疾病,而小型豬則更適合。世界各國食品和藥物管理局規定,新藥臨床試驗之前,必須在至少一種非嚙齒類大動物(通常為猴、犬、豬)上進行安全性及毒性評估[10]。與非人靈長類動物相比,雖然非人靈長類動物是進化史上與人類親緣關系最近的類群,在認知能力、繁殖和生育等方面與人類具有高度同源性。但是非人靈長類動物資源相對匱乏,造成實驗費用高,加上對其進行遺傳修飾的技術只有少數實驗室掌握,還需要考慮諸多倫理問題,相比之下小型豬遺傳資源和數量更豐富,更易于廣泛應用。

1.2 生理學特點及血液生理生化指標分析

小型豬為全年多發情動物,母豬性周期為(21±2.5)d,發情持續時間平均2.4 d,妊娠期114 d左右,產仔數2～10頭,這相較于非人靈長類動物可以獲得更多群體數量。小型豬正常體溫為38～40 ℃,心率55～60次·分-1,血容量占體重的3.5%～5.6%,心排血量3.1 L·min-1,收縮壓144～185 mmHg,舒張壓98～120 mmHg,呼吸頻率12～18次·分-1,通氣率37 L·min-1,耗氣量220 mm·g-1活體重,血液pH為7.36～7.79,尿比重1.102～1.022,尿pH為6.5～7.8[9]。

血液生理生化指標用以反映機體的內環境穩態、免疫能力、區分不同動物的生物學特性[11]。為探究小型豬和人體內生理學差異,本文通過“中國知網”、“谷歌學術”、“PubMed”數據庫進行數據檢索、篩選剔除及整合,分別選擇五指山小型豬、巴馬小型豬、版納微型豬、哥廷根小型豬(G?ttingen)4個品種(公布數據有限,選擇年齡均為3～6月齡不等),對比血液中的蛋白質、糖類、無機離子、酶類、脂類、非蛋白含氮類化合物等共23種血液生理生化指標進行初步比較(表1)。不同品種的小型豬血液生理生化指標存在差異,這可能與小型豬的品種、年齡、性別、飼養環境等因素有關。這也提示,有必要進一步細化區分不同品種、不同年齡段、不同性別、不同飼養環境下的小型豬血液生理生化數據。同時,對比分析發現,不同品種的小型豬均有與人體近似的指標,這也是小型豬作為人類疾病模型動物的理論基礎。有趣的是,五指山小型豬、巴馬小型豬、版納微型豬的白細胞總數比人體正常范圍高很多,而哥廷根小型豬的數值則接近,這可能與測定豬群的微生物凈化等級、采樣過程對豬的應激程度有關系,通常豬群發生疾病、應激等情況下均會造成白細胞數量的增加。4種小型豬的紅細胞總數、血小板總數均遠高于人,這可能是因為種屬差異,而較高的血小板總數也有利于通過豬種構建血栓疾病模型。肌酸激酶與細胞內能量運轉、肌肉收縮、ATP再生有直接關系,4種小型豬血液中肌酸激酶與人體存在顯著差異,可能是因為種屬間能量代謝不同而產生。

表1 不同品種小型豬血液生理生化指標與人體對比Table 1 Comparison of physiological and biochemical blood indexes of different breeds of miniature pigs with human body

2 小型豬品種介紹

2.1 國外品種

國外開展小型豬應用研究的國家主要有美國、日本、德國和法國等。美國小型豬品系較為豐富,主要有明尼蘇達-霍麥爾品系(Minnesota Hormel)、皮特-曼摩爾品系(Pitman Moore)、海福特品系(Hanford)、尤卡坦品系(Yucatan)、奧薩博品系(Ossabaw)、辛克萊品系 (Sinclair )等;日本小型豬品系主要有阿咪尼品系(Oh mini)、克勞恩咪尼品系(Clawn mini)以及會津品系(Huei Jin);德國小型豬有哥廷根品系(G?ttingen);法國小型豬有科西嘉品系(Corsica)。表2總結了上述10種國外小型豬品系的產地、主要特征及應用。不難發現,國外小型豬的培育、開發及研究較早,已形成了多個廣泛應用于特定疾病研究領域的模式豬。例如尤卡坦品系(Yucatan),具有皮膚灰暗、被毛稀少或無、性情溫和、容易肥胖等特點,是開展皮膚實驗[18]、構建肥胖和糖尿病模型[19-21]的理想動物模型。哥廷根品系(G?ttingen)具有體型小的特點,在器官移植[22]、皮膚疾病[23]等方面應用較多,在國際上聲名顯赫。明尼蘇達-霍麥爾品系(Minnesota Hormel)是最早的小型豬培育品系,應用領域包括皮膚病[24]、腫瘤[24]、牙科[25]等。海福特品系(Hanford)的體型相比其他品系偏大,皮膚為白色,主要應用于皮膚疾病[26]領域?？莆骷纹废?Corsica)主要應用于放射性研究[27]。日本的阿咪尼品系(Oh mini)、克勞恩咪尼品系(Clawn mini)以及會津品系(Huei Jin)的生物學特性、應用方面均較為相似,主要包括藥物代謝、皮膚疾病、心血管疾病等[28]方面,克勞恩咪尼品系(Clawn mini)的應用相比其他兩個品系更加廣泛,推測這可能跟遺傳背景、飼養數量有關。

表2 國外小型豬品種情況Table 2 Foreign breeds of miniature pigs

2.2 國內品種

目前國內的小型豬品種主要有五指山豬、貴州的香豬(包括從江香豬、劍白香豬、環江香豬)、廣西巴馬香豬、迪慶藏豬、蕨麻豬等地方品種,以及五指山小型豬近交系、巴馬小型豬、中國實驗用小型豬、版納微型豬近交系(來源于滇南小耳豬)、合作小型豬等培育的小型豬新品系。表3總結了我國主要的8種小型豬的產地、主要特征及應用。通過與國外小型豬對比發現,我國成年小型豬具有體型小、性成熟早、遺傳性狀穩定等優點,應用范圍主要在動脈粥樣硬化、心肌梗死、異種移植、藥理學、毒代動力學、皮膚疾病等方面。其中,版納微型豬近交系在2005年便通過國家鑒定委員會鑒定,報道稱該版納微型豬是世界上第一個大型哺乳動物近交系,其系譜完整,數據可靠,遺傳背景清晰,基因高度純合,個體之間近乎零差異,是異種器官移植的優質材料[29-30],巴馬小型豬在構建糖尿病、肥胖等方面表現出較短的高糖高脂誘導時間[31]。

表3 國內小型豬品種情況Table 3 Domestic breeds of miniature pigs

3 小型豬的選育方法

選育遺傳背景清楚、個體差異小、微生物得到嚴格控制的品種是小型豬實驗動物化的重要歷程。表4總結了10種外國小型豬的遺傳背景,結合表2不難發現,國外的地方品種缺乏體型小的特征,培育的小型豬品系多為體型大的地方品種與中國或越南的小型豬品種雜交而來。這種多品種雜交的繁育方式,使其遺傳背景非常復雜,遺傳及表型不穩定。相比較下,我國地方小型豬品種長期在封閉環境中進行繁育,形成了體型小、性成熟早、遺傳性狀穩定等優良特性。

表4 國外小型豬遺傳背景Table 4 Genetic background of foreign miniature pigs

3.1 近交系的選育

實驗動物通常要求遺傳背景清楚、個體差異小,而培育近交系和封閉群是保證遺傳質量的重要手段。近交系的培育通常要求連續20代及以上的全同胞或親子近交,品系內所有個體都可追溯到起源于第20代或以后代數的一對共同祖先。近交系的近交系數應大于98.6%。近交系個體具有同源性(可追溯一對共同祖先),個體之間表型一致,是理想的實驗材料。

以馮書堂團隊(中國農業科學院)培育的五指山小型豬近交系為例,該近交系以五指山小型豬為祖系,參照近交系小鼠的培育方法,F23代近交系數達到99.3%,并建立完整系譜。該近交系培育技術路線包括近交繁育(仔母交配和全同胞交配)、近交驗證、發掘特異等位基因、矮小型分子機理等[32-33]。該近交系通過了蛋白質檢測、SNP位點分析、微衛星標記、特異性等位基因、皮膚移植等鑒定手段的驗證[33]。王愛德團隊(廣西大學)培育的廣西巴馬小型豬以巴馬香豬作為零世代和原始礎群,育成有封閉群(A系)和近交系(B系),其中A系采用群內隨機交配的方式(少量半同胞等近交方式)選育而成,B系在封閉群F10的基礎上采用全同胞繁育(少量親子交配)的方式選育而成[34]。中國農業科學院蘭州獸醫研究所培育合作小型豬以合作豬為系祖,采用近親交配和異地實驗動物化培育,培育的近交系合作小型豬是國際上首個高原型近交系小型豬[35]。合作小型豬封閉群的建立按照《實驗用合作小型豬遺傳質量控制》(DB62/T 4074—2019)封閉群的遺傳標準和要求,達到種群60頭,截至2021年,累計向社會生產提供800多頭[35]。

此外,中國農業大學培育的中國實驗用小型豬、曾養志團隊(云南農業大學)培育的版納微型豬近交系,以及甘世祥團隊(貴陽中醫學院)培育的貴州香豬(自然選育)等新培育品系,同樣應用潛能巨大。

3.2 小型豬的微生物凈化

小型豬的生物凈化技術主要包括剖腹產、仔豬寄養、隔離、體外受精-胚胎移植等[9]。采用的凈化技術路線是檢測排除垂直傳播病原—篩選妊娠母豬—剖腹產或子宮切除—胎兒隔離器飼養—SPF級過渡飼養—清潔級飼養[36]。傳統生物凈化技術存在垂直傳播病原難凈化、人工哺乳技術差異大、代乳母豬拒哺乳等問題。體外受精-胚胎移植技術具備病原體凈化、拒哺乳風險低、人為控制時間等優點,主要包括激素超排、體外受精、胚胎移植等流程。由于豬的子宮頸深,有很多褶皺,胚胎移植一般采用手術法。但是開創性手術會給受體母豬造成不同程度的創傷,往往后代成活率較低。因此,小型豬體外受精-胚胎移植技術仍然需要不斷優化,比如改進手術過程中的無菌操作流程以及輸入胚胎的方法等。在實際生產中,還要參照GB 14925—2010《實驗動物環境及設施》和各地方微生物控制標準的規定,把生物安全防控制度化、常態化,保持病原體不侵入環境中。

小型豬的實驗動物化,在控制遺傳質量的同時,更重要的是進行微生物凈化。例如哥廷根小型豬經過30余年的微生物凈化,其高潔凈度為實驗工作的開展奠定了重要基礎,這是我國小型豬所缺乏的。

3.3 基因工程選育

自1985年Hammer等[37]成功培育世界上首例轉基因豬開始,基因修飾技術在豬育種中被廣泛應用,但是不同的基因修飾技術有著不同的優缺點。顯微注射法存在外源基因插入位點隨機性(位置效應),基因表達不穩定,但是因其外源基因的轉移率和整合效率高等優點,通常作為轉基因技術的常規操作[38]。而核移植轉基因的方法是在細胞水平的改造,可以避免位置效應,但是存在效率低,需要大量的卵母細胞和受體動物等問題[39]。使用鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFN)、轉錄激活因子樣效應因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)和規律成簇的間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)等基因編輯工具可以對基因組定點修飾,但是ZFN存在制備工藝復雜、毒性大、脫靶嚴重、成本高等問題[40-41]。TALEN識別域序列至少2 kb,設計構建難度大[38-39]。CRISPR/Cas9技術具有成本低、適用編輯范圍廣、打靶效率高、操作簡單、可支持多位點操作等諸多優點[42-44],近年來CRISPR/Cas9 技術在分子生物學領域得到廣泛應用。Whitworth等[45]利用CRISPR/Cas9技術培育的CD163基因編輯豬在攻毒實驗中可完全抵抗 PRRSV感染,在疾病凈化中具有重要的價值。Shi等[46]應用CRISPR/Cas9技術獲得的BMP15 基因編輯大白豬,表現出高產潛能。

由于第一代轉基因豬呈雜合子狀態,整合位點位置和數量、基因拷貝數大多不同,外源基因在不同個體中會產生不同的表達水平。每只原代F0陽性豬的基因型可能都不一樣,在不同F0之間自交會產生多位點整合,目的外源基因出現不同表達方式。因此,原代F0陽性豬只有通過選種選配,和野生型豬(背景品系的豬)交配,獲得整合位點相同的F1代。根據孟德爾定律,F1代中大約一半是雜合子,一半是野生型,F1代全同胞交配可以產生純合子基因豬和雜合子基因豬,只有純合子基因豬才不發生配子分離而能在后代中穩定遺傳下去。

4 小型豬的應用現狀分析

以“Miniature pig;Minipig;Animal models”為關鍵詞,根據PubMed 2000年至2021年發表文章數量進行統計分析,小型豬作為醫用模型動物的熱度逐年上升。如圖2所示,小型豬作為模型應用主要集中在心血管、內分泌系統、消化代謝系統、腫瘤、異種器官移植、口腔;其中心血管系統應用最多,并呈現上升趨勢。這可能是因為小型豬的心臟解剖結構和生理生化指標均與人類相似[47],利用小型豬作為模型研究人類心血管系統疾病結果更有效可靠。張燕華等[48]在構建植入式遙測動物模型時發現,與比格犬和食蟹猴相比,巴馬小型豬更適合用于藥物對心血管系統影響的評價。因此,下文主要對小型豬在心血管系統方面的研究及應用現狀進行概述。

表5 國內小型豬遺傳背景Table 5 Genetic background of domestic miniature pigs

圖2 小型豬作為模型的研究領域及熱度分析Fig.2 Research field and heat analysis of miniature pigs as models

4.1 心肌梗死模型

早期識別心肌缺血和建立再灌注是治療心肌梗死的基石,通過建立缺血區域的再灌注可以顯著降低死亡率和發病率[49]。心肌梗死模型的構建主要分為:急性心肌缺血模型與慢性心肌缺血模型。

4.1.1 急性心肌缺血模型 Goetzman等[49]使用尤卡坦小型豬建立急性心肌梗死模型,根據血清代謝組學,發現血清代謝物在缺血期間、再灌流早晚期表現出不同的特征,有助于識別不同的缺血和再灌注階段,對于早期識別缺血和血運重建具有重大意義。馬國鈐[50]使用9頭滇南小耳豬建立急性心肌梗死及缺血再灌注模型,檢測心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin I,cTn-I)和心肌肌球蛋白結合蛋白C(cardiac myosin binding protei n-C, cMyBP-C)的濃度,發現cMyBP-C在急性心肌梗死后1 h開始升高。與cTn-I相比,cMyBP-C呈更早升高,可作為早期診斷急性心肌梗死的心肌標志物;同時,再灌注后cMyBP-C峰值提前出現,提示再灌注可加速其降解釋放速度,可對缺血再灌注損傷、血管再通提供一定的指導作用。

傳統急性心肌梗死動物模型主要采用開胸結扎冠狀動脈的方法,但是該方法對實驗動物的手術創傷大、病死率高。因此,更多的研究者采用了微創介入和電誘導等方法來構建小型豬急性心肌梗死模型。例如,田毅等[51]使用巴馬小型豬,通過經皮冠狀動脈球囊聯合凝膠海綿聯合栓塞的方法,建立了持久穩定的急性心肌梗死小型豬模型。Liu等[52]在研究重組葡糖激酶(r-Sak)對中國實驗微型豬的冠狀動脈血栓形成、心肌缺血和心肌梗死的實驗中,通過電刺激損傷小型豬的動脈內膜,促進冠狀動脈血栓形成,構建了急性心肌梗死模型,證明了r-Sak可溶解血栓。

4.1.2 慢性心肌缺血模型 慢性心肌缺血模型的構建方法主要包括:冠狀動脈外慢性縮窄法、冠狀動脈內膜增殖法、微循環栓塞法(機械栓塞法與化學損傷法)、高脂飲食法、次全結扎法等[53]。Miyagawa等[54]在G?ttingen小型豬的冠狀動脈左前降支外放置一條凝膠縮窄器4周,來構建慢性心肌缺血模型,評價合成前列環素激動劑(ONO-1301SR)給藥系統的效應。Lopez等[55]在研究心肌梗死病變心室壁重構的時間演變和病理生理學的過程中,使用微型球囊造成10只尤卡坦小型豬的左前降支閉塞,構建出慢性心肌梗死模型。傅向華等[56]采用4F導管超選前降支,注入塑料微球,在10只五指山小型豬中構建慢性心肌缺血模型,且成功率為66.7%,證明了該方法的穩定性及可重復性。Schuleri等[57]在評估哥廷根小型豬與約克郡豬作為心肌梗死后慢性心力衰竭的模型中,也是采用微型球囊造成左前降支閉塞,同樣證明哥廷根小型豬構建的慢性心肌缺血模型具有可重復性。過多的脂肪攝入可以引起冠狀動脈損傷,造成冠脈狹窄。劉建勛等[58]在制備慢性心肌缺血模型中使用中國實驗小型豬,采用高脂飼料飼喂與冠脈內皮損傷的綜合方式,加速構建出慢性心肌缺血模型。李欣志[59]在研究痰瘀互結證的冠心病模型病理機制中,也使用了高脂飼料飼喂與冠脈內皮損傷的綜合方式,揭示出痰瘀互結證候的演變過程。

4.2 動脈粥樣硬化、高血脂、糖尿病模型

動脈粥樣硬化( atherosclerosis,AS) 是誘發心腦血管疾病的主要病理原因之一[60]。頸動脈粥樣硬化比冠狀動脈粥樣硬化、大腦動脈粥樣硬化的發病時間早,三者存在共同的病理基礎和誘因[61]。高血壓、高血脂、糖尿病是頸動脈粥樣硬化的主要誘因,彼此間關系密切[62-64]。二型糖尿病發病期間由于糖脂代謝紊亂、P3K/AKT通路活性降低、MAPK通路被激活、血液處于慢性低度炎癥狀態,造成血管內皮被損傷、局部血管收縮、平滑肌細胞增殖與遷移、促血栓形成等后果,因此二型糖尿病大多合并頸動脈粥樣硬化[65-66]。高血脂可引起血漿脂蛋白異常,導致動脈管壁病變。高血壓可以增加頸動脈內-中膜厚度,導致動脈彈性下降,繼而引發頸動脈粥樣硬化。因此,動脈粥樣硬化、高血脂、糖尿病、高血壓模型的構建具有較多相同之處。

一般通過高脂飲食的手段來構建AS動物模型。例如,沈利葉等[67]在比較五指山小型豬和西藏小型豬的動脈粥樣硬化發病特征時,發現通過高脂飼喂的五指山小型豬和西藏小型豬AS開始形成于16周,而斑塊成熟要在24周,腹主動脈和冠狀動脈為主要病變部位。郁晨[68]在研究冠心寧片對西藏小型豬AS的作用及相關機制時,采用同樣的方法構建出AS動物模型,并發現該藥發揮抗AS作用與“肝-腸”軸途徑密切相關。而潘嘉祥等[69]采用高脂飼喂結合機械損傷(微型球囊擴張)的綜合方式,在巴馬小型豬上構建出AS模型,冠狀動脈血管內超聲結果顯示:AS組的狹窄率遠高于對照組,血脂指標也趨于上升水平,HE染色顯示:AS組冠狀動脈內膜損傷嚴重。這種綜合方式能夠更快速地構建AS模型。此外,敲除脂代謝相關基因,如低密度脂蛋白受體(LDLR),可以導致高脂血癥,能夠在正常飲食的狀態下形成動脈粥樣斑塊[70]。前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是脂代謝過程中重要的調節蛋白之一,人PCSK9D374Y功能獲得性基因突變是一種常染色體顯性遺傳疾病,患者突變的PCSK9蛋白與低密度脂蛋白受體結合能力增強,造成低密度脂蛋白清除能力下降,從而出現高膽固醇血癥。2013年,Al-Mashhadi等[71]利用基因重組的方式,將人PCSK9D374Y基因突變導入尤卡坦小型豬的基因組中,構建D374Y-PCSK9轉基因豬,使尤卡坦豬表達人D374Y-PCSK9蛋白,誘導出嚴重的高膽固醇血癥。當以高脂/高膽固醇飼料喂養時,轉基因豬1年后能形成典型的冠脈粥樣斑塊。

小型豬構建糖尿病模型通常采用高糖、高脂飼料飼喂的方法。但通過高脂飲食誘發豬糖尿病需要很長時間,而且不會表現出明顯的高血糖。例如,Li等[72]在使用巴馬小型豬構建二型糖尿病時,采用高脂飼料飼喂的方法,用時23個月才構建成功。嚙齒類動物構建糖尿病模型通常采用高脂飼料聯合小劑量鏈脲佐菌素誘導。因此,Zhao等[73]采用喂食高脂飼料并注射低劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)的方法,在24頭巴馬小型豬中成功構建出二型糖尿病模型,成功率達到80%,其中高脂飼料飼喂時間為9個月,注射STZ誘導3個月。Avery等[19]使用化學物質四氧嘧啶(Alloxan,ALX),經過4個月的誘導處理,胰島素維持在255～600 mg·dL-1的血糖水平,成功構建了4頭尤卡坦小型豬的糖尿病模型。通過對比發現,國內外不同的小型豬對高糖、高脂飼料致糖尿病反應的敏感度不同,應當根據不同品種,調整高糖、高脂飼料的配方,也期待未來小型豬高糖、高脂飼料配方更加精細化,做到一品種一方案。

高血脂的模型構建通常也是采用高脂飼料飼喂的方法,謝忠忱等[74]利用五指山小型豬構建出高血脂癥模型,3～4個月就達到很高的血脂水平,這說明五指山小型豬對高脂飼料敏感。Atiq等[75]在研究血管性血友病因子(VWF)和因子VIII(FVIII)水平是否是內皮功能障礙和動脈粥樣硬化的生物標志物時,使用18頭哥廷根小型豬構建出高血脂誘導糖尿病模型,在STZ和高脂飼料處理15個月后,出現內皮功能障礙和動脈粥樣硬化。

4.3 基因工程小型豬模型

基因工程小型豬動物模型在心血管疾病、糖尿病和神經系統疾病等研究中被廣泛應用。載脂蛋白E(ApoE)和低密度脂蛋白受體(LDLR)基因與脂蛋白代謝、動脈粥樣硬化有密切關系。Huang等[76]使用CRISPR/Cas技術培育了6頭ApoE和LDLR雙等位基因敲除的巴馬小型豬,顯著升高了轉基因豬血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇和載脂蛋白B的水平。隨后,Burke等[77]利用ApoE和LDLR雙等位基因敲除豬為模型,評價了苯哌酸降低血漿膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平及減輕動脈粥樣硬化的能力。張雪等[78]使用五指山小型豬近交系,成功獲得人PCSK9基因D374Y突變體的克隆豬,可加快動脈血管的發病進程,比傳統飲食、藥物誘導小型豬動脈粥樣硬化更加方便。諸多研究表明,人類PPARγ基因與很多慢性疾病有關,例如類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、糖尿病等[79]。2020年,吳彩霞等[80]采用體細胞核移植的方法成功構建8頭PPARγ基因過表達西藏小型豬,對人類心血管疾病、糖尿病功能基因組學研究有重要意義。GIP/GIPR軸功能受損已成為糖尿病的發病機制之一,程俊霖[81]采用體細胞核移植技術建立過表達的顯性抑制的GIPR轉基因豬,發現其表現出糖耐量受損和胰腺發育障礙。

4.4 藥物毒理、藥效評價

隨著世界各國食品和藥物管理局規定,新藥臨床試驗之前,必須要通過在至少一種非嚙齒類大動物(通常為猴、犬、豬)上進行安全性及毒性評估,小型豬在藥物安全性評價中應用越來越廣泛。Dorandeu等[82]在研究有機磷中毒的毒代動力學和藥代動力學中,采用豬為模型,發現模型中出現不同程度的麻醉和不同類型的休克,對于評估有機磷中毒患者的麻醉和合并損傷有重要參考價值。放射性皮炎是放射治療癌癥中不可避免的副作用,Zhao等[83]通過建立Ⅳ級放射性皮炎豬模型,證實了維生素B12具有明顯的抗輻射、抗炎和抗纖維化作用。Karlsson等[84]在評估創傷性腦損傷(TBI)藥物療效的試驗中,使用受控皮質沖擊裝置誘導豬腦損傷,環孢素連續靜脈輸液5 d,發現彌散張量成像和基于生物流體的生物標志物可以作為一項評估環孢素治療TBI療效的指標。在異生素測試中似乎沒有理想的物種,使用犬和非人靈長類動物仍然是常態,而小型豬也是一種可靠的非嚙齒動物測試模型[85]。

4.5 異種器官移植

心血管疾病的死亡率高,但可用于心臟移植的同種供心數量非常有限,替代療法是研究熱點。隨著基因編輯技術的快速發展,基因編輯豬被廣泛應用在性狀改良育種、人類疾病模型、藥物開發、生產人源蛋白、器官移植供體等方面,有可能為終末期器官衰竭患者提供無限數量的移植供體。但是,異種器官移植會存在內源病毒跨種傳播、免疫排斥等問題。為解決該問題,2017年,云南農業大學魏紅江教授團隊與美國eGenesis公司楊璐菡、哈佛醫學院教授喬治·丘奇(George Church)、丹麥奧胡斯大學組建聯合課題組,用新一代基因技術打靶方法根除了豬細胞里面所有的內源性病毒活性后,利用其成纖維細胞制造出豬胚胎,并植入母豬體內,最終在西南生物多樣性實驗室制備出世界首批內源性逆轉錄病毒被滅活的豬[29]。Ross和Coates[86]在2018年使用CRISPR-cas9技術獲取的基因編輯豬,其中所有內源性逆轉錄病毒都被滅活。2022年1月7日,在美國馬里蘭州巴爾的摩,Muhammad Mohiuddin醫生和Bartley Griffith醫生領導的馬里蘭大學醫學院(UMSOM)的異種心臟團隊,將經過基因編輯的豬心臟移植到一名終末期心力衰竭患者體內,這是世界上首例成功的豬到人的異種心臟移植,這名患者接受了高劑量的免疫抑制劑治療,存活了兩個月(2022年3月8日死亡),是異種心臟移植中存活時間最長的患者[87-90]。由此可見,通過有效的基因編輯豬,有望降低異種移植的免疫排斥反應,也為通過異種器官移植解決重大疾病難題提供了良好的基礎。

5 總結與展望

豬作為一種大型模式動物,無論是從解剖學結構、器官大小和生理學及生化特點,還是從基因組等方面都與人類高度相似,可彌補嚙齒類模式動物不具備的研究部分人類疾病的短板,且小型豬的繁殖能力更高,較非人靈長類模式動物更易滿足對模式動物群體數量的需求。因此,相較于嚙齒類動物和非人靈長類模式動物,豬在人類生物醫學研究中具有更大的優勢,醫用模式小型豬的開發與利用具有巨大前景。然而,我國小型豬開發應用尚處于初始階段,依然存在著種質資源保護力度小、近交衰退、育成品系少等問題。在近交系和封閉群中,長期近親繁殖、地域隔離、封閉群數量過小等問題均會引起遺傳漂變,雖然很多省市出臺了遺傳質量檢測的地方標準,但是還有很多小型豬品種沒有相應的標準,建立不同品種(品系)遺傳質量監測的位點體系是亟待解決的問題。相較于國外經過幾十年微生物凈化選育的高清潔度小型豬,我國小型豬微生物凈化程度普遍不高。在實際生產中,因為微生物凈化跟場區生物安全防控、免疫計劃、硬件設施、豬舍設計等方面都有關系,大部分養殖場不具備凈化的條件,很少能達到國家和地方關于微生物凈化的標準。而在基因工程培育中,后代成活率低和傳代遺傳不穩定依然是突出的問題。由此可見,小型豬實驗動物化還有很長的路要走。

全球范圍內,實驗用小型豬呈現出數量需求快速增長、質量需求亟待提高的趨勢,未來有必要充分發掘各小型豬品種的生物學特性和應用潛能。我國可以結合心血管、代謝等重大人類疾病研究需求,通過轉基因、基因編輯、分子設計等現代精準分子育種技術手段,培育自發性疾病模型的小型豬、定向培育特有表型的小型豬,為全面了解人類相關疾病的遺傳基礎和發病機制提供更好的平臺,也為新的診療藥物與技術的面市做好臨床前試驗,進而助力人類疾病的研究。