熱應激影響奶牛胚胎發育作用機制的研究進展

張 航,楊柏高,徐 茜,馮肖藝,杜衛華,郝海生,朱化彬,張培培,趙學明

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193)

奶業是關系國計民生的重要基礎性產業。近年來,隨著經濟的不斷發展,我國牛奶產量及城鄉居民奶類消費逐年提升[1]。據統計,2021年我國牛奶產量達3 683萬噸,比上年增長7.1%[2],與此同時,2021年我國人均奶類消費達42.3 kg,較上年增長10.2%[2],由此可見,牛奶已逐漸成為國民生活中不可替代的食品之一。2018年,國務院辦公廳發布《關于推進奶業振興保障乳制品質量安全的意見》,并在文件中明確指出“奶業是健康中國、強壯民族不可或缺的產業”。2022年,為進一步提升我國奶業競爭力,保障奶類供給安全,農業農村部發布《“十四五”奶業競爭力提升行動方案》,再次表明了奶業振興意義之重大。

然而,夏季高溫高濕環境極易誘發奶牛熱應激,進而對奶業發展造成嚴重威脅。研究表明,當溫度濕度指數(temperature-humidity index,THI)≥72時,奶牛自身無法實現充分散熱,便會出現熱應激,奶牛的生產及繁殖性能隨之受到嚴重影響[3]。Thornton等[4]的研究指出,如果世界一直處于高碳排放發展模式(SSP5-8.5),全球變暖將進一步加劇奶牛熱應激風險,到21世紀末期(2085年),由產奶量減少帶來的經濟損失將高達91.4億美元,占2005年全球牛奶生產價值的4.7%。2080年,僅美國奶業的損失便將高達22億美元[5]。若以熱帶牲畜單位(tropical livestock units,TLU)計算,本世紀末期中國每TLU產奶量相較2005年將減少5.4%,而巴西將減少13.1%[4]。此外,熱應激還導致奶牛繁殖力大幅下降。與冬季相比,奶牛在夏季的受孕率要低20%～30%[6]。統計資料顯示,2000—2017年連續18年,以色列夏季奶牛受孕率約為27.7%,顯著低于冬季的42.6%[7]。Gernand等[8]的研究還指出,當THI=80時,奶牛受孕率由約35%(THI<65)顯著降低至約16%。不僅如此,隨著氣候變暖問題不斷惡化,熱應激對奶牛的危害還將進一步增加[9]。據推測,到2050年及2070年,我國THI指數還將出現大幅上漲[10],由此可見,熱應激對我國奶業發展的威脅不容小覷。

本文主要就熱應激對奶牛內分泌、卵母細胞和胚胎發育的作用機制以及通過物理降溫、激素調節內分泌、優化卵母細胞培養體系、基因編輯等緩解奶牛熱應激影響的解決措施進行闡述,以期為緩解奶牛熱應激導致繁殖性能下降的產業問題提供思考。

1 熱應激影響奶牛胚胎發育的機制

1.1 熱應激對內分泌的影響

熱應激能夠直接對奶牛的內分泌系統造成影響,進而干擾奶牛排卵及妊娠等正常繁殖行為,影響奶牛繁殖性能。

當發生急性熱應激時,奶牛體內應激激素(如皮質醇)水平升高,從而對下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO軸)造成影響,使促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)和促性腺激素(gonadotropins,Gn)分泌減少并抑制卵巢活動,如:促黃體生成素(luteotropic hormone,LH)的分泌受熱應激影響而被抑制[11]。排卵前LH分泌出現延遲,增加了排卵失敗和卵巢囊腫的風險。低水平的LH還可能影響黃體的形成,這被認為是降低胚胎存活率的重要原因之一[11]。

當發生慢性熱應激時,奶牛孕酮(progesterone,P4)水平出現大幅下降,嚴重影響奶牛繁殖機能。慢性熱應激會導致奶牛卵泡發育異常,阻礙黃體形成并引起黃體功能受損,進而影響P4分泌[12]。P4由卵巢黃體分泌,主要影響胚胎的發育生長及干擾素Tau的生成,進而影響胚胎著床[13]。Nanas等[14]認為,高水平的P4是保障早期胚胎正常發育的最關鍵因素之一,P4水平下降將導致胚胎死亡率大大增加。此外,慢性熱應激還會引起奶牛分泌皮質醇濃度減少,血液中葡萄糖水平降低,進而使機體抵御熱應激的能力減弱,導致妊娠率降低[15]。

1.2 熱應激對卵母細胞的影響

熱應激對卵母細胞的影響主要體現在奶牛排卵以及卵母細胞的發育、成熟過程中,進而損害卵母細胞發育成胚胎的能力。Stamperna等[16]的研究表明,熱應激導致荷斯坦奶牛卵母細胞發育成囊胚的比例由30.3%降低至21.5%,利木贊牛由25.8%降低至14.2%。

奶牛的正常排卵依賴于精密的激素調節系統,而熱應激會導致奶牛體內激素水平改變,進而損害奶牛正常排卵。由于熱應激引起奶牛內分泌紊亂,引發奶牛卵泡發育異常,優勢卵泡的大小及優勢度降低,甚至生長出額外的大卵泡,導致熱應激奶牛產下雙胞胎的可能性升高,卵母細胞的發育質量也會受到卵泡異常的影響而出現下降[17]。即便到了溫度相對較低的夏季末、秋季甚至初冬季節,奶牛卵泡液中雌二醇含量依舊維持在較低水平,這將導致LH分泌受到抑制,奶牛發情及排卵異常,進而引起持續性卵泡及囊腫形成,而這也表明熱應激對奶牛卵巢卵泡的影響存在長時間的負面作用[11]。

當卵母細胞發育過程中遭受熱應激時,卵母細胞染色質凝聚出現異常,早期胚胎染色質重塑同樣受到嚴重影響。研究表明,夏季奶牛卵母細胞染色質致密程度大大降低,其發育至胚胎的能力隨之減弱。與此同時,牛卵丘細胞中DNA碎片化程度增加,凋亡比例大幅提高,進而影響卵母細胞胞質成熟,并進一步損害卵母細胞染色質凝聚[18]。Camargo等[19]指出,當卵母細胞體外成熟過程中遭受熱應激時,四細胞期胚胎中H3K9me3和HP1出現異常積聚,進而影響胚胎染色質重塑,并導致胚胎基因組激活及基因表達異常,胚胎發育嚴重受損。

熱應激還會增加卵母細胞遭受氧化應激損傷的風險。谷胱甘肽是一種高效的抗氧化劑,能有效清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)保護細胞免受氧化損傷,而熱應激引起卵母細胞內谷胱甘肽水平降低,導致卵母細胞更易遭受氧化應激影響[20]。牛卵母細胞膜脂肪酸含量豐富,膜脂肪酸的含量及組成成分對牛卵母細胞后期發育至關重要。而在夏季高溫條件下,牛卵母細胞和顆粒細胞中飽和脂肪酸的比例升高,且高于單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸,這主要是由于溫度升高引起牛卵母細胞ROS水平增加,加劇卵母細胞遭受氧化應激損傷[21]。

此外,熱應激引起牛卵母細胞微管蛋白和微絲受損。微管蛋白和微絲作為細胞骨架參與細胞核和細胞器的運輸,而細胞骨架改變將引起卵母細胞成熟異常,卵母細胞的成熟時間或將因此提前,進而增加受精失敗及胚胎發育異常的風險[22]。同時,線粒體的運輸也要依賴細胞骨架,夏季奶牛卵母細胞細胞骨架損傷導致線粒體分布異常概率增加,這也被認為是影響卵母細胞發育的重要原因[22]。

1.3 熱應激對胚胎的影響

熱應激能引起母體體內溫度升高并導致母體生理狀態改變,進而影響奶牛胚胎發育,導致奶牛受孕率降低。Cordeiro等[23]的研究指出,當THI由73.1升高至75.7時,胚胎移植奶牛受孕率由56.3%降低至33.3%。Abdel等[24]指出,當THI≥73時,性控胚胎移植奶牛受孕率由52.50%降低至35.71%。

早期胚胎對高溫十分敏感。在受精當天至胚胎發育到2細胞期之間,若奶牛處于熱應激環境中,則隨后胚胎囊胚率便會出現明顯下降[22]。Stamperna等[25]的研究表明,熱應激會導致牛早期胚胎基因表達紊亂。他們的研究指出,GSTP1、BAX1、PTGS2、DNMT3、TLR4、PLAC8、AKR1B1、HSF1和HSPA1A的表達存在協同性,對胚胎的正常發育至關重要,而熱應激導致這些基因表達的協調性喪失。與此同時,熱應激還導致胚胎中氧化應激相關基因(如:COX1、AKR7A2、CBR1、GGH、GSTA4等)表達增加,胚胎發育質量相關基因(如:AQP3、ATP1A1等)表達減少,進一步反映熱應激對胚胎發育造成損傷[26]。

胚胎發育至4細胞期時便開始獲得熱耐受能力,一直到囊胚階段,胚胎的耐熱能力會不斷增強,此時熱應激對胚胎發育的影響相對有限[21]。研究表明,當胚胎分裂至8～16細胞期時,胚胎基因組激活,轉錄活性增加,此時熱應激相關蛋白及內源性抗氧化酶基因轉錄激活,胚胎耐熱性大幅增加[25]。在此階段,胚胎即便遭遇熱應激,依舊具有繼續發育的能力。不過,熱應激一定程度上還是會對該階段胚胎造成損傷,但在胚胎體外培養過程中使用抗氧化劑處理可以有效緩解這一情況[14]。

除了溫度升高直接影響胚胎發育外,熱應激還會改變奶牛體內激素濃度,引起輸卵管及子宮環境變化,進而影響胚胎發育[27]。妊娠后期時,熱應激能引起奶牛母體體溫升高,進而誘發胎兒宮內生長遲緩(intrauterine growth retardation,IUGR),導致胎兒早產或胎兒過小[28]。此外,由于熱應激引起奶牛采食量減少,奶牛營養不足,供給胚胎的營養也會減少。奶牛機體散熱增加導致流經子宮血液減少,進而引起胚胎發育所需的養分、氧氣及水分相對不足,胚胎發育受阻。熱應激引起的奶牛內分泌紊亂也增加了胎兒流產的可能[29]。

2 改善熱應激奶牛胚胎發育的措施

2.1 改進奶牛飼養管理

2.1.1 物理降溫 物理降溫是緩解奶牛熱應激的主要策略。傳統降溫方式包括直接法和間接法。其中,直接法通過強制蒸發動物體表水分以達到降溫目的,而間接法則通過遮蔭、灑水等方式降低環境溫度,從而間接幫助奶牛散熱[30]。以色列夏季溫度高、濕度達50%～90%,因此當地奶牛養殖常采用直接法幫助奶牛降溫,即:用水噴灑奶牛30秒,通風4.5 min,每次循環進行30～45 min,每日5～7次,用此方法,奶牛體溫降至39 ℃以下,受孕率從17%顯著提高至57%,熱應激現象得到有效緩解[31]。此外,添加遮蔭設備,減少陽光直射,也是幫助奶牛降溫的有效手段。有研究指出,太陽能電池板既能提供遮蔭,還能生產電能,其遮蔭效果也大大優于傳統遮陽布,在緩解奶牛熱應激的同時提高了農民收入,促進了畜牧業的可持續發展[32]。研究表明,奶牛在太陽能電池板遮蔭條件下,體表溫度降低6 ℃[33],而為每頭奶牛提供3 m2的遮蔭便能有效阻隔光照[32]。隨著太陽能電池板價格的不斷降低,這種新型的遮陽方式或將具有廣闊的前景[32]。

2.1.2 激素緩解內分泌紊亂 激素治療是調節奶牛內分泌的重要途徑,能有效緩解熱應激引起的奶牛內分泌紊亂。熱應激通過破壞奶牛激素水平,引發卵泡發育異常并損害卵母細胞及胚胎的發育,造成奶牛繁殖力大幅下降[30]。通過反復注射GnRH和前列腺素F2α(prostaglandin F2α,PGF2α)能夠誘導卵泡生成,去除受損卵泡,進而減少熱應激對卵泡功能的負面影響[34]。此外,高溫會抑制黃體功能,導致P4分泌減少,進而影響胚胎著床甚至造成胚胎死亡[35],而補充P4則被認為是有效的應對策略[30]。研究表明,聯用GnRH-PGF2α和P4能進一步提高熱應激奶牛的繁殖力[34]。

然而,無論是物理降溫還是激素治療,都只能有限地挽救熱應激奶牛的繁殖力[34]。因此,開發更多抗熱應激方式與這兩種方法聯合使用,或將進一步促進熱應激條件下奶牛胚胎發育。

2.2 添加IGF1改進體外胚胎生產體系

胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factors 1,IGF1)具有促進細胞增殖[36-37]、抗凋亡等作用[38],能有效保護細胞免受各類應激傷害。研究表明,添加IGF1可以促進體外胚胎發育并提高胚胎在發育過程中對熱應激的抵抗力[39],是改善體外生產胚胎耐熱性的有效手段。

2.2.1 IGF1提高卵母細胞抗熱應激能力 IGF1能從多方面緩解熱應激對繁殖帶來的負面影響,包括促進熱應激條件下卵母細胞成熟、胚胎發育及提高熱應激胚胎移植后的妊娠率等。Ascari等[40]的研究顯示,添加IGF1能夠提高熱應激卵母細胞線粒體膜電位,減少囊胚內細胞團的細胞凋亡。他們指出,高溫等應激條件會刺激卵母細胞線粒體膜通透性轉換孔開放,引起線粒體膜電位及線粒體活性降低,進而導致囊胚質量下降,而IGF1有效改善了這一情況。Rodrigues等[41]認為,熱應激會導致卵母細胞線粒體異常,引起線粒體途徑的細胞凋亡,而IGF1能通過PI3K/Akt途徑改善線粒體功能,提高線粒體膜電位,進而提高熱應激條件下牛卵母細胞存活率。

此外,Rodrigues等[41]的研究還表明熱應激主要損傷卵母細胞細胞質,引起細胞骨架損傷,干擾細胞發育。當卵母細胞處于熱應激條件下時,胞內鈣離子濃度升高,促進凝溶膠蛋白活化。該蛋白活化后能結合G-肌動蛋白單體及微絲,引起微絲斷裂或解體,紡錘體形態異常,進而干擾卵母細胞減數分裂。他們認為,添加IGF1能激活p70S6激酶,從而增加微絲穩定性,減小熱應激對細胞骨架造成的損傷。

Lima等[42]還指出,IGF1對熱應激卵母細胞發育能力的改善效果很大程度上依賴于IGF1的濃度。當IGF1添加濃度過高時,反而會抑制IGF1R蛋白的表達,對卵母細胞及胚胎的發育造成負面影響。而添加生理濃度的IGF1(12.5 ng·mL-1)能更有效地抵御熱應激帶來的負面影響。

2.2.2 IGF1提高胚胎抗熱應激能力 添加IGF1能有效改善熱應激狀態下奶牛胚胎的發育情況,顯著提高夏季奶牛妊娠率及產仔率[43]。Jousan和Hansen[39]的研究發現,添加IGF1能有效減少熱應激胚胎凋亡并促進熱應激胚胎發育至囊胚階段。添加IGF1還會減少胚胎中HSp70 mRNA。細胞在遭受應激條件刺激時會促進HSp70表達升高以阻止細胞凋亡,而HSp70 mRNA的減少證明IGF1能有效減少細胞應激帶來的負面影響[44]。

IGF1能通過調控基因表達進而提高胚胎的熱應激耐受力。Bonilla等[45]指出,添加IGF1會引起胚胎中涉及凋亡、抗氧化等功能的基因出現差異表達,其中包括IL6ST在內的5個抗凋亡基因上調,DPYSL4等5個促凋亡基因下調,GSTM2等兩個抗氧化基因上調,而IGF1提高胚胎的抗熱應激能力或許和這些基因的差異表達有關。

IGF1還通過PI3K/Akt信號通路及MAPK信號通路提高胚胎對熱應激的抵抗力。Jousan等[46]的研究指出,當胚胎發生熱應激時,IGF1激活PI3K/Akt信號通路發揮抗凋亡作用。Akt能夠抑制Bad、caspase-9等促凋亡蛋白的表達,同時促進Bcl-2、Bcl-x等抗凋亡蛋白水平升高,進而提高熱應激條件下胚胎的存活率。此外,IGF1通過激活MAPK信號通路促進胚胎細胞增殖,進而促進熱應激條件下胚胎的發育。

2.2.3 IGF1聯用其他藥物 IGF1與其他藥物聯用或許能發揮更強大的抗熱應激效果。熱應激會從多方面損傷卵母細胞及胚胎的發育能力,包括誘導凋亡、損傷線粒體功能、促進氧化應激等[47]。而IGF1提高胚胎抗熱應激能力主要依賴于PI3K/Akt和MAPK信號通路對胚胎凋亡的抑制作用及對胚胎發育的促進作用[46]。因此,在體外胚胎生產過程中,選擇高效的線粒體保護藥物或抗氧化劑與IGF1聯用,或能進一步促進IGF1對胚胎抗熱應激能力的提升效果。

輔酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)是線粒體呼吸鏈上的關鍵成分,具有增強線粒體功能、抗氧化等效果。Gendelman和Roth[48]的研究表明,添加CoQ10能顯著提高秋季牛卵母細胞發育到囊胚的能力,并改善卵母細胞線粒體分布。CoQ10通過提高線粒體質量、抑制氧化應激進而促進卵母細胞發育的能力已在牛[49]、豬[50]、小鼠[51-52]等多個物種上得到證明。

褪黑素(melatonin,MT)是一種高效的抗氧化劑,能有效減少熱應激期間ROS對卵母細胞發育造成的氧化損傷。研究表明,添加褪黑素有效減少了熱應激條件下卵母細胞ROS的產生[53],促進線粒體功能相關基因轉錄[54],并提高熱應激條件下卵母細胞發育成囊胚的能力[55]。還有研究指出,褪黑素能調節卵母細胞及胚胎發育過程中表觀遺傳修飾[56],并促進卵母細胞發育相關基因(GDF9、MARF1和DNMT1a等)[57]、胚胎抗凋亡基因(BCL2L1等)表達,抑制促凋亡基因(p53、Bax等)表達[58],進而提高卵母細胞及胚胎的發育能力。

因此,在奶牛體外胚胎生產過程中,添加IGF1的同時聯用CoQ10、褪黑素等藥物,或許能更加有效的提高胚胎對熱應激的抵抗能力。

2.3 基因編輯

2.3.1HSPA1L基因HSPA1L是熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)的編碼基因之一。研究表明,當HSPA1L啟動子區發生胞嘧啶缺失突變時,細胞內HSPA1A/L 轉錄產物及HSP70表達量升高,進而增強細胞對熱應激的耐受力。因此,利用基因編輯技術對牛胚胎HSPA1L基因進行修飾或是高效解決奶牛熱應激問題的有力手段。

HSP70是大多生物細胞中含量最高的一類熱休克蛋白,易受高熱、高氧等多種應激條件誘導表達[59],能有效提高細胞對各類應激的耐受能力[60]。HSP70的作用包括:作為分子伴侶正確折疊、組裝蛋白質,促進變性蛋白降解,抑制細胞凋亡等[60],能有效幫助細胞緩解熱應激造成的損傷。Stamperna等[61]的研究表明,在牛卵母細胞體外成熟過程中添加HSP70能夠促進胚胎發育過程中信號轉導,增強胚胎抗氧化能力,抑制胚胎凋亡發生,進而增強胚胎在發育過程中對熱應激的耐受力。他們隨后的研究還指出,在牛早期胚胎體外發育過程中添加HSP70能夠有效緩解高溫對胚胎發育的負面影響,顯著提高熱應激條件下的囊胚產量(15.9%→21.4%)[25]。

奶牛中HSPA1L和HSPA1A均為HSP70的編碼基因,二者編碼序列幾乎完全相同,常規檢測方法無法區分二者的轉錄產物[62]。研究表明,當HSPA1L啟動子區第895位堿基處出現胞嘧啶缺失時,荷斯坦奶牛淋巴細胞對熱應激的耐受力增加,HSPA1A/L 轉錄表達顯著升高,HSP70蛋白表達水平升高[63]。Ortega等[64]指出,HSPA1L缺失突變能提高奶牛早期胚胎發育過程中對熱應激的耐受力。胚胎發育早期對高溫敏感,二細胞期胚胎受到熱應激刺激時便通過轉錄HSPA1A/L抵抗熱應激,而HSPA1L缺失突變能使該轉錄水平進一步提高[64],HSP70蛋白表達增加[63],進而幫助胚胎有效應對熱應激造成的負面影響。他們的研究結果表明,在應激條件下(高氧、高溫)培養牛胚胎,存活囊胚中HSPA1L缺失突變的頻率更高,這意味著HSPA1L缺失突變能夠增強奶牛胚胎對熱應激的抵抗力,進而提高熱應激條件下胚胎的存活率[64]。

2.3.2PRLR基因 奶牛毛發長度影響奶?？篃釕さ哪芰?。在炎熱環境中,被毛較短的牛能更加地高效散熱,因此這類牛對熱的耐受性更強[65]。研究表明,當催乳素受體基因(PRLR)上出現SLICK突變時,奶牛表現出短被毛的光滑表型,抗熱應激的能力大大提高[62]。

催乳素(prolactin,PRL)具有抑制毛發生長[66]及毛囊發育[67]的功能。當PRLR上出現SLICK突變時,PRL對毛發的抑制作用被放大,進而導致牛呈現短毛、光滑表型[68]。哺乳動物PRLR主要包括長型(long form)和短型(short form)[69],而SLICK突變的PRLR長度介于長型PRLR和短型PRLR之間[62]。目前已知,PRLR上的SLICK突變有3種,包括SLICK1、SLICK2和SLICK3。其中,SLICK1突變發現于Senepol牛上,SLICK2突變發現于Carora和Criollo Limonero牛,而SLICK3突變在Criollo Limonero牛中被發現[62]。這3類突變均屬于移碼突變,能使PRLR的轉錄提前終止,形成“截短型受體”[62]。有研究指出,SLICK突變導致催乳素信號傳導過程中參與JAK2/STAT5激活的蛋白質的C末端區域被截斷[70],其中7個酪氨酸殘基中有2個發生丟失[68],這或許會影響STAT5的激活[70]。不過,依賴PI3K/MAPK等途徑進行信號傳遞的短型PRLR則不會受到影響[68]。在此基礎上,牛表現出短毛性狀,體溫調節能力也隨之增強[68]。

此外,SLICK1突變在提高?？篃釕つ芰Φ耐瑫r未發現對牛存在負面影響。Carmickle等[71]的研究表明,攜帶SLICK1等位基因的荷斯坦奶牛犢牛的出生重、平均日增重及斷奶重與野生型荷斯坦奶牛相似。Sosa等[68]指出,SLICK1等位基因雜合的荷斯坦奶牛直腸及瘤胃溫度低于野生型。SLICK1突變還提高了荷斯坦奶牛體溫調節的能力[72],并且不會對奶牛的胚胎發育造成負面影響[70]。不僅如此,由于短被毛的奶牛散熱能力更強,對高溫的耐受性也更高,因此短被毛奶牛在炎熱環境中產奶量也高于野生型奶牛。而在寒冷季節,短被毛奶牛的產奶量則與野生型奶牛相似[73]。由此可見,短被毛性狀或許能有效幫助奶牛應對高溫環境,并提高奶牛產奶量[74]。

3 結 語

環境溫度過高是引發奶牛熱應激的直接原因。而熱應激通過影響奶牛激素水平及干擾奶牛卵母細胞、胚胎的正常發育,進而破壞奶牛繁殖性能,造成巨大經濟損失。因此,在奶牛養殖業發展中,急需尋找到高效、經濟的應對熱應激的方法。如:通過物理降溫及激素治療等手段,調節奶牛體溫及內分泌水平;在體外胚胎生產過程中添加IGF1等藥物,緩解胚胎發育過程中熱應激造成的損傷;利用基因編輯技術修飾奶牛胚胎HSPA1L、PRLR等基因,改善胚胎及奶牛耐熱性。聯合使用多種抗熱應激手段,或將從根本上有效提高熱應激條件下胚胎的發育能力,具有廣闊的發展前景。