果膠及其微生物降解研究進展

劉金梅,常文環,陳志敏,鄭愛娟,邱 凱,王澤棟,劉國華,蔡輝益

(中國農業科學院飼料研究所 農業農村部生物飼料重點實驗室,北京 100081)

果膠是一類廣泛存在于植物細胞壁中膠層和初生壁中的酸性雜多糖,與纖維素、半纖維素共同構成細胞壁,對于維持細胞結構起著重要作用。主要存在于果渣、餅粕、糟糠等食品加工副產品中,其分子量在60 000～318 000 g·mol-1,并隨植物來源、果實或植物階段、提取條件和方法而變化[1]。果膠于1790年首次在蘋果渣中發現[2],直到1825年法國藥劑師Braconnot[3]才真正從胡蘿卜中分離出這種水溶性物質,并命名為“pectin”,來源于希臘語“pectos”,意為凝固、凝結。之后,人們逐漸認識到果膠的作用,因其具有良好的凝膠性和乳化穩定性,被廣泛應用于食品工業中,用作乳化劑、穩定劑、凝膠劑、增稠劑和護色劑等[4]。但在單胃動物營養中果膠被看成是一種抗營養因子[5],因為果膠的黏性影響了本身和其他營養物質在消化道中的消化和吸收利用,需要對其生物降解以提高飼料的生物學效價。

1 果膠的分類、結構與功能

1.1 果膠的分類

根據果膠側鏈結合的物質及理化性質,可分為原果膠、果膠及果膠酸三大類?！霸z”是指植物中存在的不溶于水的果膠物質,經限制性水解后產生果膠或果膠酸,存在于植物的完整組織中;“果膠酸”是一種膠態聚半乳糖醛酸,含有的甲酯基團比例可忽略不計,果膠酸通過甲酯化則變成了果膠;“果膠”是果膠酸部分甲酯化且含有中性糖的果膠物質,通常被稱為聚半乳糖醛酸甲酯。在果膠中,半乳糖醛酸單元的羧基高達75%通過酯化作用與甲醇連接,其通過與細胞壁中的纖維素結合,為細胞壁提供剛性[6]。

1.2 果膠的結構

果膠是自然界中最復雜的生物大分子之一,其主要成分是D-半乳糖醛酸,由α-1,4糖苷鍵連接形成主鏈。其他糖單位,包括核糖、半乳糖、阿拉伯糖和蔗糖,插入到聚合物中。主鏈中的羧基部分能夠被酯化,根據酯化程度的不同又可分為高甲氧基果膠和低甲氧基果膠。根據果膠分子結構中主鏈和側鏈組成的不同,多糖結構分為高半乳糖醛酸(HGA)、鼠李半乳糖醛酸I (RG I)和鼠李半乳糖醛酸II (RG II)[7-9]。由于其線性結構,聚半乳糖醛酸(HG)區域通常被稱為“平滑區”,而包括RG-I、RG-II在內的分支區被稱為“毛發區”[7,10]。但是,關于這三個結構域是如何組裝到一起的仍然有爭議。典型的假設是指 HG、RG-I 和 RG-II 主鏈共價交聯形成嵌段共聚物的模型,但三個主要結構域的相對位置仍不完全清楚。

1.3 果膠的分布

果膠廣泛存在于植物的根、莖、葉、果實和種子中,是細胞壁的重要組成部分,不同植物的果膠含量不同,甚至同種植物的不同部位、不同生長時期的果膠含量也不相同。通常雙子葉植物及部分植物種皮或果皮中的果膠含量較多,草類植物的果膠含量較少,而單子葉植物中的果膠含量一般為雙子葉植物的1/10左右。玉米、豆粕、苜蓿、秸稈類等飼料原料中均含有果膠:其中玉米、小麥等谷物中果膠含量不到1%,大部分為淀粉,約占65%～70%;秸稈類飼料中果膠含量較低,膠含量只有0%～5%[11];苜蓿中果膠含量較高,約為10%～15%。許多食品工業原料也被發掘可作為飼料原料,如柑橘皮、蘋果皮、山楂、向日葵盤、甜菜渣等[12],對部分蔬菜的果膠含量進行了研究[13]。因此,在生產實踐中,開發非常規飼料用作單胃動物的飼料原料時,應降低其果膠含量,以提高其營養價值和利用效率。

1.4 果膠的功能

1.4.1 果膠的益生作用 果膠對人類健康具有多種積極作用。研究表明,果膠能減緩食后血糖和胰島素濃度的升高,食物中添加一定量的果膠對糖尿病患者有益。20世紀60年代,研究發現果膠能降低膽固醇水平。后續研究表明,果膠物質能降低血液總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇比等[14-15]。果膠還可以與癌細胞表面的半乳糖凝集素(半乳糖結合凝集素)結合,干擾細胞-細胞或細胞-基質黏附,抑制轉移性病變[16],誘導癌細胞凋亡[17]。

1.4.2 果膠的營養作用 果膠可被反芻動物的瘤胃微生物降解產生乙酸、丙酸等揮發性脂肪酸而被動物體吸收利用。不僅為反芻動物提供能量,還對瘤胃內環境的穩定具有極強的調控作用。Van Soest[18]報道果膠在反芻動物營養中具有獨特的作用,含果膠豐富的飼料具有和金屬離子如鈣離子、鎂離子、鈉離子、鉀離子等具有較強親和能力和離子交換能力,當瘤胃環境pH過低時,飼料中的果膠類物質可把陽離子釋放到瘤胃液中,對瘤胃內環境起到穩定和緩沖作用。果膠的這些特點,使其成為理想的用于瘤胃發酵的碳水化合物。李勇等[19]研究發現,高果膠飼糧對維持綿羊瘤胃內環境穩定和促進氮利用方面有一定的積極作用。

1.4.3 果膠的抗營養作用 由于果膠吸水后黏性大大增加,所以果膠對單胃動物的蛋白質消化和利用有負面作用。它降低了營養物質與消化酶類的接觸。黏性多糖不但抑制營養物質的消化吸收,而且還能與腸道分泌的消化酶結合,降低消化酶活性,甚至引起腸黏膜形態和功能的變化。此外,果膠含豐富的羧基,能夠螯合消化道中的二價離子,尤其是鈣離子,從而抑制了單胃動物對鈣的吸收利用。因此,果膠在單胃動物營養中被看成是一種抗營養因子[5]。據報道,飼糧中果膠類物質太多會降低肉雞的生產性能,影響糖類和蛋白質等營養成分的利用率[20]。生長豬飼糧中添加4%和8%的蘋果果膠顯著降低了豬的回腸氨基酸消化率,增加了食糜黏度,可引起胃腸功能的改變,導致氨基酸的消化率和利用率降低[21]。有研究推測,果膠通過改變腸道微生物區系對仔鵝生長性能、屠宰性能、養分利用率等產生不利影響[22]。

2 果膠的降解

2.1 果膠的降解方法

果膠的降解方法主要是化學法和酶解法?；瘜W法降解通常是用酸水解果膠,最大的特點是降解速度快(特別是在加熱的條件下),降解完全,得到大量單糖,寡糖產率低。由于降解過程中加入了各種反應試劑,使降解反應的控制難度增大、降解產物的分離純化不易進行。因此,目前較少采用單純酸水解的方法制備寡聚半乳糖醛酸。酶法降解果膠多糖,即選用特定的一種或幾種酶對果膠分子進行降解,讓其選擇性地切斷果膠分子中的α-1,4糖苷鍵,制備特定的果膠寡糖。該方法不發生副反應,反應條件溫和,工藝較易控制,對果膠分子結構幾乎沒有破壞,是一種較為理想的降解方法。

2.2 果膠酶降解

2.2.1 果膠酶的定義與來源 果膠酶是降解果膠物質的生物催化劑[23-25],能直接作用于植物細胞壁間質及細胞壁成分,從而崩解細胞壁,釋放細胞內的養分。果膠酶分布很廣,主要存在于高等植物和微生物中,細菌、放線菌、酵母和霉菌都能代謝合成果膠酶。由于生長速度快、分布廣泛、發酵時間短和更容易獲得基因改造,而且催化專一、侵蝕性小、環保節能,微生物酶正在取代化學催化劑[26-27]。據報道,35%的果膠酶來自細菌,55%來自真菌和酵母,15%來自植物或動物[28]。自20世紀70年代以來,主要從微生物特別是真菌中商業化制備果膠酶[29]。

2.2.2 果膠酶的分類與作用 根據酶委員會和國際生物化學聯合會,果膠酶屬于水解酶類[6]。按照作用方式的不同可以分為原果膠酶、果膠酯酶和解聚酶(水解酶和裂解酶)[25-26]。原果膠酶水解不溶性原果膠為水溶性果膠,切斷聚甲氧基半乳糖醛酸和阿拉伯糖之間的化學鍵;果膠酯酶催化果膠的甲氧基去酯化形成果膠酸;水解酶(聚半乳糖醛酸酶和聚甲基半乳糖醛酸酶)分別催化果膠酸和果膠中 α-1,4糖苷鍵的水解;而裂解酶(聚半乳糖醛酸裂解酶和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶)催化α-1,4糖苷鍵的裂解,通過反式消除反應形成不飽和半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯,具體見表1和圖1。

a. PMG和PG的作用方式和產物: PG形成飽和半乳糖醛酸、PMG形成飽和甲氧基半乳糖醛酸;b. PE的作用方式和產物:PE形成果膠酸;c. PL和PGL的作用方式和產物:PGL形成不飽和半乳糖醛酸、PL形成不飽和甲氧基半乳糖醛酸。PG.聚半乳糖醛酸酶;PMG.聚甲基半乳糖醛酸酶;PE.果膠酯酶;PL.裂解酶;PGL.聚半乳糖醛酸裂解酶a. Mode of action and products of PMG and PG: Saturated galacturonic acid formed by PG and saturated methoxylated galacturonide by PMG; b. Mode of action and products of PE: Pectic acid formed by PE; c. Mode of action and products of PGL and PL: Unsaturated galacturonic acid formed by PGL and unsaturated methoxylated galacturonide by PL. PG. Polygalacturonases; PMG. Polymethylgalacturonases; PE. Pectin esterase; PL. Pectin lyase; PGL.Polygalacturonate lyase圖1 果膠酶的作用機理[26]Fig.1 Mechanism of action of pectinase[26]

表1 果膠酶的分類與作用方式Table 1 Classification and mode of action of pectinases

2.3 果膠酶的應用

2.3.1 果膠酶在輕工業中的應用 果膠酶的應用非常廣泛,它們在食品、紡織、飲料、紙漿和造紙、生物燃料工業等領域都有著多種應用[6]。果膠酶占全球工業酶市場的25%,且其應用占比還在不斷增加[30]。果膠酶的首次商業應用始于1930年,用于澄清果汁,后來被用于釀造葡萄酒和果汁。

2.3.2 果膠酶在飼料工業中的應用 果膠是單胃動物飼料中的抗營養因子。果膠酶能夠使果膠質完全分解或部分降解為小分子物質,使細胞中的營養物質釋放出來,有利于機體的吸收和利用;有效降低飼料黏度,提高動物的生產性能與飼料利用率;同時可以降低飼料中的纖維含量,促進纖維中營養物質的釋放[31],因而越來越受到全球范圍內飼料行業的高度重視[32]。果膠酶通過降低飼料黏度,促進了營養物質吸收,減少了動物排便,減少了環境污染[26,31,33]。此外,果膠酶的單位酶活相對較高,催化效率較高,具有很好的應用前景[34]。

在飼料工業中,果膠酶一般與纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等酶制劑復配使用,以提高飼料的營養價值和適口性[35]。果膠酶首先作用于植物細胞壁的外層,使細胞壁松散,為其他酶發揮作用提供便利,因此,果膠酶在植物細胞壁降解的初始階段非常重要。有研究表明,當豆粕在飼料中的含量較高時,“木聚糖酶+纖維素酶+果膠酶”的組合比單用“木聚糖酶+纖維素酶”更好[36]。目前,對飼用果膠酶比較詳細、深入的研究報道較少。

3 產果膠酶微生物

3.1 產果膠酶微生物的分類

據報道,在某些植物、細菌、真菌、酵母、昆蟲、線蟲[37]中均發現了果膠酶的存在,目前國內的工業化果膠酶大多來自于微生物固態發酵。產生果膠酶的微生物主要包括細菌和真菌。真菌產生各種果膠酶,包括聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠酯酶(PE),其中黑曲霉應用較廣泛。一些細菌(地衣芽孢桿菌、氣單胞菌、乳酸桿菌等)、念珠菌和放線菌(如鏈霉菌)也被使用,其中,絲狀真菌是最常用的。產果膠酶的真菌有曲霉菌(Aspergillus)、青霉菌(Penicillium)、根瘤菌(RhizobiumFrank)、鐮刀菌(Fusarium)、白地霉(Geotrichumcandidum)、腐霉屬(Pythium)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等;產果膠酶的細菌有歐文氏菌(Erwinia)、假單胞菌(Pseudomonasadaceae)、芽孢桿菌(Bacillus)、梭狀芽胞桿菌(Clostridium)、放線菌屬(Actinomyces)等。美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)認為,在所有產果膠酶的微生物中最安全的菌株是黑曲霉(Aspergillusniger)[33]。

3.2 產果膠酶微生物的來源

產果膠酶的微生物來源廣泛,主要從變質的水果、土壤、腐爛的農業廢棄物、動物等中分離出來。Geetha 等[38]從收集的廢棄果皮,如橙皮、柑橘皮中篩選到一批細菌和真菌,經鑒定細菌為芽孢桿菌屬和假單胞菌屬。真菌培養物被鑒定為黑曲霉、黃曲霉和產黃青霉菌。發現所有細菌和真菌培養物均產生可觀水平的果膠水解酶。Naga Padma等[39]使用橙皮作為底物,從變質的水果、蔬菜和土壤中分離出酵母菌,在液態發酵條件下獲得了最大果膠酶活性為21 U·mL-1。Zeni 等[40]從農業廢料樣品中分離出20個菌株能夠合成活性高于 3 U·mL-1的果膠酶,其中黑曲霉 ATCC 9642 微生物和新分離的 W23、W43 和D2(青霉菌)酶活性為 30、41、43和 45 U·mL-1。Siddiqui等[41]從腐爛果皮分離到1株嗜熱真菌菌株,經分子生物學鑒定,菌株為膿毒根瘤菌。純化的酶是分子量為32 ku 的單體,首次在該物種中純化聚半乳糖醛酸酶,該酶水解果膠的最適溫度為 55 ℃,最適pH為5.0,在pH 2.5～4.5 之間具有良好的穩定性。姜曉霞等[42]研究發現,在日糧中添加從鵝盲腸篩選得到的草酸青酶產的果膠酶能顯著提高肉雞后期的生產性能,這可能是試驗所用的產果膠酶是動物源性的,與其它來源的酶相比,在溫度、pH等方面能更好地適應動物的消化道生理條件,從而更充分地發揮自身的作用。表2列出了部分產果膠酶微生物的來源及分類。

表2 一些產果膠酶微生物來源及分類Table 2 Sources and classification of some microorganisms producing pectinase

3.3 產果膠酶微生物的基因改造

近年來,通過重組DNA技術,如基因克隆、表達、突變等對產果膠酶微生物進行改良?；蚬こ虨槊笇W家提供了各種技術,使他們能夠以具有成本效益的方式生產大量商業用途的特定酶[30]。近幾十年來,主要從曲霉菌、炭疽菌、鐮刀菌和灰霉菌等中克隆表達果膠酶基因,基因總數至少有70個,對果膠酶的序列、結構、生物學特性等方面有了更深入的了解。果膠酯酶基因從黑曲霉、棘孢曲霉和米曲霉中分離,多聚半乳糖醛酸酶基因從黑曲霉、馬克斯克魯維酵母、釀酒酵母、青霉菌、農桿菌、熱厭氧桿菌以及許多植物病原真菌中分離。隨著分子生物學的出現,對果膠酶基因的克隆和在各種宿主中的表達進行了大量的研究。Gon?alves等[48]使用轉基因的灰假單胞菌構建體來實現果膠酶的生產。與野生型菌株相比,這種重組結構體與果膠酶基因結合,使培養物中果膠裂解酶和聚半乳糖醛酸酶的產量分別增加了13和424倍。Zhang等[49]將青霉菌的Exo-PG基因克隆到帶有GAL1啟動子的質粒中,并在酵母中進行異源表達,成功地在培養基中產生了酶活性為6.67 U·mL-1的重組酶。研究發現,通過紫外線誘導的灰青霉菌突變體產生果膠酶的能力比野生菌株增加了7.8倍[50]。有研究人員篩選出1株特異性灰青霉菌株(PG63)并開發出高效的轉化系統,用于獲得高效表達果膠裂解酶的菌株。他們用兩種不同方式對其進行遺傳改造,使兩種類型的轉化菌株都具有了果膠裂解酶(PL)活性的特征,而且相同條件下產生的PL活性比對照菌株高132倍[51]。后續研究還發現,重組灰霉菌菌株105能利用低成本的甘蔗汁,大量生產細胞外果膠裂解酶(PL),重組菌株105的PL產量是對照菌株的112倍[52]。在現代生物技術時代,科學家們通過這些技術不僅能夠研究感興趣的特定基因,還能獲得特定蛋白質的定向表達和過表達。

3.4 發酵條件

工業上生產果膠酶的方法有液體深層發酵(SMF)和固態發酵(SSF),而固態發酵的酶產量更高。底物選擇、工藝條件、含水率、培養時間、接種量、pH、溫度、抑制劑/激活劑的存在以及碳源和氮源的加入都是影響果膠酶生物合成的關鍵因素。通過深層和半固體發酵估計果膠酶產量,并且觀察到半固體發酵的多聚半乳糖醛酸酶產量高于深層發酵的多聚半乳糖醛酸酶產量。用于固態發酵的底物主要來自水稻、玉米、根莖、塊莖和豆類等谷物。除此之外,果渣、芒果皮、橘子皮及其他水果和蔬菜廢棄物也被大量利用。

4 研究現狀與發展趨勢

果膠酶在一定條件下催化反應的能力很強,在很多工業部門中都是重要的生物催化劑。果膠酶能夠有效地降解植物飼料中的細胞壁,補充動物內源酶的不足,消除抗營養因子,提高飼料轉化率。目前國內外生產的果膠酶主要是從土壤和腐敗植物分離的菌株發酵獲得,而且研發剛剛起步,存在著發酵和提取工藝不夠成熟和產酶量低等關鍵技術問題。因此,為了降低飼料生產成本,目前用于飼料生產的酶制劑還只能添加沒有純化的復合酶制劑,果膠酶的應用只在小規模試用,并未得到大規模的普及。微生物果膠酶是工業領域的主要酶,它們被廣泛用于各種工業中,并且新的應用仍在不斷涌現。飼料行業中果膠酶仍然存在菌種產量低、成本高、易失活且添加量和添加方式不明確等一系列問題。因此,篩選高酶產量菌株或者利用生物技術對目標菌株進行改造變得十分迫切。

酶工程技術是能將酶或者微生物細胞、動植物細胞等在一定的生物反應裝置中,利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段將相應的原料轉化成有用物質并應用于社會生活的一門科學技術。它包括酶制劑的制備,酶的固定化,酶的修飾與改造及酶反應器等方面內容?？梢允褂妹腹こ谭椒ㄌ岣呙傅幕钚?但在酶處理過程中,需要在特定的溫度范圍內進行,維持該溫度范圍會大大增加工業成本。因此,使用耐熱酶十分有必要,而且在廣泛的溫度和pH范圍內穩定的菌株會很有優勢。所以,篩選、發現及構建具有高細胞外果膠酶活性、在較寬的溫度和pH范圍內具有較長時間穩定性的新型微生物,會是近期研究的重點。安全、有效的產果膠酶菌株的分離及改造具有重要意義。