幼齡反芻動物腸道微生物定植規律及其營養調控研究進展

禹世雄,魏凌云,徐甜甜,焦金真,蔣林樹,賀志雄*

(1.武漢工程大學環境生態與生物工程學院,武漢 430205;2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所 亞熱帶農業生態過程重點實驗室 畜禽養殖污染控制與資源化技術國家工程實驗室 湖南省畜禽健康養殖工程技術研究中心動物營養生理與代謝過程湖南省重點實驗室,長沙 410125;3.北京農學院動物科學技術學院奶牛營養學北京市重點實驗室,北京 102206)

反芻動物腸道中存在著豐富的微生物群落,其數量大且種類多樣。腸道微生物與宿主相互依存影響,構成了以細菌占據主導地位的腸道微生物系統[1]。反芻動物的腸道可分為小腸和大腸,不同腸段的化學性質、營養情況以及免疫活性存在差異,這些差異影響了不同腸段腸道微生物群落的組成。

1 腸道微生物的功能

雖然腸道微生物在不同腸段的組成存在差異,但總體功能可大致分為營養代謝、免疫和維持腸道穩態[2]。

1.1 營養與代謝功能

腸道微生物除了能夠合成多種氨基酸和蛋白質外,其具備的一些代謝特性是宿主本身不具備的。例如,反芻動物自身不能合成降解纖維素的酶系,主要依賴腸道中具有纖維素分解活性的微生物來分解食物中纖維素,其他營養物質如淀粉、脂肪和蛋白質等的分解利用需要腸道微生物的參與。分解后得到的小分子產物需要通過腸道及其他組織的轉運蛋白運輸到細胞內部發揮作用[3],而腸道中部分微生物能夠增加轉運蛋白的含量[4]。這種腸道微生物與宿主共生的關系極大提高了能量的利用率,對宿主的營養與代謝具有深遠的影響。

1.2 免疫功能

腸道微生物與宿主免疫系統間存在著密切的交流和協作機制。腸道微生物產生的短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)可作為能源物質被腸道上皮細胞和外周組織吸收,從而使腸屏障發揮正常的免疫功能[5]。Petersson等[6]發現,在沒有腸道微生物群的情況下,腸道上皮和黏膜免疫系統的發育減緩,黏液屏障的厚度變薄,但是將微生物產生的脂多糖和肽聚糖注射到結腸黏膜表面后,能刺激腸道黏液的產生,使腸道黏液層的厚度在40 min內恢復到正常厚度。腸道黏液層是貫穿胃腸道的重要生物學屏障,能夠阻止致病菌的定植[7],該研究表明腸道微生物在腸黏膜發揮免疫過程中至關重要。

新生反芻動物腸道中含有較高豐度的致病菌,如大腸桿菌(Escherichiacoli)、志賀菌屬(Shigellagenera)和沙門菌(Salmonella)等,容易引起動物腹瀉,是斷奶前犢牛死亡率高的主要原因[8]。腸道微生物通過兩種方式調節宿主腸道黏膜免疫,一種是增強宿主腸道生物學屏障,阻止病原菌的定植,另一種通過其特定組分刺激免疫細胞如Tregs細胞、Th17細胞的分化,從而增強宿主免疫功能[9]。

1.3 維持腸道穩態

健康的腸道環境是平衡而穩定的,腸道穩態的調節主要由腸道微生物進行。幼齡動物腸道微生物的定植受物種間競爭及環境因素的制約,這兩者共同決定了腸道微生物群的組成。環境因素包括飲食、宿主來源的產物及微生物來源的產物。如腸道中的雙歧桿菌(Bifidobacterium)和乳酸桿菌(Lactobacillus)會分解低聚糖產生酸類物質,使腸道內pH降低,抑制病原菌的生長與繁殖[10]。另外,飲食攝入的益生元可以在結腸中被益生菌發酵并產生SCFA[11],當SCFA濃度升高時可抑制沙門菌等有害菌的生長[12]。致病性大腸桿菌是引起新生犢牛腹瀉的主要原因,在犢牛出生后的第1周飼喂雙歧桿菌和乳酸桿菌可以有效降低新生犢牛的腹瀉發生率[13],一旦腸道微生物群發展成熟,微生物間競爭及環境因素就能阻止新的微生物定植,防止感染。但過多的致病菌能夠通過其毒力因子引發腸道炎癥反應來克服這種定植抵抗。因此腸道微生物在維持腸道穩態上有著重要意義,腸道微生物群失調意味著腸道穩態的破壞。

2 腸道微生物的定植規律

人們普遍認為新生兒腸道是無菌的[14],微生物群落在出生后開始迅速定植[15]。但最新的研究表明,在生產前新生兒腸道便存在著低多樣性、低生物量的具有代謝活性的微生物群落[16]。Smith[17]的研究表明,大腸桿菌和鏈球菌(Streptococcus)在出生后8 h內定植于犢牛腸道的所有區域,在出生8 h后,產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)開始在犢牛的盲腸中定植,并在產后18 h能在其他腸道區域檢測到[18]。產氣莢膜梭菌可以發酵葡萄糖、乳糖和蔗糖等物質產生SCFA,作為能源物質供宿主使用。產氣莢膜梭菌在生命初期就開始在腸道中定植,與反芻動物生命初期的飲食習慣相適應。在出生后第1天,能檢測到乳酸桿菌,并且在出生后1周齡內在腸道的所有區域占優勢。出生后第2天,盲腸和糞便中檢測到類桿菌(Bacteroides)[17],3～7日齡犢牛的腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌的比例較高,但大腸桿菌的含量較低。這些研究表明,腸道的初始定植菌主要是需氧和兼性厭氧細菌,通過消耗可用的氧氣來創建厭氧環境,以利于專性厭氧腸道微生物群,如雙歧桿菌和類桿菌的定植,這與腸道細菌在其他新生哺乳動物中的定植進化相似[18]。

出生24 h后,鏈球菌和腸桿菌(Enterobacteriaceae)在腸道中大量存在,在犢牛的后腸道中檢測到了很高豐度的大腸桿菌、志賀菌屬以及少量的致病菌,如沙門菌及腸球菌(Enterococcus)等[19]。說明在生命早期,新生犢牛易患上腸道疾病,可能導致死亡。這也是目前畜牧業所面臨的一個重要挑戰,加強對幼齡反芻動物腸道微生物調控的研究對提高新生兒存活率具有重要意義。

在出生后24 h還檢測到了相對豐度極低的乳酸桿菌的存在,表明嚴格厭氧菌此時已經開始在腸道中定植,擬桿菌在乳酸桿菌之后定植,犢牛出生2 d后在可在盲腸和糞便中檢測到[17,19]。新生反芻動物的飲食大多為初乳,富含糖、脂、蛋白質等物質,但是研究發現,在3～5日齡的犢牛腸道中就已經有了少量纖維素降解細菌的存在,而且它們的數量會在2～3周齡時變的豐富[20]。一般來說,反芻動物在出生3～4周齡時會逐漸開始攝入少量飼料,但是由于在生命早期瘤胃還沒有發育完全,不能通過瘤胃發酵攝入纖維素等物質,因此,來自后腸道的能量可能是犢牛在這個階段的主要能量來源,對生命最初幾周齡的幼齡反芻動物來說,后腸道微生物發酵更加重要[21]。

反芻動物出生7 d后,腸道微生物的物種多樣性再次增加,多樣性在門水平上已經和成年反芻動物相似,之前豐度最高的變形菌門(Proteobacteria)逐漸被厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門(Actinobacteria)所替代。在檢測的腸道區域中,普氏棲糞桿菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、擬桿菌屬占據了主導地位,其次是乳酸桿菌、丁酸球菌(Butyricicoccus)和雙歧桿菌等,但是隨著年齡的增加,普氏棲糞桿菌在總菌群中所占比例會逐漸降低,而乳桿菌和雙歧桿菌的相對豐度在逐漸升高[19]。產后5周齡,在犢牛消化道內觀察到黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)和其他纖維降解菌,但是未觀察到鏈球菌屬和乳球菌屬(Lactococcuslactis)[22]。這種現象表明,在出生后5周齡,生命最早期定植的好氧菌和兼性厭氧菌基本被其他厭氧菌群取代,并且腸道內已經定植了大量的纖維素降解細菌,腸道微生物發酵產生的SCFA為幼齡反芻動物的生長發育提供了能量來源。

到了6～8周齡時,犢牛腸道微生物組成和成年牛相似,厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門占主導地位。另外,腸道中早期定植的好氧和兼性厭氧菌群下降到了一個恒定的水平,并被雙歧桿菌和乳酸桿菌等嚴格厭氧菌取代[23]。對成年奶牛糞便中的微生物進行16S rDNA擴增子測序發現,在門水平上,厚壁菌門(637%)和變形菌門(183%)是主要優勢菌,其次是擬桿菌門(76%)和放線菌門(68%),其他菌門僅占很小一部分[24]。成年反芻動物不同于幼齡反芻動物,它們的飲食主要為植物,富含大量纖維素,所以和能量代謝相關的擬桿菌門在成年反芻動物腸道中則為絕對的優勢菌群,大約占總細菌的70%以上,且基本上為普雷沃氏菌(Prevotella)[25]。本文總結的新生反芻動物從出生到8周齡腸道微生物的定植規律如圖1所示。最初定植的是需氧及兼性厭氧菌,24 h后嚴格厭氧菌開始定植,且有致病菌定植。3～5日內有少量的纖維素降解菌定植,1周齡后腸道微生物豐富度增加,門水平上已與成年動物相似。5周齡后最初定植的需氧及兼性厭氧菌已經被嚴格厭氧菌取代,6～8周齡腸道微生物組成已與成年動物相似。

圖1 新生反芻動物從出生到8周齡腸道微生物的定植規律Fig.1 Colonization pattern of gut microorganisms in newborn ruminants from birth to 8 weeks old

3 早期腸道微生物群定植的營養調控手段

3.1 日糧調控

新生反芻動物需要飼喂初乳,其飼喂策略會顯著影響生命初期腸道微生物定植。Fischer等[26]研究表明,延遲初乳飼喂會延緩腸道微生物的定植過程,從而導致動物斷奶前潛在的感染風險。在生產中,為了減少病原菌污染,加熱初乳也是一種常見策略,有研究表明,在出生后的12 h內喂食經過熱處理的初乳可以增加雙歧桿菌,減少大腸桿菌在犢牛小腸的定植[27]。同時,有研究嘗試向初乳中添加日糧添加劑以改善反芻動物生命初期的健康,例如Yang等[28]向初乳中添加甘露寡糖,發現向初乳中添加甘露寡糖能促進乳酸菌的定植。

斷奶期間,反芻動物腸道微生物發生劇烈變化,斷奶前的日糧組成是變化的主要因素。斷奶過程中固體飼料的添加是調控腸道微生物定植的一個關鍵窗口,隨著固體飼料逐漸替代母乳,降解纖維素的腸道細菌如普雷沃氏菌和瘤胃球菌(Ruminococcus)所占比例逐漸增加,最終成為優勢菌[29]。為了使幼齡反芻動物順利斷奶,生產中常用開食料進行母乳與飼料間的過渡,開食料中的淀粉也是影響腸道微生物定植的因素。戴求仲等[30]研究表明,提高飼糧直/支鏈淀粉比值能增加后腸道中腸球菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌數量,減少大腸桿菌數量。

3.2 益生菌和益生元等

益生菌是有活性的微生物,可以通過改善宿主腸道微生物平衡而對宿主產生有益影響,其作為飼料添加劑而被廣泛應用于畜牧業中[3]。常見的益生菌有乳酸桿菌、酵母菌(Saccharomyces)、芽孢桿菌(Bacillus)、雙歧桿菌等。雙歧桿菌和乳酸桿菌可以定植和黏附在新生兒的腸道黏膜上,與致病細菌競爭,從而減少腹瀉的發生率,增加幼齡反芻動物的體重[31]。Zhao等[32]給斷奶前的犢牛飼喂益生菌,將從成年牛的糞便和組織中分離出來的益生菌添加到飼糧中飼喂給斷奶前的犢牛,雖然沒有改變糞便細菌的豐富度和多樣性,但是益生菌處理組的犢牛糞便中的發酵菌和有益菌的數量明顯增多,一些條件致病菌如蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)的生長受到明顯抑制,有效減少腸道中病原性大腸桿菌O157:H7的數量。但He等[33]研究發現,在新生犢牛的代乳粉中補充酵母菌并沒有影響犢牛的采食量、平均日增重和糞便評分等,對引起腹瀉的大腸桿菌以及腸道有益菌的影響都微乎其微,在犢牛沒有疾病的情況下,喂養酵母益生菌對犢牛的生長性能和健康沒有明顯效果。腸道微生物會隨著時間的推移產生變化,因此對于幼齡反芻動物日糧添加益生菌的研究中也應該注意年齡因素對結果的影響。

益生元指一些不被宿主消化吸收,能夠選擇性地促進體內有益菌的代謝和增殖,從而改善宿主健康的有機物質。常見的益生元有低聚糖類、微藻類、多糖類、蛋白質水解物及天然植物提取物等。有研究表明,添加低聚果糖能選擇性地促進雙歧桿菌、羅伊氏乳桿菌和韋榮氏球菌在瘤胃及后腸道定植,顯著抑制了沙門菌和大腸桿菌在腸道上皮的黏附[34]。Sharma等[35]的研究發現,以每頭犢牛4 g·d-1的甘露寡糖作為益生元添加到5～7日齡的犢牛的飼糧中,可以在犢牛糞便中檢測到更多的乳酸桿菌和雙歧桿菌數量,減少糞便中大腸桿菌的數量,還可以改善犢牛的采食量,提高飼料轉化率。腸道中許多革蘭陰性細菌依靠菌毛附著于腸上皮,甘露寡糖會與這些細菌的菌毛特異性結合,從而使它們不能黏附于腸上皮,而且甘露寡糖在小腸中不能被酶消化,所以與甘露寡糖結合的病原性細菌很可能不與上皮細胞結合就離開了腸道[36]。此外,甘露寡糖還會被腸道中的雙歧桿菌和乳酸菌分解為短鏈脂肪酸,降低腸道pH,從而抑制致病細菌生長[37]。同樣,Castro等[38]也發現,給新生犢牛的代乳粉中添加低聚半乳糖可以增加結腸中乳酸桿菌和雙歧桿菌相對豐度且犢牛具有更發達的腸道上皮結構,還減少了糞桿菌屬、梭菌屬和螺旋菌屬等菌屬的相對豐度,不過這種結果在犢牛出生的前2周比較明顯,到了第4周時對照組和處理組沒有顯著差異,這可能說明在整個腸道微生物定植過程的早期更容易受到影響。

將益生菌與益生元結合使用的生物制劑稱為合生元,能同時發揮益生菌和益生元的作用。接種新鮮的瘤胃液對幼齡反芻動物有積極的影響。出生后接種新鮮的瘤胃液可以促進瘤胃發育,增加斷奶前羔羊的平均日增重[39],但接種瘤胃液引起的腸道微生物變化仍不清楚。據報道,接種瘤胃液不僅促進了羔羊結腸中微生物的定植,而且在斷奶時更容易從母乳過渡到固體飼料,這有利于反芻動物在斷奶后階段的生長,將降低反芻動物的負擔[40]。所以瘤胃液可視為一種潛在的益生元,在對反芻動物腸道微生物的營養調控中具有一定價值。

后生元是益生菌經加工處理后的益生菌代謝物成分統稱,包括菌體與代謝產物。有研究表明,在斷奶后羔羊的日糧中添加 0.9% 的植物乳桿菌 RG14 后生元可改善生長性能、營養攝入和營養消化率[41]。說明后生元是一種潛在的飼料添加劑,可用于促進斷奶后反芻動物的瘤胃發酵和生長。

4 小 結

近年來,對于反芻動物胃腸道微生物的研究已經越來越多,但是由于腸道內微生物的種類較多且數量龐大,所以到目前為止,對反芻動物胃腸道微生物的認識仍有不足。與成年反芻動物穩定的腸道微生物群落不同,幼齡反芻動物的腸道微生物群落需要經歷一些明顯的特定時期變化,例如從非反芻期到反芻期,從斷奶前到斷奶后,從好氧細菌的定植到厭氧細菌取代好氧細菌。腸道微生物的改變窗口可能會成為針對腸道微生物定植的早期干預提供機會,如添加益生菌和益生元,以增強免疫系統,改善健康狀況,促進幼齡反芻動物的發育。

目前,對腸道微生物定植的最佳干預時間的研究還很少。此外,改變的腸道微生物如何影響幼齡反芻動物的腸道微生物發展,以及對幼齡反芻動物健康和發育的長期影響值得進一步研究。因此,有必要通過基于基因組學或代謝組學的方法進一步識別關鍵元素,并探索特定腸道微生物的功能作用,更全面地了解腸道微生物群落的發展規律,以便有針對性地進行調控。