動物腸類器官培養技術

陳奡蕾,黃德如,安婭菲,李守軍

(華南農業大學獸醫學院,廣東省獸醫臨床重大疾病綜合防控重點實驗室,廣州 510642)

腸類器官(intestinal organoid)是由離體的干性細胞如成體干細胞(adult stem cells, ASCs)、胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)及其分化形成的多能干細胞(pluripotent stem cells, PSCs)、誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)或腸隱窩(intestinal crypts)組織,在基質膠(matrigel)和特殊生長因子的培養條件下,自發組織增殖和分化且表現明顯腸組織特性的空心細胞團塊[1]。它們高度折疊,呈腸纖毛和隱窩樣(圖1)。

圖1 腸類器官模型Fig.1 Intestinal organoid model

2007年Clevers研究組[2]利用小鼠體內試驗證明了Lgr5+上皮細胞屬于腸道上皮干細胞。2009年該研究組成員Sato等[3]在Nature上展示了團隊成功利用單一的Lgr5+細胞培養出小腸絨毛狀上皮結構。這些結構不但具有完整的腸道上皮結構特性,且含腸道內各種分化的功能細胞,包括腸上皮細胞、腸內分泌細胞、杯狀細胞、潘氏細胞和Lgr5+干細胞[3]。隨后的多項研究也證明,離體的腸道干細胞和隱窩可以在3D培養條件下形成腸道類器官,也稱為“迷你腸”(mini-gut),它們能呈現源組織的典型功能[4-10]。

目前報道培養人和小鼠的腸類器官的文獻比較豐富,但伴侶動物和家畜動物的相關報道較少。然而伴侶動物和家畜動物仍存在很多傳染性和非傳染性的腸道疾病,需要新型的研究模型。為此,本文將綜述動物腸類器官的培養進展,旨在為構建不同動物的腸類器官提供參考。

1 腸類器官的培養方法

目前腸類器官的培養方法主要有兩種:Sato等[3]在2009年發表的“浸泡培養法”(submerged method)和Wang等[11]在2015年發表的“氣液雙向培養法”(air-liquid method)。前者是將分離的樣品與基質膠混合后,滴加到培養皿正中間使之呈圓滑的“水珠狀”,待基質膠凝固后加入含有特殊生長因子的類器官生長培養基并浸沒樣品基質膠混合物以實現3D培養;后者是利用Transwell小室,在一個培養板中間放置一個底下可以允許生長培養基通過的濾膜皿,在濾膜皿底部先鋪一層基質膠,再在上層加入基質膠和樣品混合物,最后在培養板中加入完全類器官培養基,構建“大皿套小皿”的方式培養。這兩種方法都可使腸ASCs在體外培養條件下自發分化成各種成熟細胞,并重現與源組織相同的結構和功能。前者單次培育的成熟類器官較少,而后者單次培育的類器官數量更多。除了在類器官培育數量上有區別外,更重要的是,后者的培養方式改變了小腸上皮細胞的極性,使單層上皮細胞的小腸絨毛面朝向培養液,便于進行小腸功能探索與評估或宿主與病毒關系的試驗[6,12-13]。

2 不同動物的腸類器官培養

2.1 鼠腸類器官

2009年,Clevers團隊[3]首次利用ENR培養條件,即利用富含表皮生長因子(EGF)、頭蛋白(Noggin)和Wnt激活劑R-spondin-3的培養基成功構建鼠小腸類器官。2018年,Wang等[14]從成年小鼠的黏膜下組織和固有層中分離出了腸神經膠質細胞(EGCs),Baghdadi和Kim[15]在Wang等的研究基礎上將ENR培養基和從EGCs培養中分離的條件培養基相結合,發現該培養系統會顯著促進鼠小腸新隱窩的形成,增強干細胞活性,該培養系統可以用于研究鼠小腸類器官和EGCs通過分泌因子產生的相互作用。

盡管小鼠小腸類器官的培養條件已經相對成熟,構建長期穩定的小鼠結腸類器官仍存在培養條件上的挑戰。為此,Sato等[16]開始改良ENR培養條件。研究發現鼠小腸類器官可持續表達Wnt信號,而結腸隱窩在培養開始不久后便失去Wnt信號,他們推測結腸類器官缺乏Wnt配體,因此不能長期維持結腸干細胞的穩定[16];該課題組在ENR條件培養基中添加Wnt-3A,結果發現結腸隱窩的培養效率增加了10倍,最終成功探索出小鼠結腸類器官的培養條件[16];此外,他們還發現新鮮分離的結腸隱窩上部完全成熟細胞會干擾腸類器官的生長[16]。將結腸隱窩輕度消化成小簇細胞再進行培養,會極大提高結腸類器官形成的效率。

Yilmaz等[17]發現潘氏細胞能夠通過檢測腸干細胞代謝狀態來調節自身活動。Sato等[18]研究發現無論是在小鼠的體內或體外,Lgr5+干細胞的生長維持都與潘氏細胞有密切的聯系。潘氏細胞能夠表達EGF、Wnt3、TGF-α等多種培養干細胞所必須的信號分子,將分選出的Lgr5+干細胞與潘氏細胞共培養可顯著提高腸類器官培養的成功率。

2.2 豬腸類器官

2013年,Gonzalez-Cordero等[19]從野生型約克夏仔豬中獲取腸道組織,采用免疫熒光法及電鏡首次鑒定了豬腸細胞譜系,包括腸道干/祖細胞系,吸收細胞系及分泌細胞系。同時,構建了豬腸類器官長期培養體系,成功培養和傳代豬腸類器官,為利用豬作為轉化醫學的動物模型奠定基礎[19]。為了更好地研究腸道上皮細胞的更新情況,Thorne團隊[20]成功開發了“單層類器官”的培養方法,并證實“單層類器官”具有增殖和分化區,自我更新,組織極性及分化主要腸道細胞類型的特性。van der Hee等[21]利用完全酶解法將類器官分離為多細胞系懸液,取代了用機械破碎法獲得腸道隱窩或腸道干細胞。這樣不僅能提高單層類器官培養效率還能減少機械分離對細胞的損傷。利用上述培養方法,Li等[12]成功將3D豬腸類器官制成2D單層類器官,用于研究PEDV感染宿主腸道的致病機制。2020年,Li等[22]通過去除豬腸類器官培養系統中的基質膠并利用超低吸附培養板,使原本腸絨毛內置的豬腸類器官在懸浮培養時發生極性反轉,培養出了絨毛外置的豬腸類器官,為研究豬腸道病原體與宿主的相互作用提供了適宜的模型。

2.3 犬腸類器官

近年來,人們建立并不斷探索犬腸類器官的改良培養方案以期提高培養效率[16]。Powell和Behnke[23]利用可分泌Wnt3a、R-spondin-1和Noggin(WRN)的小鼠纖維原細胞系,構建了50% L-WRN(條件培養基),并證明了WRN是犬類器官生長所需要的因子。在該培養方案下,犬腸類器官能穩定傳代40代以上。Kramer等[24]采取Fujii團隊[25]的經驗策略,通過移除煙酰胺、p38-MAPK抑制劑、N2和EGF及增添IGF1及FGF2,調制出改良培養系統。該培養系統在促進細胞分化的同時還能保持腸道干細胞的增殖。

此外,由于每個腸段都有特定的解剖結構和生理功能,研究者開始探索更精準的腸段類器官。Chandra和同事們[26]在試驗中分離健康犬和炎性腸炎病(IBD)及腸道腫瘤病犬的空腸、十二指腸、回腸組織和結腸,并在改良的人腸類器官培養基(WRN、ROCK抑制劑和GSK3β)中培養出了對應的類器官。研究發現IBD犬源的類器官和健康犬源的類器官在形態學上無明顯差異,且都能穩定傳代20代以上。與傳統截取腸段組織不同,該研究利用內窺鏡對不同腸段進行活檢采樣,所得樣本均能順利形成對應的類器官,擴大了犬腸類器官的供體來源。就犬隱窩分離方法而言,Powell和Chandra團隊使用的方法略有差異:前者使用膠原酶消化達到隱窩分離的效果,而后者使用EDTA螯合法[23,26]。從分離效果上來看,使用EDTA進行隱窩分離顯著提高了隱窩上皮的純度,并減少了其他細胞類型的污染[26]。哺乳類動物腸道干細胞的分離具有種屬差異,消化試劑濃度和孵育時間與對應種屬腸道絨毛的長度、數量和大小相關[3,26-27]。

與人和小鼠的腸道類器官相似,犬Lgr5+腸道干細胞主要集中在腸道類器官及空腸組織的隱窩區域[26]。犬腸道類器官與犬全層空腸組織的免疫組化對比結果顯示,犬腸道類器官為上皮細胞群組成,不含潘氏細胞、間充質細胞及免疫細胞且犬腸道干細胞能分化成杯狀細胞、小腸內分泌細胞及空腸組織[26]。這些細胞的類型及空間定位與源組織一致,證明犬腸道類器官能較好地還原源組織的結構和功能[28]。

2.4 貓腸類器官

目前,僅有一例報道描述了貓腸類器官的培養,但培養的結果并不理想。Powell和Behnke[23]利用L-WRN條件培養基養出貓腸類器官,但貓腸類器官在P10代次前后停止擴增,并在P13～P18代次前后開始出現生長停滯。與此同時,他們觀察到了一種間充質樣細胞類型在貓腸類器官生長出現停滯前數量減少且貓腸類器官表達的波形蛋白(VIM)比對照組多,提示這類細胞可能是貓腸類器官生長的必需成分。Powell和Behnke[23]根據間充質/基質成分與腸隱窩共培養的要求,嘗試了添加多種用于誘導人和小鼠的腸類器官生長或由隱窩間充質/基質細胞分泌的因子,但培養結果依然沒有太大的改善,說明貓腸類器官的培養條件仍需要更多探索。

2.5 禽腸類器官

目前,關于禽腸道類器官的報道較少。Pierzchalska等[29]首次利用雞胚的上皮組織成功建立禽腸道類器官,并發現前列腺素E2(PGE2)可替代WRN培養體系中的R-spondin1和Noggin而不影響類器官球的生長。與哺乳類動物的腸類器官不同,禽腸類器官較少出現出芽樣的隱窩[29-30]。

近期,Zhao等[30]采用L-WRN條件培養基,利用雞胚的小腸組織和肉雞或蛋雞的盲腸成功構建了可傳代、可凍存的禽腸類器官,并用RT-PCR和Western blot證實了禽小腸類器官不僅有干細胞還有成熟的分化細胞,包括上皮細胞、腸內分泌細胞、潘氏細胞和杯狀細胞。而外源添加物的濃度和種類可改變禽腸類器官的數量、表面積和干細胞標記物的表達量[30-32]。為了提高構建禽腸類器官的可重復性,除了培養體系方面的改良,Panek等[33]還應用懸滴法培養以雞胚為材料的禽腸類器官,不但提升了培養效率而且還降低實驗成本。

2.6 反芻動物及草食動物的腸類器官

由于反芻動物(牛、羊)及草食動物(馬、兔)的飲食特性,其消化道進化為與之適應的特殊解剖結構。例如牛和羊具有四個胃,馬和兔子的盲腸和結腸發達。盡管反芻動物及草食動物的腸道與人和小鼠的腸道不同,但利用改良的人或小鼠腸道類器官培養系統如L-WRN、BEM或商品化培養基IntestiCultTM仍能培養出相應的反芻動物及草食動物的3D腸類器官,而Mussard等發現利用化學抑制劑的2Ki培養基更適用于增殖兔腸類器官,而低濃度(5%)的L-WRN更適合誘導分化兔腸類器官[23,34-38]。

3 動物腸類器官的優點與缺點

3.1 優點

動物腸類器官是功能介于2D細胞系模型和動物模型之間的體外模型。它既具有某些2D細胞系模型或活體動物模型的優勢,又能彌補他們在某些研究上的不足。

Caco-2細胞單層模型是藥物研究常用的2D細胞系模型,但該模型無法模擬腸道真實結構和腸道細胞間的互作[39-40]。而與廣泛使用的癌細胞系和永生細胞系構建的2D單層細胞系模型不同,3D腸類器官模型能更好地再現細胞的結構和功能,以及原始組織的遺傳和表觀遺傳特征,是更加真實可靠的模型[4,41-44]。

與活體動物模型相比,類器官不僅能模擬疾病在體內發生和發展的情況,還能更容易地進行基因操作,使之更好地研究特定細胞之間的聯系和形態結構[45-46]。除此以外,類器官培養所需的原代細胞來源廣泛,可從外科切除的組織、活檢樣品和屠宰組織中獲得,極高效地利用組織,減少使用活體動物,符合實驗3R原則[26,47-49]。由于類器官能很好地反映樣本個體特征,因此也可服務于病患個體的精準醫療[35,50]。

3.2 缺點

和所有正在發展的技術一樣,類器官培養技術也有其短板。腸類器官的3D培養體系所用的基質膠是來自小鼠的肉瘤,而這些動物來源的基質膠成分復雜,組分無法標準化,具有傳播動物源病原的風險。此外,這種腫瘤源基質不能有效地模擬天然腸道的微環境。上述缺點可能會限制腸類器官廣泛地應用在機制研究和臨床試驗中[50]。Gjorevski等[51]首次提出人造水凝膠替代基質膠,但由于類器官生長的不同階段需要不同硬度的細胞外基質,因此人造水凝膠的培養效果不如動物源基質膠。隨后人們開始嘗試不同的非腫瘤源生物基質膠,并發現其培養性質與基質膠相當,甚至更優,如蛋白、腸道細胞外間質水凝膠和去細胞化的豬消化道[52-54]。這些嘗試為以后生產標準化基質膠提供了理論基礎[54]。

當前類器官主要指上皮源性的類器官。而這些類器官幾乎只含干細胞/足細胞及其分化的特異性上皮細胞,不含有成纖維細胞、免疫細胞、血管細胞等間基質細胞[26]。這限制了類器官技術在模擬炎癥反應、免疫細胞調控機制和模擬體內微環境等方面的研究[50]。當試驗需要更復雜,更接近生理的研究模型時,單個類器官或簡單的共培養系統則不能滿足此要求。為此,科學家開發了類器官芯片(organoid-on-chips),以更好地模擬生理微環境[55-56]。

腸上皮細胞具分泌物質、消化大分子、吸收營養、抵抗病原體和自我更新的功能,其特殊細胞亞結構絨毛和微絨毛面向腸腔,具有極性[57]。研究腸類器官上皮細胞與其他物質或病原體之間的關系需要通過微注射方法[58]。這種高要求的操作技術限制了相關研究的發展。因此,探索培養絨毛外翻的腸類器官具有迫切性。2D類器官很好地解決了上述的難題。首先在培養皿中鋪上基質膠薄層,待基質膠凝固后加入含基質膠的腸隱窩或腸干細胞與混合物,然后加入ENR培養液,即可構建出細胞基底面朝向基質膠,細胞頂端面朝向培養液的單層腸類器官[12,20-21,59]。此外,Nash等[60]利用懸浮法培養建立了腸絨毛外翻的禽腸類器官。

4 小結與展望

Clevers實驗室開創性地發現Lgr5+干細胞標記物,自此引起了探索人和動物的腸類器官構建、鑒定與改良的熱潮。得益于腸類器官的立體結構及細胞異質性等特性,人們對這種新型的、更好模擬體內腸道生理結構和功能的體外模型產生巨大需求。為此,研究者紛紛開始探索和改良的類器官培養體系,以期望提高腸類器官的培養效率并根據研究需要開發出不同腸段的腸類器官。目前的培養體系和培養技術能快速成熟地培養出人、小鼠和犬不同腸段的腸類器官。利用改良的人和鼠腸類器官培養體系,也能順利培養出反芻動物和草食動物的腸類器官;然而相似的培養體系在貓腸道類器官中的培養效率卻較低。相反,由于沒有太多研究和文獻報道,禽腸類器官的培養體系沒有其他物種的腸類器官培養體系豐富,仍有待繼續優化。

無論是3D腸類器官抑或是2D單層腸類器官,這些研究平臺都能高度還原源組織的表型和功能。因此在不久的將來,當類器官培養體系能更標準化時,結合如CRISPR/Cas9基因編輯、細胞共培養、大數據和人工智能等技術,動物腸類器官能進一步服務于疾病診斷、藥物篩選、器官修復或移植等研究領域,推動精準醫學的發展。