mRNA疫苗及其在動物傳染病中的研究展望

陳 鑫,秦 彤

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193)

mRNA疫苗是指通過體外轉錄(invitrotranscription,IVT)技術合成病原的mRNA,經遞送系統遞送至靶細胞,并在細胞核糖體內被翻譯為目的抗原,進而啟動機體免疫應答反應的新型核酸疫苗。mRNA疫苗是繼第一代減毒/滅活疫苗和第二代亞單位疫苗基礎上發展起來的第三代疫苗,具有針對病原體變異反應速度快、生產工藝簡單、易規?；瘮U大等特點。

mRNA疫苗的研究最早可追溯到1990年,Wolff等[1]發現在被注射含有特定基因的質粒DNA或mRNA的小鼠肌肉組織局部會產生該基因編碼的蛋白產物。后續的研究發現,這種被核酸免疫的動物體內會產生針對該核酸編碼抗原的特異性免疫反應[2]。但由于mRNA不穩定、在組織內易被降解、細胞吸收率較低等缺陷,其研發進展緩慢。21世紀后,隨著mRNA合成、修飾和遞送技術的發展,上述缺陷逐漸得到克服,mRNA疫苗的研發也重新得到重視。2005年,Weissman和Karik通過試驗證明,使用修飾的核苷(假尿苷)代替尿苷可以降低體外轉錄mRNA的免疫原性[3],提高mRNA在機體內的穩定性,并使mRNA具有更高的翻譯水平[4],這為后期研發mRNA疫苗奠定了基礎。隨著全球新冠肺炎疫情的暴發,mRNA疫苗再次被推上歷史舞臺。2020年底,BioNTech/輝瑞和Moderna的兩款mRNA疫苗BNT162b2、mRNA-1273相繼獲批上市,在全球廣泛應用,并取得了良好的免疫保護效果[2]。本文將從mRNA疫苗的類型和結構、遞送系統、作用機制以及臨床應用等方面對mRNA疫苗進行全面綜述,并對這個新興疫苗平臺在獸醫領域的發展方向進行了展望。

1 mRNA疫苗的類型和結構

mRNA疫苗可以分為兩種類型:非復制mRNA疫苗和自擴增RNA疫苗。雖然兩者具有共同的結構,但自擴增RNA疫苗在編碼區域包含用于mRNA復制的額外序列,從而實現細胞內mRNA擴增,可以在同等mRNA用量的情況下表達更多抗原[5]。mRNA疫苗由mRNA和遞送系統兩個部分組成,其中,mRNA的功能是為抗原合成提供遺傳信息,遞送系統是將mRNA轉入胞內,使mRNA免受核酸酶及機體免疫系統的干擾。一個合格的mRNA疫苗在mRNA和遞送系統設計上均格外考究。

1.1 非復制mRNA疫苗結構組成

信使RNA(message RNA),又稱為mRNA,是以線性DNA為模板通過轉錄方式獲得的核糖核苷酸,作為模板參與蛋白質的合成過程。用于翻譯的mRNA由5′帽子結構(5′ cap)、5′非翻譯區(5′untranslated region,5′UTR)、翻譯區(coding sequence, CDS)、3′非翻譯區(3′untranslated region,3′UTR)以及poly(A)尾組成。體外轉錄的RNA需要通過加帽、加尾,以模擬天然mRNA結構和功能。有些研究人員會對序列進行密碼子優化,同時引入Kozak序列,以增強mRNA翻譯水平。

圖1 mRNA疫苗結構[6]Fig.1 The structure of mRNA vaccine[6]

1.1.1 5′帽子結構 在真核生物中,成熟mRNA分子的5′端,有一種特殊結構:m7G5′ppp5′Np,通常被稱為甲基鳥苷帽子或5′帽子,用于調節前體mRNA的剪接,提升mRNA核輸出,對于mRNA的穩定性和蛋白質翻譯具有重要作用[7]。此外,先天免疫系統也會通過5′帽子識別自身與非自身mRNA,因此,5′帽子可以幫助IVT mRNA逃脫免疫系統識別,使其免受外切核酸酶切割[8]。

5′帽子有3種類型,分別是cap0、cap1和cap2。鳥苷G以5′-5′焦磷酸鍵與初級轉錄本的5′端核苷酸相連,當其第7位碳原子被甲基化后,形成m7G5′ppp5′Np,即cap0。當轉錄本第一個核苷酸的2′-O位也發生甲基化時,形成m7GPPPN1m,此時形成的為cap1,這是多數5′帽子的存在形式。當轉錄本第一和第二個核苷酸的2′-O位均發生甲基化時,會形成m7GPPPN1mN2m結構,即cap2。哺乳動物細胞內5′帽子的主要形式是cap1和cap2,兩者在cap0的基礎上進一步提高了體外轉錄mRNA的翻譯效率。

5′帽子通過m7G的疏水性陽離子的相互作用和翻譯起始期間三磷酸橋的負電荷結合真核生物翻譯起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E),eIF4E能夠與支架蛋白(eIF4G)相互作用形成復合物,eIF4G還能夠與poly(A)結合蛋白(poly-adenosine binding protein,PABP)以及eIF3相互作用使mRNA環化,進而啟動mRNA翻譯[9-11]。

目前,加帽主要是使用牛痘病毒加帽酶或通過化學共轉錄法進行[12]。酶法加帽的過程相對復雜,但產量較高,加帽率近100%,多用于大規模生產和實驗室研究;與酶法加帽相比,化學共轉錄方法最大程度上減少了反應步驟和酶的用量,過程簡單,但產量和加帽率較低,不能滿足大規模生產使用。在使用標準帽類似物進行化學共轉錄加帽時,會同時產生m7GpppGN和Gpppm7GN兩種結構。為此,設計了抗反向帽類似物(ARCA,3′-O-Me-m7G5′ppp5′G),其內包含一個 5′-5′三磷酸橋,可以有效解決方向錯誤的問題[13]。下一代共轉錄加帽技術CleanCap在ARCA的基礎上進一步提升了產量,加帽率升至94%[14]。但目前沒有研究證明何種加帽方式更具優勢。

圖2 5′帽子結構[15]Fig.2 The structure of 5′ cap[15]

1.1.2 非翻譯區 在天然mRNA分子編碼區的5′端和3′端,有兩個不被翻譯成多肽的區域,稱為非翻譯區(untranslated regions, UTRs)。UTRs上存在多個調控元件來控制mRNA的穩定性和翻譯效率,除此之外,UTRs還與mRNA二級結構以及核糖體對mRNA的識別有關[16]。許多促進mRNA翻譯的UTRs序列已經被從天然存在的序列中鑒定出來,如源自α-珠蛋白和β-珠蛋白的UTRs序列,目前已被廣泛用于構建IVT mRNA[17]。

5′UTR主要參與啟動翻譯過程,作為蛋白質翻譯的預起始復合物的起始結合位點,在控制蛋白質翻譯效率方面起著重要作用[10]。eIF4A與5′UTR的結合可以協助在蛋白質翻譯發生之前解開mRNA的二級結構[10],這對于eIF1A與mRNA 的結合十分重要[18]。目前在進行mRNA疫苗設計時,通常會在5′UTR下游引入Kozak(GCCACC)序列,提高核糖體識別翻譯起始位點的準確性,提升蛋白的表達效率。

3′UTR中包含mRNA降解信號,優化3′UTR序列,可以有效提高mRNA的穩定性,延長半衰期,進而提升蛋白的表達效率。如mRNA的3′UTR中富含A、U的序列參與了mRNA降解過程中poly(A)尾的去除,因此,改變3′UTR 中的A、U含量可以延長mRNA半衰期,提高穩定性[19]。

1.1.3 編碼區 編碼區序列(coding sequence, CDS)是用以編碼目的蛋白的基因序列,在進行mRNA疫苗設計時,CDS序列的設計對mRNA的翻譯效率和免疫原性具有重要影響[20]。CDS的設計需要考慮以下幾個因素:首先,不同宿主細胞的密碼子偏好性不同,針對mRNA疫苗的目標物種進行密碼子優化,使用常見密碼子替代稀有密碼子,可以顯著增強mRNA在細胞內的翻譯水平[21],但有些蛋白質的部分密碼子需要低翻譯效率才能保證蛋白的正確折疊,因此需要對靶抗原進行抗原表位預測和蛋白結構預測;其次,研究表明,適當提高序列中鳥嘌呤和胞嘧啶(G和C)含量可以增加mRNA的穩定性和翻譯效率,提高體外穩態mRNA含量和體內蛋白質表達水平[21-22];再次,在設計mRNA序列時,增加其二級結構的含量,可以有效減少mRNA的降解。最近,一種專門為最大堿基堆疊區域設計最佳mRNA序列的算法也被證明可以顯著提高mRNA穩定性[23]。

1.1.4 poly(A)尾 在真核生物mRNA的3′端,有一個聚腺苷酸化區域,被稱為poly(A)尾,其作用是與PABP[poly(A)-binding protein]結合,后者隨后募集eIF4G并增加對mRNA 5′帽子的親和力以形成環狀mRNA[24]。除少數個例(例如組蛋白)外,所有編碼mRNA的細胞蛋白都具有poly(A)尾,其對于增強 mRNA穩定性、提高翻譯效率至關重要。在哺乳動物細胞中,天然mRNA分子的poly(A)尾部長度約為250 nt[25]。通常,翻譯效率與poly(A) 尾中的腺苷數量成正比[26]。對于mRNA藥物而言,需要至少含有20 nt poly(A)才能有效翻譯[27]。曾有研究表明,120 nt的poly(A)尾能夠提高mRNA的穩定性和翻譯效率[28],但進行mRNA疫苗設計時添加poly(A)尾的具體長度目前尚無定論。

1.1.5 修飾核苷酸 研究表明,IVT RNA通過刺激Toll樣受體(TLR),特別是TLR3、TLR7和TLR8來激活先天免疫系統的免疫細胞。然而,將修飾核苷如假尿苷(Ψ)、5-甲基胞苷(m5C)、N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基尿嘧啶(m5U)或2-硫代胺(S2U)用于體外轉錄時,大多數TLR不再被激活[4,29]。Karik等[4]率先開發了用于產生IVT mRNA的修飾核苷酸,并聲稱將IVT mRNA中的尿苷替換為假尿苷不僅會降低針對mRNA的先天免疫反應,也能增強蛋白質翻譯水平。然而,修飾核苷對TLR非依賴性免疫反應的影響尚不清楚。

1.2 自擴增RNA疫苗

自擴增RNA(self-assembled RNA, saRNA)疫苗除包含上述結構外,還引入了來自RNA病毒的促進RNA復制的其他結構:非結構蛋白基因nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。nsP1～4分別編碼負責mRNA加帽的蛋白、NTP酶/解旋酶/蛋白酶、macrodomain蛋白和RNA聚合酶[30]。自擴增RNA進入宿主細胞質后,會通過核糖體中的內源性翻譯機制,表達nsP1～4前體多聚蛋白,這些非結構蛋白重新組裝成RNA依賴性RNA聚合酶轉錄酶復合物,以IVT RNA為底物分子供翻譯為抗原的mRNA[31]。因此,一個saRNA可以產生多個mRNA,進而提高抗原表達量。自擴增RNA疫苗單劑所需RNA的量更低,可以進一步降低疫苗成本[32]。但自擴增RNA疫苗也存在著一定局限性,比如其龐大而復雜的saRNA序列,通常nsP1～4序列的長度約為7 000 nt,這使saRNA疫苗的全長超過9 000 nt[5],過大的體積會限制RNA進入細胞的效率。目前,saRNA疫苗已經表現出了良好的應用前景,Arcturus、CureVac公司設計的SARS-CoV-2 saRNA疫苗已進入臨床前研究階段,Imperial College London公司設計的SARS-CoV-2 saRNA疫苗率先進入I期臨床試驗。

2 遞送系統

IVT mRNA相對分子質量為104～106u,表面帶有負電荷,因此難以通過胞吞等方式進入細胞[33]。外源性mRNA進入機體時,易被機體先天免疫系統捕獲,也易被核酸酶降解[34]。合適的遞送系統對mRNA進入細胞、抗原表達水平、免疫持續時間以及保護性免疫反應效力具有重要作用。目前,常用的遞送系統包括脂質納米顆粒(LNP)、脂質體、脂質復合物、高分子材料、膠束、多肽、魚精蛋白、電穿孔等[33,35-37],其中LNP因其表現出的更高的轉染效率已成為當下最常用的遞送系統之一[38-40]。

LNP具有磷脂單分子層結構,帶正電荷的LNP與帶負電荷的mRNA通過靜電作用,將mRNA包裹在LNP內[33,41]。LNP含有多種成分,以Moderna公司Spikevax疫苗為例,該疫苗中LNP的組成成分包括陽離子脂質(SM-102)、輔助脂質磷脂二甲酰磷脂膽堿(DSPC)、膽固醇(cholesterol)和聚乙二醇化脂質(PEG2000-DMG)[42],這四種成分按50∶38.5∶1.5∶10的比例混合,形成LNP復合物。這四種成分的功能各不相同,陽離子脂質可以根據不同內環境的pH,通過電荷相互作用調節LNP的自組裝和mRNA的釋放[43];輔助脂質通常是飽和磷脂,可以提高整體相變溫度和穩定性[44];膽固醇具有很強的膜融合能力,可以促進細胞對mRNA的攝入[45];聚乙二醇化磷脂位于LNP表面,可以提高LNP親水性,避免其被免疫系統快速清除,防止顆粒聚集,調節顆粒大小,并提高穩定性[46]。

目前脂質納米顆粒的制備方法主要有薄膜水化法、擠出法、均質法和反相蒸發等傳統方法[47]。與這些方法相比,采用微流控混合技術來制備LNP,相對簡便快速,條件溫和,粒徑均勻,轉染效率高,容易實現生產放大[48]。

在過去幾年里,大量研究表明,使用LNP技術可以極大地促進mRNA的遞送并增強抗原表達[49]。這些研究闡述了LNP對mRNA疫苗誘導有效的免疫反應起到重要作用,但其機制尚不明晰[50-51],未來需要作出更多努力,來闡明LNP遞送mRNA的作用機制[52]。

3 mRNA疫苗誘導免疫應答的機制

非復制mRNA疫苗若要引發針對抗原的適應性免疫,必須通過宿主細胞的翻譯機制將mRNA翻譯成內源性抗原,內源性抗原在細胞內被蛋白酶體和溶酶體降解為小分子抗原片段后,分別激活MHC Ⅰ類和Ⅱ類途徑,引起機體產生有效的細胞免疫和體液免疫。

mRNA疫苗的免疫效果與接種途徑有關,人們通常選擇用皮內、肌肉和皮下注射,注射后mRNA可以轉染至注射部位附近的非免疫細胞和組織駐留免疫細胞中[53]。在非免疫細胞中,經翻譯得到的抗原最初位于宿主細胞的胞質中,由于合成的抗原蛋白不用于細胞,因此它們在泛素化后作為內源性抗原被蛋白酶體降解[2]。降解后的抗原片段與MHC Ⅰ類分子形成復合物,隨后抗原片段被呈遞于細胞表面,供細胞毒性T淋巴細胞(CD8+T細胞)識別,進而激活 CD8+T細胞介導的免疫應答反應[54]。對于組織駐留免疫細胞,主要是針對抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell, APC),如樹突細胞(dendritic cells, DC)和巨噬細胞(macrophages)[55]。與非免疫細胞不同的是,mRNA轉染至組織駐留免疫細胞后,除可以激活MHCⅠ類途徑,還能通過MHCⅡ類途徑處理抗原,進而激活CD4+T細胞介導的體液免疫應答[54]。通常,MHC Ⅱ類途徑由外源性抗原激活,但也存在交叉遞呈途徑,部分內源性抗原可以通過自噬作用激活MHCⅡ類途徑[56],還有一部分內源性抗原會分泌出胞外,重新作為外源性抗原被內吞入胞內,進而激活MHC Ⅱ類途徑[5]。該過程是內源性抗原被分泌至胞外后,重新進入細胞,并被溶酶體降解為小分子抗原片段,隨后進入內質網中,與MHCⅡ類分子形成復合物,再經高爾基體轉運至細胞表面,供CD4+T細胞識別[57]。CD4+T細胞受抗原刺激后,通過分泌細胞因子等方式使B細胞成熟并分化為漿細胞,進而激活體液免疫應答[58-59]。

由此可見,若想使mRNA引起有效的細胞和體液免疫反應,需要依靠內源性抗原同時激活MHCⅠ類和MHCⅡ類途徑,其中能夠激活MHC Ⅱ類途徑是成功激活體液免疫的關鍵。通常,MHCⅡ類途徑由外源性抗原激活,如果引入分泌型信號肽,通過基因工程改造將抗原引導至胞外[60],便可以將內源性抗原轉換為外源性抗原,進而更有效激活MHCⅡ類途徑[61]。

圖3 mRNA疫苗作用機制Fig.3 Mechanism of action of mRNA vaccine

4 mRNA疫苗的應用

mRNA疫苗因其相較于傳統疫苗更快的研發速度和良好的保護效力在新冠肺炎疫情防控中脫穎而出。2021年8月23日,由BioNTech設計的mRNA疫苗(商品名為Comirnaty)正式獲批上市,用于預防16歲及以上人群的新冠病毒感染,臨床試驗結果顯示,該疫苗預防新冠的有效率為91%[62]。當前,Moderna、NIAID、Canadian Immunization Research Network、BioNTech和CureVac等多家公司研發的針對新冠的mRNA疫苗已進入臨床階段。此外,還有多種針對不同病原的mRNA疫苗(如人副流感病毒、呼吸道合胞病毒、巨細胞病毒、艾滋病毒等)也已經進入臨床研究階段,但目前沒有更多數據得到披露[63-64]。

針對人畜共患病的mRNA疫苗也已有多種進入臨床試驗。2015年12月—2017年8月,德國和美國開展了H10N8和H7N9流感病毒mRNA疫苗的Ⅰ期臨床試驗,評估了流感病毒mRNA疫苗的安全性和免疫原性。結果表明,疫苗沒有導致嚴重的不良反應,并能引起強烈的體液免疫反應[65]。2021年11月23日,CureVac公司完成了對狂犬病病毒mRNA疫苗CV7202的Ⅰ期臨床試驗,用以評估在成人中的安全性、反應原性和免疫原性,受試者分別接種了1、2和5 μg mRNA,結果表明1和2 μg劑量的耐受性更好,二者均誘導產生了中和抗體,提高了IgG水平,沒有引起相關的安全問題,與商品化狂犬病疫苗相當[66]。表1中匯總了進入臨床試驗的人畜共患病mRNA疫苗。

表1 進入臨床試驗的人畜共患病mRNA疫苗(截至2022年12月)Table 1 List of mRNA vaccines against zoonoses in clinical trials(till December 2022)

5 mRNA疫苗在獸醫領域的挑戰和展望

與減毒活疫苗和滅活疫苗相比,mRNA疫苗以IVT mRNA為主要成分,排除了在傳統疫苗中常見的內毒素和其他等感染風險。此外,mRNA疫苗進入細胞質即可表達,無需進入細胞核,不會產生DNA疫苗存在的基因組突變的風險,其安全性優于DNA疫苗和病毒活載體疫苗。且不同于傳統疫苗動輒數年甚至數十年的研發周期,mRNA疫苗的研發速度也遠超于其他疫苗,這種極短的研發周期對攻克具有高突變率特點的病毒來說,具有重要意義。但是,mRNA疫苗的研發也存在一些問題。由于知識產權分散,mRNA疫苗通常是由不同部門的許多參與者共同完成的,這種多頭合作會增加溝通成本,降低mRNA疫苗研發效率[67]。此外,雖然使用LNP可以提高mRNA遞送效率,但LNP的不穩定性要求mRNA疫苗的儲存和運輸需滿足苛刻的條件。有研究顯示,基于LNP的mRNA疫苗凍干化處理后可以在室溫下長期儲存,這為mRNA疫苗的儲存和運輸提供了一個潛在的解決方案[68]。隨著全球合作的進一步深化,mRNA疫苗的專利限制和技術瓶頸等問題或許有望得到解決。

目前,雖然沒有獸用mRNA疫苗進入臨床試驗階段,但新冠 mRNA疫苗的成功上市依舊點燃了人們對研發獸用mRNA疫苗的熱情。我國是畜牧業大國,動物傳染病是制約我國畜牧業發展的重要原因,其中人畜共患病也會對人類的健康和生命財產安全產生重大影響,而接種有效的疫苗是預防和控制傳染病最有效的公共衛生干預措施之一[69]。當前影響畜牧業生產和發展的主要動物傳染病如非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)等,其疫苗保護效力均不理想,mRNA疫苗已在以上動物傳染病疫苗研發中展現出了巨大的潛力。在此,作者將以動物冠狀病毒和非洲豬瘟病毒為例展望mRNA疫苗在獸醫領域的應用。

5.1 基于動物冠狀病毒RBD區的mRNA疫苗

冠狀病毒的宿主譜廣泛,除了人類之外,還能夠感染豬、牛等家畜以及寵物犬、貓等多種動物[70]。感染不同物種的冠狀病毒具有遺傳結構相似性,刺突蛋白(S蛋白)是冠狀病毒主要的結構蛋白,也是誘發細胞免疫和體液免疫的重要組成成分。S蛋白由S1和S2兩個亞基組成,S1亞基包含一個受體結合域,即RBD區,負責與特定的受體結合,而S2亞基則介導病毒和宿主細胞膜的融合。各種證據表明,RBD區是誘導機體產生中和抗體的主要靶點,因此,這一區域也成為疫苗研發的重點目標[31]。新冠肺炎大流行期間,多個公司基于新冠病毒RBD區域設計開發了多款mRNA疫苗,數據顯示,基于RBD區的候選疫苗,如BNT162b1、mRNA-1273等均具有良好的免疫原性[71]。

人類mRNA疫苗的成功為mRNA疫苗在獸醫學中的應用展示了希望。豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎及新發的豬急性腹瀉綜合征均是由冠狀病毒引發的嚴重危害養豬業的重要胃腸道傳染病[70],常用的滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程疫苗雖然對于防控豬冠狀病毒感染起到了一定的效果,但由于冠狀病毒易發生重組或突變,常規疫苗在防控方面往往不盡如人意,研發基于豬冠狀病毒RBD區的mRNA疫苗或許將為疾病防控提供新思路。在寵物疫病方面,貓傳染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus, FIPV)是目前發生最普遍的一種由冠狀病毒變異株引起的高度致死性傳染病,目前沒有商品化的疫苗上市[72]。隨著對動物冠狀病毒RBD和細胞表面受體認識的進一步深入,基于RBD的mRNA疫苗將成為一種對抗新發和再發動物冠狀病毒非常有前途的策略。

5.2 T細胞靶向的非洲豬瘟mRNA疫苗

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,所有品種和年齡的豬均可感染,發病率和死亡率最高可達100%。由于缺乏有效的疫苗,非洲豬瘟已經蔓延到許多國家并造成了嚴重的經濟損失。我國2019年至今非洲豬瘟已造成近700萬頭豬死亡[73]。國內外科研人員雖然已經開發出多種刪除了毒力基因的ASFV減毒活疫苗候選疫苗株,但這些減毒疫苗的大規模生產嚴重依賴于原代豬肺泡巨噬細胞或骨髓細胞,既耗時又費錢[74-76];基于結構蛋白設計的重組蛋白疫苗,雖會誘導出相應中和抗體,并延遲臨床癥狀,但中和抗體無法提供充分的保護。研究證明T細胞在 ASFV 的抗病毒免疫和保護中發揮重要作用。近期,科研人員利用iVAX計算疫苗設計平臺,在ASFV編碼的蛋白質中鑒定出高度保守的細胞毒性T細胞表位[77-78],開發了一種含有預測的豬MHCⅠ類和Ⅱ類表位的T細胞靶向ASF DNA疫苗,并正在評估這種新型疫苗的免疫原性[79-81]?？紤]到DNA疫苗存在整合到宿主基因組的潛在風險,基于mRNA的疫苗方法有可能促進安全有效ASF疫苗的改進。ASFV為大型雙鏈DNA病毒,基因組大小為170～194 kb,含有150～167個開放閱讀框,編碼150～200種蛋白質,目前仍有一半以上的ASFV編碼蛋白功能尚不清楚。隨著研究的逐漸深入,更多潛在的T細胞表位將被挖掘,為開發具有更大表位范圍的T細胞靶向mRNA疫苗提供了廣闊前景。