鴿源白色念珠菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

程相寧,張 韻,何佳蔚,陳政錕,金美蘭,丁紅雷*,王慶華*

(1.西南大學動物醫學院動物支原體學實驗室,重慶 400715;2.西南大學實驗動物中心,重慶 400715)

白色念珠菌(Candidaalbicans)又名白假絲酵母菌,是廣泛存在于人和動物皮膚、口腔、上呼吸道等處的一種條件性致病真菌[1]。家禽的白色念珠菌病又稱霉菌性口炎,俗稱鵝口瘡,多見于幼齡雞、鴿、火雞和鵝,表現為上消化道黏膜形成白色假膜,甚至出現潰瘍[2];造成患禽脾、胸腺、哈德氏腺、法氏囊、骨髓等免疫器官萎縮,引起免疫抑制,進而容易導致其它病原的繼發感染[3]。人和哺乳動物較少發病。

禽白色念珠菌病是一種條件性疾病,當菌群失調或宿主抵抗力較弱時,以及飼養管理不善和飼養環境差就會發生;以幼齡禽多發,成年禽亦有發生。該病發生以夏秋炎熱多雨季節為甚。病禽和帶菌禽是主要傳染來源。病原通過分泌物、排泄物污染飼料、飲水經消化道感染。整體發病率不高,國內外報道較少。但近年來鴿白色念珠菌病的發生在我國呈上升趨勢,給養鴿業帶來極大經濟損失。雛鴿感染主要是通過帶菌親鴿的“鴿乳”而傳染。2020年10月,重慶某鴿場出現大批幼鴿喉頭被黃色干酪樣物堵塞無法進食,最終導致死亡的現象。本課題組采集樣品后進行了病原分離鑒定、人工感染試驗及藥物敏感性測定,找到了引起該鴿場雛鴿發病的病原,為該鴿場此類傳染病的防控提供了依據。

1 材料與方法

1.1 病料采集

重慶某鴿場1～3周齡幼鴿出現喉頭被干酪樣物阻塞導致無法進食、最終死亡的現象。在該鴿場取5只有上述典型癥狀的幼鴿帶回實驗室。用乙醚將鴿子麻醉后剪開頸部左側動脈放血,至血液流干凈后待下一步解剖處理。

1.2 主要試劑、培養基及參考菌株

快速DNA提取檢測試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;3-(N-嗎啡啉)丙磺酸-游離酸(3-(N-Morpholino) propane-sulfonic acid,MOPS)、2×SanTaqMaster Mix購自生工生物工程(上海)股份有限公司;革蘭染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;乳酸酚棉藍染色液購自北京酷來搏科技有限公司;胎牛血清、RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司;氟苯尼考購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;灰黃霉素、培氟沙星購自上海麥克林生化科技有限公司;水溶性兩性霉素B、制霉菌素、克霉唑購自南京都萊生物技術有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar,PDA)培養基購自北京索萊寶科技有限公司;酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(Yeast extract peptone dextrose agar,YEPD)培養基由本實驗室制備。白色念珠菌CMCC(F)98001菌株購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.3 病原分離

無菌操作取病鴿喉頭、嗉囊、腺胃、肌胃、心、肺、肝、腎、脾,以接種環輕刮病鴿的嗉囊、腺胃、肌胃內表面以及無菌切開的喉頭干酪樣物、心、肺、肝、腎、脾內部,劃線接種含1%慶大霉素PDA平板,28 ℃恒溫培養箱培養3～4 d,每天觀察菌落生長情況;待長出菌落后用接種環挑取平板上單個菌落再次劃線接種含1%慶大霉素PDA平板進行純培養,3 d后觀察菌落形態,并挑取單菌落進行革蘭染色和棉藍染色(根據說明書進行操作),染色后在400倍顯微鏡下鏡檢。

1.4 病原的分子生物學鑒定

根據鏡檢結果,挑取對應的單菌落接種YEPD液體培養基,30 ℃、200 r·min-1搖床培養20 h。取1 mL菌液置于1.5 mL離心管,10 000 r·min-1室溫離心1 min,棄上清,沉淀用快速DNA提取檢測試劑盒提取分離菌株基因組,制備DNA模板。根據文獻報道[4]設計PCR擴增引物CaF:5′-TTTATCAACTTGTCACACCAG-3′和CaR:5′-ATCCCGCCTTACCACTACCG-3′。PCR反應體系:2×SanTaqPCR mix 12.5 μL,CaF、CaR各1 μL(10 mmol·L-1),ddH2O 9.5 μL,模板1 μL。反應條件:94 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30個循環;72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。擴增的目的片段為白色念珠菌rDNA基因間轉錄間隔區序列。擴增的片段送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果進一步進行BLAST序列比對。

1.5 芽管生成試驗

于載玻片上滴加5 μL胎牛血清,用接種環挑取單菌落與血清混合均勻,蓋上蓋玻片,37 ℃培養,每小時在顯微鏡下鏡檢,3 h內觀察到芽管生成判定為芽管生成陽性。

1.6 動物回歸試驗

21只3日齡健康雛雞購自重慶某種雞場,經病原學檢測為白色念珠菌陰性。隨機取14只為試驗組,其余7只為對照組。取分離菌CAL2020P8接種20 mL YEPD液體培養基,30 ℃、200 r·min-1培養20 h,用滅菌PBS將菌液濃度調整為1×107CFU·mL-1,以1 mL·只-1的劑量嗉囊接種試驗組雞,對照組嗉囊注射等量滅菌PBS。兩組雞隔離,常規飼養。接種后每天觀察雞的精神、飲食、糞便等情況。每3 d宰殺試驗組雞2只與對照組雞1只。按“1.3”的方法取嗉囊和肝等組織分離病原。取每只雞的嗉囊、肝、腎,保存于40 mL·L-1甲醛固定液中,送成都里來生物醫學實驗中心制作組織切片,并將切片進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色與高碘酸-希夫染色(periodic acid-Schiff,PAS)染色,顯微鏡下觀察組織學病變和病原生長情況。

1.7 藥物敏感性試驗

根據《肉湯稀釋法抗真菌敏感性試驗參考方法(第四版)》(CLSI M27-A4)[5],采用微量肉湯稀釋法檢測分離菌株對抗菌藥物的敏感性。使用的抗真菌藥物包括兩性霉素B、制霉菌素、灰黃霉素和克霉唑,抗細菌藥物包括氟苯尼考和培氟沙星。兩性霉素B耐藥折點按《抗真菌藥敏試驗的流行病學臨界值(第三版)》(CLSI M59)[6]耐藥折點判讀,制霉菌素和克霉唑耐藥折點根據文獻[7-8]給定的耐藥折點耐藥折點。

2 結 果

2.1 菌株分離鑒定

病鴿的喉頭被黃色干酪樣物堵塞(圖1),造成其無法吞咽食物和水。其他組織器官無肉眼可見的病變。在5只病鴿的喉頭干酪樣物分離到5株菌,命名為CAL2020P1～CAL2020P5;在嗉囊分離到3株菌,命名為CAL2020P6～CAL2020P8。在腺胃、肌胃、心、肺、肝、腎、脾中未分離到病原。

圖1 患鴿喉頭被干酪樣物堵塞Fig.1 The larynx of the affected pigeon is blocked by caseous substance

分離的菌株使用白色念珠菌特異性引物進行PCR擴增,所有分離株均能擴增出與預期片段大小相同的約500 bp的片段(圖2)。擴增的rDNA基因間轉錄間隔區序列測序后進行BLAST序列比對,所有菌株擴增片段的核苷酸序列完全一致,且與白色念珠菌rDNA基因間轉錄間隔區序列最為相似(圖3),其中與白色念珠菌44(GenBank accession number:OP627169.1)的序列完全一致,與其它白色念珠菌,如Gm(GenBank accession number:OP629553.1)、29_v9g_F(GenBank accession number:OP601587.1)、J115(GenBank accession number:OP824698.1)等的rDNA基因間轉錄間隔區序列的相似性也超過98.5%。

M.DNA marker;1.陽性對照CMCC(F)98001;2.陰性對照;3.CAL2020P1;4.CAL2020P2;5.CAL2020P3;6.CAL2020P4;7.CAL2020P5;8.CAL2020P6;9.CAL2020P7;10.CAL2020P8M.DNA marker; 1.Positive control CMCC(F)98001;2.Negative control;3.CAL2020P1; 4.CAL2020P2; 5.CAL2020P3; 6.CAL2020P4; 7.CAL2020P5; 8.CAL2020P6; 9.CAL2020P7; 10.CAL2020P8圖2 PCR擴增白色念珠菌rDNA基因間轉錄間隔區序列Fig.2 Amplification of the intergenic transcriptional spacer sequence of rDNA gene from Candida albicans by PCR

圖3 分離菌rDNA基因間轉錄間隔區序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic trees of the isolated bacteria based on intergenic transcriptional spacer sequence of rDNA

分離菌株在含1%慶大霉素PDA平板上生長為乳白色、不透明、邊緣呈放射狀的菌落(圖4A、B)。對分離菌株進行革蘭染色,病原菌在400倍顯微鏡下呈卵圓形、黑色或粉紫色著色不均勻的革蘭陽性酵母樣菌體, 有些長出芽體(圖4C);棉藍染色顯示菌體長出長長的菌絲(圖4D)和孢子(圖4D,a)。所有分離菌在胎牛血清中孵育3 h內,在顯微鏡下均觀測到芽管生成(圖4E)。

A和B. 白色念珠菌在含1%慶大霉素PDA平板的菌落形態;C. 白色念珠菌革蘭染色后的真菌形態;D. 白色念珠菌棉藍染色后的孢子和菌絲形態(a. 白色念珠菌的孢子和菌絲形態;b. 白色念珠菌的菌絲形態);E. 白色念珠菌形成的芽管(a. 孵育1 h;b. 孵育2 h;c. 孵育3 h)A and B. Colony morphology of Candida albicans on PDA plate containing 1% gentamicin; C. Fungal morphology of Candida albicans after Gram staining; D. Morphology of spores and hyphae of Candida albicans after cotton blue staining (a. Morphology of spores and hyphae of Candida albicans; b. Morphology of hyphae of Candida albicans); E. Germ tubes of Candida albicans (a. Incubate for 1 h; b. Incubate for 2 h; c. Incubate for 3 h)圖4 白色念珠菌CAL2020P8的菌落形態、真菌形態及芽管生成Fig.4 Colony morphology, fungal morphology and germ tube formation of Candida albicans strain CAL2020P8

根據分子生物學鑒定結果、菌落形態和真菌形態、生化特性,確定分離的病原為白色念珠菌。

2.2 動物回歸試驗

試驗組雞在接種菌株CAL2020P8后第3天出現采食量下降,嗉囊觸之較為堅硬;隨著感染時間延長,上述癥狀逐漸加重;在感染后第9天癥狀最嚴重,之后逐漸減輕;從第12天開始,部分雞的臨床癥狀逐漸消失,至第21天所有雞的臨床癥狀均消失。未接種病原的對照組沒有出現任何臨床癥狀。在感染后的第3、6、9、12、15、18、21天每天宰殺試驗組雞2只和對照組雞1只,進行剖檢。結果可見在感染第9天病變最為嚴重,嗉囊明顯增厚、上有白色物質附著(圖5);感染第12天后病變逐漸減輕且在感染第21天消失。

A. 對照組雞的嗉囊;B. 試驗組雞的嗉囊A. Crop of chicken from control group; B. Crop of chicken from tested group圖5 雞接種白色念珠菌第9天的嗉囊病變Fig.5 Crop lesions of chicken inoculated with Candida albicans on the 9th day

2.3 組織切片染色與觀察

將人工感染后第3、6、9、12、15、18、21天的嗉囊、肝、腎制作組織切片,分別進行HE染色和PAS染色。肝、腎的HE切片未見任何病變,PAS染色也未見白色念珠菌感染。嗉囊HE染色的結果顯示:感染第3天時表皮角質層開始脫落(圖6A、F);感染第6天時表皮的鱗狀上皮細胞開始變性壞死、脫落(圖6B、G);感染第9天時表皮鱗狀上皮細胞變性壞死現象達到高峰(圖6C、H);感染第12天時表皮出現輕微結痂(圖6D、I);感染第21天時表皮基本恢復,只有部分角質層未完全恢復(圖6E、J);對照組無任何病變(圖6K～O)。

A. 感染3 d的嗉囊(20×);B. 感染6 d的嗉囊(20×);C. 感染9 d的嗉囊(20×);D. 感染12 d的嗉囊(20×);E. 感染21 d的嗉囊(20×);F. 感染3 d的嗉囊(100×);G. 感染6 d的嗉囊(100×);H. 感染9 d的嗉囊(100×);I. 感染12 d的嗉囊(100×);J. 感染21 d的嗉囊(100×);K. 灌服PBS 3 d的嗉囊(20×);L. 灌服PBS 6 d的嗉囊(20×);M. 灌服PBS 9 d的嗉囊(20×);N. 灌服PBS 12 d的嗉囊(20×);O. 灌服PBS 21 d的嗉囊(20×)A. Crop after infection on day 3 (20×); B. Crop after infection on day 6 (20×); C. Crop after infection on day 9 (20×); D. Crop after infection on day 12 (20×); E. Crop after infection on day 21 (20×); F. Crop after infection on day 3 (100×); G. Crop after infection on day 6 (100×); H. Crop after infection on day 9 (100×) ; I. Crop after infection on day 12 (100×); J. Crop after infection on day 21 (100×); K. Crop on day 3 after PBS administration (20×); L. Crop on day 6 after PBS administration (20×); M. Crop on day 9 after PBS administration (20×); N. Crop on day 12 after PBS administration (20×); O. Crop on day 21 after PBS administration (20×)圖6 白色念珠菌感染雞后不同時間點嗉囊的組織病理變化(HE染色)Fig.6 Histopathological changes of crop in chicken infected with Candida albicans at different time points (HE staining)

PAS染色的結果顯示:感染第3天時開始在表皮角質層出現白色念珠菌菌絲(圖7A、F);隨著感染時間延長,菌絲數量逐漸增加(圖7B、G);在感染第9天時達到高峰(圖7C、H);之后菌絲數逐漸下降(圖7D、I),并在第21天時完全消失(圖7E、J);在對照組嗉囊未見白色念珠菌(圖7K～O)。

A. 感染3 d的嗉囊(20×);B. 感染6 d的嗉囊(20×);C. 感染9 d的嗉囊(20×);D. 感染12 d的嗉囊(20×);E. 感染21 d的嗉囊(20×);F. 感染3 d的嗉囊(100×);G. 感染6 d的嗉囊(100×);H. 感染9 d的嗉囊(100×);I. 感染后12 d的嗉囊(100×);J. 感染21 d的嗉囊(100×);K. 灌服PBS 3 d的嗉囊(20×);L. 灌服PBS 6 d的嗉囊(20×);M. 灌服PBS 9 d的嗉囊(20×);N. 灌服PBS 12 d的嗉囊(20×);O. 灌服PBS 21 d的嗉囊(20×)A. Crop after infection on day 3 (20×); B. Crop after infection on day 6 (20×); C. Crop after infection on day 9 (20×); D. Crop after infection on day 12 (20×); E. Crop after infection on day 21 (20×); F. Crop after infection on day 3 (100×); G. Crop after infection on day 6 (100×); H. Crop after infection on day 9 (100×) ; I. Crop after infection on day 12 (100×); J. Crop after infection on day 21 (100×); K. Crop on day 3 after PBS administration (20×); L. Crop on day 6 after PBS administration (20×); M. Crop on day 9 after PBS administration (20×); N. Crop on day 12 after PBS administration (20×); O. Crop on day 21 after PBS administration (20×)圖7 白色念珠菌感染雞后不同時間點嗉囊中白色念珠菌菌絲生長情況(PAS染色)Fig.7 Growth of Candida albicans mycelium in crop after infection of chicken at different time points (PAS staining)

2.4 藥物敏感性結果

測定8株白色念珠菌分離株對4種抗真菌藥物和2種抗細菌藥物的敏感性。由表1可見,分離菌株對兩性霉素B、制霉菌素、克霉唑敏感,對灰黃霉素的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)均>64 μg·mL-1,對氟苯尼考和培氟沙星的MIC均>512 μg·mL-1。

表1 白色念珠菌分離株對4種抗真菌藥物和2種抗細菌藥物的藥物敏感性Table 1 The susceptibility of 4 antifungals and 2 antimicrobials to Candida albicans isolates

2.5 白色念珠菌的再分離及鑒定

試驗組和對照組雞剖檢后,采集喉頭干酪樣物、嗉囊進行白色念珠菌的再分離。刮取所有感染組雞的兩個部位接種含1%慶大霉素PDA平板,均有菌長出;使用白色念珠菌rDNA基因間轉錄間隔區序列引物,在分離菌均能擴增出270 bp左右的片段,說明能在這些部位再次分離出白色念珠菌。而對照組的相應部位接種1%慶大霉素PDA平板,沒有菌長出。

3 討 論

白色念珠菌在自然界廣泛存在,是健康動物上呼吸道和腸道等處的常在菌。盡管在健康和發病家禽中都分離到另外一些念珠菌,但白色念珠菌是導致家禽發病的最主要病原。念珠菌病又名鵝口瘡,是一種內源性的條件性真菌病。禽類的念珠菌病最易發生在口腔和嗉囊。雞、火雞、鵝、鴿、珍珠雞、雉、翎頜松雞、鵪鶉、孔雀、吸蜜鸚鵡、小鸚鵡、鸚鵡和長尾小鸚鵡都有發生過念珠菌病的報道[2,9]。家禽念珠菌病往往呈散在發生,且主要發生于幼齡禽?，F階段我國家禽中發生念珠菌病的報道較為少見[10]。

根據發病鴿場負責人介紹,近年來,我國廣東省很多養鴿場出現幼鴿喉頭被干酪樣物堵塞,最終導致無法進食而死亡的情況。而該養殖場的鴿子則購自廣東省曾經暴發過此類疾病的鴿場。根據幼鴿出現的臨床癥狀,作者初步懷疑該病是念珠菌病或毛滴蟲病。

在病原的鑒定中,除了進行常規的菌落和病原菌形態觀察,作者還通過棉藍染色確定了分離菌菌絲和孢子的存在,通過芽管生成試驗確定了分離菌芽管的生成。根據上述結果以及此次疫情的流行病學、病鴿的臨床癥狀和病理剖檢變化,初步判定分離的病原為白色念珠菌。為了進一步確認,作者擴增了白色念珠菌的rDNA基因間轉錄間隔區序列,通過序列測定確定擴增的基因片段和白色念珠菌rDNA基因間轉錄間隔區序列片段的核苷酸序列完全一致。最終確定從發病幼鴿分離的菌株為白色念珠菌,并通過動物試驗證明了分離菌株的致病性。作者還采集病料檢查了幼鴿是否感染毛滴蟲,結果在顯微鏡下沒有觀察到毛滴蟲的存在。因此,作者確定造成該鴿場幼鴿發病的病原為白色念珠菌。

幼鴿出生后需要母鴿喂食一個月左右才能獨立采食。該鴿場雖然出現幼鴿念珠菌病的暴發,但未見青年鴿和母鴿發病,雖然在母鴿和青年鴿的喉頭和嗉囊也能分離到白色念珠菌。這說明白色念珠菌主要導致不能獨立進食的幼鴿發病;而對于成年鴿,白色念珠菌是其上消化道的常在病原。

在動物回歸試驗中,用鴿作為感染動物是最好的選擇。但由于鴿的養殖企業和養殖戶較少,作者沒有找到無特定病原體(specific pathogen free,SPF)鴿?？紤]到白色念珠菌也能導致雞發病,作者選擇使用白色念珠菌陰性的雛雞作為攻毒動物。試驗結果表明,在幼鴿分離的白色念珠菌具有較強的致病力,能導致雞發病。這進一步說明導致鴿場發病的病原是白色念珠菌。

作者測定了分離菌株對部分抗菌藥物的敏感性。結果顯示抗細菌藥物對分離菌完全無效;分離菌對兩性霉素B、制霉菌素和克霉唑敏感;雖然沒有灰黃霉素對白色念珠菌的耐藥標準,但灰黃霉素對分離菌的MIC均大于64 μg·mL-1。根據藥敏試驗結果,鴿場投喂了制霉菌素,同時還加強了鴿場的生物安全措施,如通風、消毒以及糞便清理,但沒有明顯減少幼鴿的發病。作者分析出現此種情況可能有如下原因:一是由于幼鴿不能自由采食,需要母鴿喂養,因此鴿場實際是向母鴿投喂藥物,再由母鴿將混有藥物的飼料喂給幼鴿,這就造成幼鴿接受的藥物沒有達到治療的劑量。二是白色念珠菌具有復雜的致病和耐藥機制。白色念珠菌形成的生物膜對大多數已知的抗真菌藥物天然具有抗性,如多烯類藥物(包括制霉菌素和兩性霉素B)對白色念珠菌生物膜無效[3]。此外,白色念珠菌還能上調藥物外排泵的表達[11-12],大量分泌細胞外基質導致藥物無法進入細胞內[13-14]等。

考慮到現有藥物對鴿白色念珠菌病的治療效果,鴿場應按照《中華人民共和國動物防疫法》要求,及時淘汰和無害化處理所有鴿。之后對鴿場進行徹底的消毒,直至清除鴿場中所有的白色念珠菌。然后再從沒有暴發過傳染病的鴿場購入新的鴿。鴿場在今后的養殖過程中也應加強生物安全措施,如入場車輛、人員、物資的清洗消毒,鴿場消毒藥的選擇及合適消毒頻率的確定,鴿場糞便的清理等。此外,鴿場還可制備白色念珠菌卵黃抗體[15]飼喂種鴿,用于預防白色念珠菌感染。

4 結 論

從暴發某種傳染病鴿場的發病幼鴿分離到8株真菌,通過分離培養、分子生物學鑒定和動物回歸試驗等確定導致該鴿場發病的病原為白色念珠菌,藥物敏感性試驗測定發現分離菌對兩性霉素B、制霉菌素和克霉唑敏感。對鴿場投喂制霉菌素不能減少鴿的發病。因此建議鴿場對鴿進行淘汰和無害化處理,對鴿場進行全面徹底的消毒。對之后新購入鴿加強檢疫和提高生物安全防控措施,以防再次發生類似疫情。