痤瘡丙酸桿菌拮抗菌的篩選、發酵優化及安全性評價

何夢妮,彭政,張娟*

1(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學,未來食品科學中心,江蘇 無錫,214122)

痤瘡 (acne) 是一種基于毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性疾病,多見于青少年時期,其中有15%～20%的人患有中度至重度的痤瘡[1]。痤瘡會對患者皮膚造成傷害,增加患者產生焦慮、抑郁的風險[2]。痤瘡丙酸桿菌是引發痤瘡的重要因素之一,它可以通過定植產生脂肪酶/酯酶、蛋白酶等酶類造成皮膚損傷,促進白細胞及角質形成細胞產生促炎因子等一系列過程誘導痤瘡發病[3-4]。因此,限制痤瘡丙酸桿菌的定植和增殖是痤瘡治療的關鍵。目前,局部或全身的抗生素使用是治療痤瘡的主要方法之一。然而,抗生素的長期使用會導致痤瘡丙酸桿菌耐藥性的增加[5]。此外,其他藥物的使用例如異維A酸和過氧苯甲酰等存在部分副作用,包括嘔吐、皮膚脫落、皮膚產生刺痛和灼燒感等[6-7]?；谝陨蠁栴},尋找可以有效地抑制痤瘡丙酸桿菌的生長,同時減少副作用的新型抗菌劑越來越受到關注。

微生物在自然界中廣泛存在、種類繁多,是探索和開發新型抗菌劑的重要來源。AGRAWAL等[8]從西海岸和印度安達曼島的樣本中篩選出35種海洋真菌并檢測它們的抗菌活性,其中14株真菌 (42%) 對痤瘡丙酸桿菌表現出不同水平的抗菌活性。CHA等[9]從傳統泡菜中分離出副植物乳桿菌 (Lactobacillusparaplantarum)THG-G10,并證實其對痤瘡丙酸桿菌具有抑菌作用,抑菌圈直徑達到15.00 mm。ONEILL等[10]研究發現,從人體皮膚微生物組中分離出的頭狀葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)E12可以抑制痤瘡丙酸桿菌的生長。雖然目前已有部分痤瘡丙酸桿菌拮抗微生物得到分離和純化,但已發現的拮抗菌對痤瘡丙酸桿菌抑菌活性不高。因此,本研究從酸菜中篩選能高效拮抗痤瘡丙酸桿菌的菌株,通過生理生化和16S rDNA測序比對分析對菌株進行鑒定。采用發酵優化的方法提升其抑菌活性,使用體外安全評價的方法評估菌株的安全性。以期能進一步豐富痤瘡丙酸桿菌拮抗菌資源庫,為該菌株作為抗菌劑在痤瘡治療、化妝品和護膚品行業的應用提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品與培養基

樣品:酸菜樣品購于碧水農場(產自四川宜賓,品名為老壇酸菜),痤瘡丙酸桿菌(Cutibacteriumacnes)ATCC 6919購于廣東省微生物保藏中心。

RCM(reinforced clostridium medium)液體培養基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉粉10.0,酵母粉3.0,葡萄糖5.0,可溶性淀粉1.0,氯化鈉5.0,醋酸鈉3.0,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5,瓊脂 0.5,調節pH 6.7～6.9,121 ℃滅菌15 min。

MRS液體培養基(g/L):K2HPO410.0,乙酸鈉5.0,MgSO4·7H2O 0.5,MnSO4·H2O 0.25,檸檬酸氫二銨2.0,葡萄糖5.0,蛋白胨10.0,吐溫80 1.0,牛肉膏10.0,酵母膏5.0,調節pH 5.5～5.9,115 ℃滅菌20 min。

LB液體培養基(g/L):酵母膏5.0,胰蛋白胨10.0,NaCl 10.0,調節pH 6.9～7.1,121 ℃滅菌15 min。

NB(nutrient broth)培養基(g/L):牛肉膏3.0,胰蛋白胨10.0,NaCl 5.0,調節pH 7.0～7.4,121 ℃滅菌15 min。

TSB(trypticase soy broth)培養基(g/L):胰酪蛋白胨17.0,大豆蛋白胨3.0,葡萄糖2.5,NaCl 5.0,K2HPO42.5,調節pH 7.1～7.5,121 ℃滅菌15 min。

BPY(beef peptone yeast)培養基(g/L):牛肉膏5.0,蛋白胨10.0,酵母膏5.0,NaCl 5.0,葡萄糖5.0,調節pH 7.0,121 ℃滅菌15 min。

Landy培養基(g/L):葡萄糖20.0,L-谷氨酸鈉5.0,蛋白胨10.0,MgSO40.5,KCl 0.5,KH2PO41.0,MnSO40.005,FeSO40.000 15,CuSO40.000 16,調節pH 7.0,121 ℃滅菌15 min。

NYD培養基(g/L):牛肉膏8.0,酵母膏5.0,葡萄糖10.0,調節pH 7.2,121 ℃滅菌15 min。

所有固體培養基在其液體培養基的基礎上加入20 g/L的瓊脂粉。

1.2 主要試劑與儀器

血瓊脂平板,廣東環凱生物科技有限公司;藥敏紙片,杭州濱河微生物試劑有限公司;小型質粒抽提試劑盒、細菌基因組DNA抽提試劑盒,上海生物工程有限公司;研究中引物合成與DNA測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

HDPN-II-55電熱恒溫培養箱,上海躍進醫療器械有限公司;5810R臺式高速離心機,德國Eppendorf公司;DYY-6D瓊脂糖凝膠電泳儀,北京六一生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離純化

取購買的酸菜樣品10 g,放入50 mL無菌離心管中,加入玻璃珠以及25 mL無菌生理鹽水,220 r/min,37 ℃搖床振蕩30 min混勻。取1 mL混合液進行梯度稀釋至10-4,涂布于LB和MRS平板,置于37 ℃培養24 h,根據菌落形態的不同,挑取單菌落進行劃線分離,分離后得到的單菌落用LB或MRS液體培養基置于37 ℃,220 r/min培養24 h,獲取菌株發酵液,用于后續初篩實驗。抑菌效果較好的菌株將置于-80 ℃冰箱進行甘油管保存。

1.3.2 菌株的篩選

痤瘡丙酸桿菌的培養:挑取RCM平板上痤瘡丙酸桿菌單菌落,接種至RCM液體培養,37 ℃厭氧培養48 h至對數末期,用培養基調至其OD600值為1,用于菌株篩選實驗。

初篩:采用瓊脂擴散法進行菌株抑菌活性的檢測,參照文獻方法[11],稍作修改。用鑷子夾取牛津杯置于RCM固體平板上,上層傾注含5%(體積分數)痤瘡丙酸桿菌的RCM培養基10 mL。待凝固后夾出牛津杯,形成樣孔,向樣孔內加入100 μL各菌株發酵液,置37 ℃厭氧培養48 h后,測量抑菌圈直徑。每個實驗組設置3個平行,取平均值。選取抑菌圈直徑較大的菌株進行復篩。

復篩:使用菌株過膜發酵上清液進行復篩。菌株發酵液8 000 r/min離心10 min去除菌體保留上清液,上清液用0.22 μm濾膜進行除菌處理,得到菌株過膜發酵上清液,采用瓊脂擴散法測定抑菌圈直徑,條件與初篩一致。選取抑菌活性最高的菌株進行鑒定及后續分析。

1.3.3 菌株的鑒定

形態學觀察:對菌株HA2進行平板劃線,LB平板置于37 ℃恒溫培養箱培養12 h,觀察并記錄菌落形態特征。同時對菌株HA2進行革蘭氏染色,用光學顯微鏡進行觀察。

生化特征:參照《常見細菌系統鑒定手冊》[12],對菌株HA2進行生化實驗。

分子生物學特征:使用細菌基因組抽提試劑盒提取菌株HA2基因組DNA,以細菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR產物經電泳驗證并純化回收后送往上海生工生物工程有限公司進行測序。測序序列提交至NCBI進行BLAST比對,獲取同源性較高的菌株的16S rDNA序列,通過軟件MEGA-7.0進行序列相似性分析,并構建系統發育樹。

1.3.4 菌株的培養基優化

初始培養基的篩選:用接種環挑取平板上HA2單菌落,接種至LB培養基,37 ℃、220 r/min培養24 h得到拮抗菌株HA2種子液,種子液以3%的比例接種于50 mL的初始培養基 (LB、NB、BPY、Landy、TSB、NYD培養基),30 ℃、220 r/min培養48 h,測定其過膜發酵上清液抑菌圈直徑,選定最佳初始培養基。

培養基成分優化:以最佳初始培養基LB作為出發培養基,培養基的成分和濃度作為初始水平,進行培養基成分優化。選擇不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽提取物、果糖、糊精、可溶性淀粉)替換LB培養基中的碳源(酵母粉)確定最佳碳源種類,對碳源質量濃度(2.5～25 g/L麥芽提取物)進行優化,確定最佳碳源濃度。在最佳碳源基礎上,選擇不同氮源種類(大豆分離蛋白、硫酸銨、脫脂奶粉、酪蛋白水解物、無氨基酵母氮源、牛肉膏和玉米漿)替換LB培養基中氮源(胰蛋白胨)確定最佳氮源種類,對氮源質量濃度(5～30 g/L胰蛋白胨)進行優化,確定最佳氮源濃度。在最佳碳氮源的基礎上,選擇不同種類無機鹽[MgSO4·7H2O、ZnSO4、CaCl2、KCl、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、Fe2(SO4)3·7H2O]替換LB培養基中無機鹽(NaCl),確定最佳無機鹽種類,對無機鹽質量濃度(5～40 g/L CaCl2)進行優化,確定最佳無機鹽濃度。以上培養基優化實驗中的發酵條件均與初始培養基的篩選實驗條件保持一致。

正交試驗:以最佳碳源、氮源和無機鹽為自變量,進行正交試驗。選用三因素三水平試驗正交表進行,因素及水平設計見表1。

表1 正交試驗的因素和水平

1.3.5 菌株的發酵條件優化

挑取平板上HA2單菌落,接種至LB培養基,37 ℃、220 r/min培養24 h得到菌株HA2種子液。種子液按照3%的比例接入優化后培養基中,30 ℃,220 r/min搖床培養。對發酵時間(12～96 h)、發酵溫度(20～40 ℃)、發酵液初始pH值(5.0～9.0)、接種量(1%～9%)、裝液量(10%～60%) 進行優化。后續發酵條件優化實驗均基于上一個最佳發酵條件的基礎上進行,測定菌株HA2過膜發酵上清液的抑菌活性。

1.3.6 四環素效價曲線及發酵優化驗證

分別配制質量濃度為8、16、32、64、128 μg/mL四環素溶液并使用0.22 μm濾膜進行除菌處理,按照1.3.2 節方法測定不同濃度四環素溶液對痤瘡丙酸桿菌的抑菌活性。以抑菌圈直徑大小為縱坐標,以四環素效價的lg對數值為橫坐標(四環素的效價為950 U/mg),建立四環素效價曲線。

接種環挑取平板上HA2單菌落,接種至LB培養基,37 ℃、220 r/min培養24 h得到菌株HA2種子液。將種子液分別接種至優化前和優化后的培養基中,對菌株HA2進行優化前和優化后培養條件下的發酵,比較兩種條件下菌株HA2過膜發酵上清液的抑菌活性,并進行效價換算。

1.3.7 菌株體外安全性評價

溶血性測定:參照文獻[13]方法,稍作修改。吸取5 μL菌株HA2菌懸液點板于血平板上,以金黃色葡萄球菌ATCC 6538作為陽性對照,以植物乳桿菌D8作為陰性對照,LB培養基作為空白對照。37 ℃培養12～18 h,觀察菌落周圍是否產生溶血圈。若菌落四周出現透明溶血環,為β-溶血,若菌落四周出現草綠色環,為α-溶血;若菌落四周無任何變化,則為γ-溶血,即不溶血。

耐藥性測定:采用藥敏紙片擴散法[14]測定菌株HA2對各類抗生素的耐藥性?？股胤N類為氯霉素、卡那霉素、鏈霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、紅霉素、強力霉素、四環素。

耐藥質粒檢測及耐藥基因定位:參照文獻[15]方法,稍作修改。使用小型質粒抽提試劑盒對菌株HA2進行質粒提取,以不含質粒的大腸桿菌DH5α為陰性對照,以含質粒的大腸桿菌pESC-URA為陽性對照,使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒存在情況。參照文獻方法中的引物設計[16],以菌株HA2的DNA為模板,根據表2的引物進行紅霉素耐藥基因ermD/K1、ermD/K2和鏈霉素耐藥基因str的擴增,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,判定有無特異性目的條帶。

表2 耐藥基因引物信息

多種毒力基因的PCR檢測:采用劉純等[17]的方法,參考文獻中芽孢桿菌毒力基因的引物信息。分別提取菌株HA2和陽性對照組蠟樣芽孢桿菌的基因組,以DNA為模板,根據特定的引物分別特異性擴增溶血性腸毒素hbl(hblA、hblB、hblC、hblD)基因、非溶血性腸毒素nhe(nheA、nheB、nheC)基因、腸毒素T(bceT)基因、細胞毒素K(cytK)、和嘔吐毒素(ces)等10種毒力基因,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,引物信息見表3。

表3 毒力基因引物信息

1.3.8 數據處理

用SPSS 26.0進行數據分析,其中差異顯著性通過單因素方差分析,置信度為95% (P<0.05),采用分子生物學軟件MEGA-7.0構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

從酸菜樣品中共分離純化出187株菌株。通過瓊脂擴散法篩選得到12株抑菌圈直徑在20 mm以上的菌株,其中菌株HA2拮抗效果最佳,過膜發酵上清液抑菌圈直徑達到35 mm,選取菌株HA2進行后續實驗。對菌株HA2進行形態學觀察,結果顯示,菌株HA2的菌落形態呈圓形、邊緣不規則,表面光滑,白色不透明 (圖1-a);革蘭氏染色呈陽性,菌體呈桿狀 (圖1-b)。

a-菌落形態;b-革蘭氏染色(10×100)

生化鑒定結果表明菌株HA2兼性厭氧生長,不耐受100 g/L NaCl,淀粉水解、V-P實驗、接觸酶實驗、硝酸鹽還原結果均呈陽性、苯丙氨酸脫氨酶、甲基紅、水解明膠、丙酸鹽和檸檬酸鹽利用結果為陰性。菌株HA2可利用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖,不能利用木糖、果糖。在糖醇發酵產酸實驗中麥芽糖、蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露醇結果呈陽性,半乳糖、山梨糖、乳糖結果為陰性 (表4)。

表4 菌株HA2的生化實驗

將菌株HA2的16S rDNA基因進行序列分析及相似度比對,構建系統發育樹(圖2)。菌株HA2(登錄號為OQ430809)與海恩西芽孢桿菌(Bacillushaynesii)NRRL B-41327(登錄號為NR_157609)在同一分支上,且相似性最高,達99.65%。結合形態學和菌株的生理生化特征,初步鑒定菌株HA2為海恩西芽孢桿菌。根據文獻報道,芽孢桿菌可以產生多種抗菌物質,例如細菌素、抗菌脂肽、聚酮類物質等[18]。海恩西芽孢桿菌HA2過膜發酵上清液抑菌圈直徑可達35 mm,抗菌效果顯著,推測其可以產生至少一種以上的抑菌物質,具有一定的開發潛力。

圖2 菌株HA2基于16S rDNA序列構建的系統發育樹

2.2 培養基優化

初始培養基篩選實驗結果表明,以LB為初始培養基時抑菌圈直徑最大,為28.50 mm。以LB為出發培養基,進行培養基成分優化。以酵母粉為對照,篩選不同的碳源。結果顯示,最佳碳源為麥芽提取物。當質量濃度為15 g/L時,抑菌圈直徑已達到最佳(圖3-a、圖3-b);在最佳碳源的基礎上進行氮源種類優化,圖3-c結果顯示,最佳氮源為胰蛋白胨,當胰蛋白胨質量濃度為25 g/L時,抑菌圈直徑最大,為38.75 mm(圖3-d);在此基礎上,進一步進行無機鹽種類優化。結果顯示,除Fe2(SO4)3·7H2O以外,其余無機鹽均能被菌株HA2利用,其中CaCl2的拮抗促進作用最明顯,質量濃度為5 g/L時,抑菌圈直徑達到42.16 mm(圖3-e、圖3-f)。

a-碳源種類;b-麥芽提取物濃度;c-氮源種類;d-胰蛋白胨濃度;e-無機鹽種類;f-CaCl2濃度

正交優化試驗結果顯示,最佳培養基配方為A2B3C1,即麥芽提取物(15 g/L)、胰蛋白胨(30 g/L)和CaCl2(2.5 g/L),此時抑菌圈直徑達到(43.33±1.15) mm。極差分析的結果顯示,對菌株HA2抑菌活性的影響由大到小的順序為B>A>C,因素B即胰蛋白胨濃度,對菌株HA2抑菌活性影響最為顯著(表5)。

表5 正交優化試驗結果

2.3 發酵條件優化

發酵優化是有效提高菌株抑菌活性的方式之一。葉云峰等[19]通過單因素試驗和正交優化,將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) B47無菌濾液抑菌圈直徑從15.23 mm提升至27.67 mm。高宇潔等[20]采用單因素試驗和響應面分析法優化伯氏致病桿菌(Xenorhabdusbovienii)445培養條件,將抑菌效價提高39.16%。為此,本研究從5個方面(發酵時間、發酵溫度、發酵液初始pH值、接種量、裝液量)對菌株HA2發酵條件進行優化。如圖4所示,菌株HA2在12 h時開始產生抑菌物質,并在72 h時達到最高,此時抑菌圈直徑為48.33 mm(圖4-a)。35 ℃培養時,HA2的無細胞發酵上清液抑菌活性最強(圖4-b)。在pH值為5時,抑菌活性達到最大(圖4-c),為最佳發酵液初始pH。在3%和9%的接種量的條件下,抗菌活性均達到最佳,考慮到實驗成本,選擇3%為最佳接種量(圖4-d)。裝液量為50%時最佳,抑菌圈直徑達到50.00 mm(圖4-e)。綜上,菌株HA2的最佳發酵培養基為麥芽提取物15 g/L、胰蛋白胨30 g/L和CaCl22.5 g/L,最佳發酵條件為發酵溫度35 ℃、發酵液初始pH 5、接種量3%、裝液量50%和發酵時間72 h。

a-發酵時間;b-溫度;c-pH;d-接種量;e-裝液量

2.4 發酵優化驗證

四環素是痤瘡丙酸桿菌常用抑制藥物,根據不同濃度四環素溶液對痤瘡丙酸桿菌抑菌活性的不同建立四環素效價曲線。圖5-a結果顯示,抑菌圈直徑與四環素效價的方程為y=20.131x-48.718,R2達到0.993 9,效價曲線建立成功。對菌株HA2進行發酵優化驗證,圖5-b結果顯示,優化后HA2菌株發酵過膜上清液抑菌圈直徑(53 mm)大于優化前發酵過膜上清液抑菌圈直徑(38 mm)。根據四環素效價曲線進行換算,優化前菌株HA2發酵過膜上清液效價為20 308.6 U,優化后效價為112 927.6 U,效價提升5.56倍。結果表明,優化后的發酵培養基組分和培養條件更加有利于菌株HA2合成抑菌物質。

a-四環素效價曲線;b-發酵優化驗證

2.5 體外安全評價

2.5.1 菌株溶血性

溶血性是評價菌株安全性的重要指標之一。菌株溶血性結果如圖6所示,陽性對照組的金黃色葡萄球菌ATCC 6538周圍產生透明溶血環,為β-溶血。陰性對照組的植物乳桿菌D8和空白對照組的LB培養基無透明圈,為γ-溶血,即不溶血。菌株HA2菌落周圍無透明圈,表明菌株HA2為γ-溶血,無溶血性。

圖6 菌株的溶血性檢測

2.5.2 菌株耐藥性

耐藥性檢測結果如表6所示,菌株HA2對大多數抗生素敏感,對氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、強力霉素高度敏感,抑菌圈直徑在20 mm以上;對氨芐青霉素和四環素中度敏感、抑菌圈直徑在15～20 mm;對鏈霉素和紅霉素耐藥,抑菌圈直徑在15 mm以下。

表6 耐藥性測定結果

2.5.3 耐藥質粒和耐藥基因檢測

耐藥質粒檢測結果如圖7所示,菌株HA2的泳道3沒有出現任何條帶,表明菌株HA2無質粒存在(圖7-a)。對菌株HA2所耐藥的鏈霉素、紅霉素的抗性基因進行檢測,發現鏈霉素抗性基因str和紅霉素抗性基因ermD/K1與ermD/K2在菌株HA2的基因組DNA上(圖7-b)。

a-耐藥質粒檢測(M1-10 000 bp的DNA Marker;1-含有pESC-URA質粒的大腸桿菌;2-不含質粒的大腸桿菌;3-菌株HA2);b-耐藥基因定位(M2-2 000 bp的DNA Marker;4-鏈霉素抗性基因str;5-紅霉素抗性基因ermD/K1;6-紅霉素抗性基因ermD/K2)

耐藥性是目前臨床所面臨的重要難題之一。據報道,芽孢桿菌可通過質粒等移動元件的方式轉移自身耐藥基因,存在風險[21]。因此,對菌株進行質粒檢測和耐藥基因定位具有必要性。實驗結果顯示,菌株HA2雖然對鏈霉素和紅霉素耐藥,但菌株本身并不含有質粒,且鏈霉素的抗性基因str及紅霉素抗性基因ermD/K1與ermD/K2位于菌株HA2的染色體上,保證了菌株HA2在耐藥基因轉移方面的低風險。

2.5.4 毒力基因的PCR檢測

芽孢桿菌中是否攜帶毒力基因是判斷菌株安全性的另一個重要方面。經檢測,菌株HA2無常見毒力基因,包括溶血性腸毒素hbl(hblA、hblB、hblC、hblD)基因、非溶血性腸毒素nhe(nheA、nheB、nheC)基因、腸毒素T(bceT)基因、細胞毒素K(cytK)、和嘔吐毒素(ces)等10種毒力基因(圖8-a),陽性對照組的蠟樣芽孢桿菌檢測到nheC、hblD和cytK基因(圖8-b)。在毒力基因方面,可初步判斷菌株HA2較安全。

M-2 000 bp的DNA Marker;1-nheA;2-nheB;3-nheC;4-hblA;5-hblB;6-hblC;7-hblD;8-bceT;9-cytK;10-ces

3 結論

本研究從酸菜樣品中篩選到1株能高效拮抗痤瘡丙酸桿菌的海恩西芽孢桿菌HA2,其過膜發酵上清液抑菌圈直徑可達35 mm。通過培養基和培養條件的優化,菌株HA2過膜發酵上清液抑菌圈直徑從38 mm提升至53 mm。根據四環素效價曲線進行換算,效價從20 308.6 U提升至112 927.6 U,提升5.56倍。確定了菌株HA2的最佳發酵條件:培養基為麥芽提取物15 g/L、胰蛋白胨30 g/L、CaCl22.5 g/L;培養條件為接種量3%、裝液量50%、發酵液初始pH 5、發酵溫度35 ℃和發酵時間72 h。從溶血性、耐藥性和是否含有毒力基因三方面對菌株HA2進行體外安全評價。結果表明,菌株HA2不具有溶血性,耐藥基因轉移風險較低,無毒力基因。因此,可初步判斷菌株HA2具有一定的生物安全性。菌株HA2能高效拮抗痤瘡丙酸桿菌,并通過體外安全評價。因此,在痤瘡治療方面具有一定的應用前景。