中性水相介質中開菲爾胞外多糖與乳清蛋白的相互作用

白英,王純瑋

(內蒙古農業大學 食品科學與工程學院,內蒙古 呼和浩特,010018)

蛋白質凝膠性、乳化性、起泡性等重要功能因多糖的參與得以改善,進而改變食品質構及加工特性,可用于提高乳液狀食品貨架期和改善食品品質。蛋白質-多糖相互作用在食品行業及生命體信號傳導、免疫應答、細胞黏附、病菌感染等許多細胞識別過程中發揮重要作用,蛋白質和多糖的相互作用引起許多科學領域的廣泛興趣。蛋白質和多糖之間的關聯相互作用是連續相和界面處的絡合及凝膠形成的主要基礎,傳統上用于改善食品制造中各種食品膠體(分散體、乳液、泡沫、凝膠及其混合變體)的物理穩定性和結構特征。開菲爾胞外多糖(Kefiran)與各種微生物形成了開菲爾粒結構的骨架,并可以保護開菲爾粒免受外部微生物的危害。與其他多糖相比,Kefiran具有顯著的抗菌和抗真菌特性、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、減少血清膽固醇水平和調節腸道免疫系統等功能特性。經過許多學者研究發現,體系中乳清蛋白(whey protein,WP)的聚集與乳清蛋白和多糖之間的相互作用有關[1]。HUAN等[2]研究了不同多糖對冷凝乳清蛋白凝膠性質的影響。DE JONG等[3]和曾令鶴等[4]研究了不同多糖與乳清蛋白混合體系微觀結構的影響。謝建華等[5]研究得出一定比例的乳清蛋白-魔芋葡甘聚糖混合體系表現出協同作用。微生物多糖被用作食品添加劑在食品工業中被廣泛應用。所以對Kefiran與乳清蛋白相互作用的研究對食品工業的發展及Kefiran的開發研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WP,恒天然合作社集團有限公司;Kefiran,本實驗室提取自開菲爾發酵乳[6]。

1.2 儀器與設備

Nano-ZS90激光粒度儀,英國馬爾文公司;TM400SEM掃描電鏡,日立高新技術那珂事業所;FL970Plus熒光分光光度計,上海天美有限公司;T6-新世紀紫外-可見分光光度儀,北京普析通用儀器有限責任公司;DHR-2 DHR流變儀,美國TA Instruments公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Kefiran/WP混合溶液的制備

WP溶液為10%(質量分數);Kefiran/WP溶液是含有10%(質量分數)的WP和2%(質量分數)的Kefiran。28 ℃的恒溫磁力攪拌水浴1.5 h后取出。及時進行以下試驗。

1.3.2 粒徑測定

將樣品在通用分析模式下進行粒徑測定。條件為分散劑為水的折射率為1.333,樣品顆粒的折射率為1.520,波長為633 nm,每個樣品測定3次,得到平均粒徑。

1.3.3 Zeta-電位測定

將樣品稀釋后置于激光粒度儀中進行Zeta-電位的測定。溫度25 ℃,每個樣品進行3次平行試驗。

采用體積分布進行數據統計,分別選取d(0.1)、d(0.5)、d(0.9)及峰的分布寬度[7]進行表示。分布寬度的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:d(0.1)、d(0.5)、d(0.9)分別表示樣品的累計粒徑分布數達到10%、50%、90%時所對應的粒徑。

1.3.4 紫外/可見光譜掃描

將樣品置于石英比色皿中用紫外分光光度計進行全波長掃描。溫度25 ℃,掃描波長220～400 nm,采樣間隔1 nm,每個樣品進行3次平行試驗。

1.3.5 內源性熒光光譜的測定

將樣品置于專用比色皿中用熒光分光光度計進行測定。溫度25 ℃,激發波長295 nm,掃描范圍310～440 nm,掃描速率240 nm/min,采樣間隔1 nm,每個樣品進行3次平行試驗。

1.3.6 流變學特性研究

采用DHR流變儀對不同樣品溶液進行流變學特性研究。通過在10～1 000 s-1剪切速率下測定黏度的變化。通過應力掃描觀察儲能模量(G′)和損耗模量(G″)的變化。通過0.1～100 Hz剪切振蕩頻率下測定表觀黏度的變化。

1.3.7 數據分析

本實驗用Design-Expert 13分析軟件進行響應面分析,所有數據通過SPSS 23統計軟件進行方差分析,之后用origin 2019b軟件進行做圖。

2 結果與分析

2.1 粒徑測定

粒徑分布情況可以反映溶液中多糖和蛋白質的相互作用,也是判斷溶液是否均一的重要指標[8]。粒度的累積分布圖表示顆粒從最小到某一代表粒徑值范圍內的顆粒占總的顆粒的百分比含量。d(0.1)表示粒度累積分布(0～100%)中10%所對應的直徑,d(0.5)和d(0.9)同理,其中d(0.5)是中值粒徑,是粒度大小的典型值。D[3,2]表面積加權平均粒徑,D[4,3]體積加權平均粒徑,兩者差值表明顆粒的規則度及分布狀態。均勻性系數越高說明顆粒越集中,粒度分布范圍越窄,表示樣品中顆粒分布的均勻性越好,反之則越分散。

從圖1、表1和表2中可以看出,Kefiran粒徑<0.57 μm的占到10%;<0.76 μm的占到50%;<1 μm的占到90%;WP粒徑<0.08 μm的占到10%;<0.17 μm的占到50%;<0.75 μm的占到90%;Kefiran/WP(1∶5)粒徑<0.12 μm的占到10%;<7 μm的占到50%;<69.9 μm的占到90%,且7組實驗樣品中,d(0.1),d(0.5)和d(0.9)的含量均存在顯著差異(P<0.05)。KefiranD[3,2]和D[4,3]的差值為0.037 μm,峰分布寬度為0.558,d(0.5)為0.765 μm,說明2% Kefiran溶液中多糖顆粒的形狀相對比較規則,50%的顆粒粒徑集中于 0.765 μm左右。與Kefiran相比,10% WP溶液和2% WP溶液中蛋白顆粒粒度分布較寬,50%的顆粒粒徑分別集中于0.173 μm和0.167 μm左右,相差不大。但考慮10% WP溶液殘差值<3%,理論光強和實際光強信號良好匹配<1%,因此,后期混合樣品采用10% WP溶液。

表1 不同溶液粒徑累計分布結果

表2 不同溶液的表面積和體積的加權平均粒徑及均勻性系數

圖1 不同溶液的粒徑分布

WP與Kefiran帶相同電荷,由于熱力不相容現象[9],混合溶液中形成了WP分散相和Kefiran分散相,蛋白質肽鏈和暴露出來的疏水基團由于靜電相互作用和疏水相互作用形成聚集體,導致Kefiran/WP溶液粒徑增大。因此,2% Kefiran溶液與10% WP混合后,粒度分布較2% Kefiran溶液和10% WP溶液變大。其中,Kefiran/WP(1∶5)粒度分布大于其他3種混合樣品,峰的分布寬度較其他3種混合樣品寬(P<0.05),50%粒徑集中于7.043 μm左右。且Kefiran/WP(1∶5)均勻性系數明顯高于其他3種混合樣品(P<0.05),說明Kefiran/WP(1∶5)混合樣品中顆粒分布的均勻性較好。因此,后期以Kefiran/WP(1∶5)混合樣品為研究對象,進行Kefiran和WP互作關系的進一步研究。

2.2 Zeta-電位測定

Zeta-電位用來測定樣品的表面電荷密度以及帶電性質,也可以用來反映WP和多糖之間的靜電作用程度,進一步反映溶液的穩定性[10]。Kefiran電位值為-2.09 mV,WP的Zeta電位值約為-30.37 mV,混合溶液Kefiran/WP的Zeta-電位均處于Kefiran與WP之間,為-24.47 mV,混合溶液的Zeta電位值為-20 ～-30 mV(圖2),屬于比較穩定的溶液,這一現象與MA等[11]的研究結果類似。

圖2 不同溶液的Zeta-電位的影響

2.3 紫外/可見光譜掃描

為了進一步分析乳蛋白與多糖之間的相互作用,分別測定了不同樣品溶液的紫外光譜圖,如圖3所示,紫外-可見吸收光譜在280 nm處可觀察到特征吸收峰,吸收峰主要由芳香族氨基酸生色團(色氨酸吲哚環和酪氨酸苯環)的π-π*躍遷所致。從圖3和圖4可以看出,不同樣品溶液的最大吸收波長以及紫外吸收強度均發生了變化,可能是由于蛋白質肽鏈展開,含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸暴露出來導致發生了變化[12]。在Kefiran/WP混合體系中,Kefiran/WP混合溶液的吸收峰強度降低,最大吸收峰相比于WP發生紅移,這可能是因為加入的Kefiran與蛋白質結合,導致疏水氨基酸基團被包裹[13]。

圖3 不同溶液的紫外光譜圖

圖4 不同溶液的內源性熒光光譜圖

2.4 內源性熒光光譜的測定

內源性熒光光譜可以通過分析蛋白質的熒光基團酪氨酸殘基和色氨酸殘基微環境的變化,觀察熒光強度及最大發射波長的變化,反應出蛋白質和多糖結合后三級結構和極性發生的變化[14]。

在Kefiran/WP混合體系中,WP溶液的熒光強度最強,Kefiran的加入減弱了WP中色氨酸殘基的疏水作用[15],導致Kefiran/WP混合溶液的熒光強度顯著降低,Kefiran/WP混合溶液的最大發射波長比WP向低波段移動了5 nm。

由圖4可知,WP的最大熒光峰出現在326 nm處,表明色氨酸存在于蛋白質內部的疏水基團中,被非極性氨基酸包圍[16]。與WP溶液相比,Kefiran/WP混合溶液最大發射波長熒光強度降幅明顯,且最大發射波長向低波段波長方向移動,表明蛋白質色氨酸殘基附近的疏水作用逐漸減弱,使熒光強度降低。

2.5 掃描電鏡結果

不同樣品凍干后微觀結構如圖5所示,WP的微觀結構為大小較為均一、表面粗糙疏松的顆粒狀結構(圖5-a),與Kefiran表面光滑具有薄膜特點、結構疏松(圖5-b)、間或呈網狀結構相比,通過電鏡圖片觀察到Kefian-WP的結構呈碎片狀、表面緊密光滑(圖5-c)。同樣,ZHAO等[15]發現陰離子多糖可以通過共價相互作用使WP的不同球狀顆粒轉變為更緊密和光滑的結構。說明Kefiran與WP在中性水相介質中可形成聚合物結構。

a-WP;b-Kefiran;c-Kefiran/WP

2.6 流變學特性

2.6.1 剪切性質分析

圖6顯示了在剪切速率范圍(10～1 000 s-1)內,不同樣品溶液的黏度與剪切速率的關系。當剪切速率較低時,Kefiran/WP混合溶液和WP溶液的黏度隨著剪切速率的增加而減小,體現出假塑性和剪切稀釋的流動特征;剪切速率較高時,隨著剪切速率的增加表現為恒定的理想牛頓流體行為。Kefiran/WP混合溶液的黏度值高于單一WP體系的黏度值,這是因為Kefiran可以增加溶液的黏度,這與PIERMARIA等[17]和MORADI等[18]的結果一致。

圖6 不同溶液剪切速率與黏度的關系

穩定狀態下測量不同溶液表觀黏度如圖7所示。在混合體系中,Kefiran/WP比WP的表觀黏度更高,溶液表觀黏度由于Kefiran的加入而增加,這一事實表明多糖在混合體系中起主導作用[19]。這有利于乳狀液產品貯藏、運輸及貨架期期間的穩定性。

圖7 不同溶液表觀黏度變化

2.6.2 動態力學分析

2.6.2.1 應變掃描

圖8顯示對不同樣品進行應變掃描測試的結果。G′是用于表示剪切過程中樣品中貯存的可逆能量,表示樣品的彈性尺度[20];G″表示不可逆的衰減的剪切能部分,表示樣品的黏性行為?？梢杂^察到2個不同區域:G′和G″保持恒定的是線性黏彈性區域,此范圍內結構中的變形是可逆的;G′和G″發生變化的是非線性區域[21]。所有溶液在線性黏彈性區都表現出G′值大于G″值的弱黏彈性凝膠特征,這與SUN等[19]和PRASANNA等[22]的結果相一致。在Kefiran/WP混合體系中,Kefiran-WP混合溶液的應變值略高于WP的應變值,是因為在Kefiran/WP混合溶液中存在耗盡(depletion)相互作用[17]。耗盡力是膠體系統中一種廣泛存在的相互作,指尺寸不同的球體相混時,存在促進大球聚集的體積排除熵。通過增強耗盡效應來促使高分子達到預定的有序排列。因此,Kefiran可能會使蛋白質聚集體之間產生新的相互作用,促使凝膠性增強。從剪切性質分析結果也可以看出(圖6),隨著多糖的加入,體系黏度增強,這在一定程度上可以提高食品體系的凝膠穩定性,增強體系的保水性,從而改善食品的口感和組織特性及發酵乳產品運輸期或貨架期乳清析出問題。

圖8 應變對不同溶液黏彈性的影響

2.6.2.2 頻率掃描

圖9為測試了不同樣品溶液不同振動頻率時的黏彈性,可以進一步從微觀結構運動的角度了解不同溶液體系的性能。隨著剪切振蕩頻率的增加不同溶液的G′和G″都表現出不同程度的升高。在Kefiran/WP混合體系中,WP和Kefiran/WP混合溶液均表現出在低頻率時G′均低于其G″,隨著頻率的升高出現G″高于G′的變化,G″與G′相同時的頻率稱為交叉頻率[23]。頻率低于交叉頻率時,表現為黏性性質(G″>G′);頻率高于交叉頻率時,表現為彈性性質(G″

圖9 頻率對不同溶液黏彈性的影響

3 結論

在Kefiran/WP混合體系中加入Kefiran均使體系的粒徑增大,結構呈碎片狀、表面緊密光滑。電位的絕對值減小,表觀黏度增加以及黏彈性的增強。Kefiran/WP混合體系中,Kefiran與WP的相互作用導致粒徑的增大以及電位絕對值減小。Kefiran本身不可忽略的增稠作用導致表觀黏度的增加。Kefiran與WP之間的耗盡作用使黏彈性及凝膠特性增強,而在頻率變化時表現出明顯的頻率依賴性。通過調節或增強Kefiran與WP的耗盡力,可以廣泛用于改善或提高產品品質。

目前,除蛋白-多糖復合物的凝膠性、乳化性、起泡性等特性在食品加工等方面的研究之外,研究者以蛋白-多糖復合體系作為載體進行功能因子包埋和保護及生物活性物質的遞送;利用蛋白-多糖復合來制備可食用薄膜和涂層,以期在食品保護和貯藏中實現創新應用等方面也已廣泛開展研究。因此通過調節蛋白質和多糖之間的共價和非共價相互作用制備功能優異的復合物,在食品與醫藥等領域有著廣闊的應用前景。