番茄紅素β-環化酶和新黃質合酶功能差異關鍵氨基酸的發掘

王麗,趙子龍,劉振*,毛相朝,3

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院,青島市食品生物技術重點實驗室,山東 青島,266404) 2(中國輕工業水產品生物加工重點實驗室,山東 青島,266404) 3(青島海洋科學與技術試點國家實驗室,海洋藥物與生物制品功能實驗室,山東 青島,266237)

酶,是一種極為高效的特殊催化劑,其化學本質是具有催化活性的蛋白質或核酸[1-2]。由于酶的基因在長達數萬年的進化過程中不斷地復制與突變,因此出現了諸多同源酶[3],大部分的同源酶氨基酸序列相似度較高,但催化的反應可能不同。在類胡蘿卜素合成過程中,將番茄紅素環化生成β-胡蘿卜素的番茄紅素β-環化酶(lycopene β-cyclase,LCYB)[4],和將紫黃質環化為新黃質的新黃質合酶(neoxanthin synthase,NSY)[5]序列高度相似,但是功能不盡相同。在普遍認為的原生質體祖先——藍藻中僅含有LCYB,且這兩種酶發揮活性還均結合有相同的輔酶和相似的活性中心[6-8],因此有研究認為NSY和LCYB存在進化關系,屬于同源酶[4-5,9-10]。但對導致LCYB和NSY功能差異的原因,此前從未有報道。因此本研究旨在探究LCYB和NSY對番茄紅素環化功能差異的原因。LCYB是生成β-胡蘿卜素的關鍵酶之一,在代謝通路中處于上游,對LCYB的研究較多,已經鑒定識別的不同來源的LCYB超過500個。LIU等[11]通過大腸桿菌異源表達證明來自寧夏枸杞的番茄紅素β-環化酶(LyLCYB)可以將番茄紅素催化生成β-胡蘿卜素。相較于LCYB,關于下游類胡蘿卜素合成途徑中將紫黃質催化生成新黃質的NSY研究較少[12],被鑒定識別的NSY遠不如LCYB多。BOUVIER等[9]從番茄中克隆了大小為56 kDa的新黃質合酶(SoNSY),SoNSY和LyLCYB氨基酸序列相似性高達88.2%,且實驗證明其不具備催化番茄紅素的能力。

LCYB和NSY的底物均是對光、熱等敏感的具有抗氧化性的類胡蘿卜素[13],實現催化作用還需要有輔酶FAD和NADPH的參與[8],相較于在體內構建酶的表達系統,體外表達需要考慮底物的快速氧化以及輔酶的添加,更為困難且具有不穩定性,故構建體內類胡蘿卜素代謝通路是理想的研究手段。因此本研究選擇了枸杞來源的LyLCYB和番茄來源的SoNSY作為研究對象,全基因合成LyLCYB基因lyLCYB和SoNSY基因soNSY,通過構建嵌合體和點突變的方式將改造后的基因在大腸桿菌中實現異源表達,HPLC分析工程菌株發酵后的產物,以此發掘導致LyLCYB和SoNSY中番茄紅素環化功能差異的關鍵氨基酸位點。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

lyLCYB、soNSY、crtE、crtB、crtI由華大基因全基因合成;高保真DNA聚合酶試劑Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、DNA聚合酶試劑2×TaqMaster Mix (Dye Plus)、重組克隆試劑ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit購于諾唯贊生物公司;PCR回收試劑盒、快速質粒小提試劑盒購于天根生化科技公司;SSCS感受態細胞制備液購于上海捷瑞生物公司;番茄紅素標準品、β-胡蘿卜素標準品、IPTG、酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、氨芐青霉素、卡那霉素均購于索萊寶科技公司。其他試劑未作特殊說明均為國藥化學試劑分析純。PCR引物由青島擎科公司提供。

1.2 培養基配方

LB液體培養基:稱取1.0 g胰蛋白胨,0.5 g酵母提取物,1.0 g氯化鈉,溶于100.0 mL純水中,115 ℃滅菌30 min[若需配制LB固體培養基,則在此基礎上添加1.5%～2.0%(質量分數)的瓊脂粉]。

氨芐青霉素溶液:稱取0.1 g的氨芐青霉素粉末放置于1.5 mL的離心管中,用1.0 mL的超純水溶解,在超凈臺中過孔徑0.22 μm的水相濾膜,放于-20 ℃冰箱備用,且添加量為0.1%(體積分數)。

100.0 mg/mL卡那霉素溶液:方法同上[稱取1.0 g 卡那霉素粉末,添加量為0.05%(體積分數)]。

1.3 生物信息學分析

利用如下生物信息學分析網站及軟件分析序列,目標序列的基因查找網址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/;蛋白質序列轉運肽預測網址[14]:http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/;判定目的蛋白是否具有膜結合域網站:http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/;蛋白質結構域預測分析網站:http://smart.embl-heidelberg.de/;實驗過程中用到蛋白質序列分析軟件:Jalview(氨基酸序列比對)[15]、SnapGene(質粒構建)。

1.4 構建嵌合體雙質粒菌株

目的片段的擴增以及質粒載體構建選用了高保真酶,并使用同源重組的方法使得各片段連接處留有15～20 bp同源序列。各種不同嵌合體構建的方式是將soNSY基因的部分片段替換為lyLCYB基因對應位置的片段。本實驗室將crtE、crtB、crtI基因搭載到氨芐青霉素抗性的pTrc99a載體上構建了產番茄紅素質粒[16];lyLCYB、soNSY及嵌合體基因搭載到以卡那霉素為抗性的pTac15K載體上用以探究原酶和重組酶的活性。構建質粒所需引物如表1所示,利用重組克隆試劑進行重組連接,將重組產物轉入大腸桿菌(Escherichiacoli)TreliefTM5α感受態中,涂布至對應抗生素的LB固體培養基上。37 ℃ 過夜培養約12 h后挑菌測序,并將測序結果正確的菌株接種至LB試管中培養6～8 h,OD600≈0.6時,用快速質粒小提試劑盒提取質粒備用。

將提取的pTrc99a-crtEBI質粒利用水浴法轉化到E.coliBL21(DE3)中,37 ℃過夜培養后,挑取單菌落,經過PCR驗證正確后,接種到LB試管中,添加氨芐青霉素抗性過夜培養,取1.0 mL 接種到含有氨芐青霉素抗性的50.0 mL LB錐形瓶培養基中,培養至OD600值為0.5～0.6左右,利用SSCS感受態細胞制備液,制備產番茄紅素的感受態細胞,隨后再次利用水浴法將第二個質粒轉化到自制的產番茄紅素感受態細胞中,涂布于氨芐青霉素和卡那霉素雙抗性的LB固體平板,過夜培養,挑取單菌落,PCR驗證,最終構建好的菌株如表2所示。

表2 實驗所需菌株

1.5 發酵培養嵌合體雙質粒菌株

將所需發酵菌株按照1%的添加量接種到裝液量為33%(體積分數)的含有相應抗性的LB試管培養基中,在37 ℃,200 r/min搖床培養3～4 h,至菌體OD600≈0.6時,按照0.1%(體積分數)的添加量加入100 mmol/L的IPTG誘導菌株高效表達蛋白,隨后37 ℃,200 r/min搖床繼續培養10～12 h后終止發酵,檢測產物。

1.6 HPLC分析

建立完備的檢測方法有助于分析發酵產物的組成和目標產物的含量,雙質粒工程菌株發酵完成后,依次經過預處理和HPLC對產物進行分析,具體操作如下:

a)制備發酵樣品:取發酵完成的菌液2.0 mL至2.0 mL離心管中,12,000 r/min離心3 min,重復操作1次,在離心管中富集到4.0 mL菌液的菌體,移液槍吸取500.0 μL色譜級丙酮[17]至離心管中,用滅菌后的牙簽混合均勻,并到渦旋儀上渦旋5 min,后放置于37 ℃水浴鍋中,靜置20 min,將樣品盡可能多的萃取到溶劑丙酮中。隨后12,000 r/min離心5 min,將上清液過孔徑0.22 μm的尼龍濾膜后取200 μL到含有內襯管的液相小瓶中,做好標記,等待檢測。

b)HPLC檢測:HPLC以液體為流動相,采用高壓輸液系統,將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱,在柱內各成分被分離后,進入檢測器進行檢測,從而實現對試樣的分析。本實驗中利用YMC Carotenoid(C-30)[17-19]類胡蘿卜素分析色譜柱對樣品進行分析檢測,吸光度476 nm,總流速1.0 mL/min,進樣量20 μL,柱溫35 ℃,流動相為色譜級甲醇和甲基叔丁基醚,采用二元高壓梯度洗脫25 min,具體的洗脫方法如表3所示。

表3 HPLC檢測產物方法

2 結果與分析

2.1 LyLCYB和SoNSY番茄紅素β-環化功能驗證

全合成lyLCYB和soNSY基因后,通過基因重組技術構建了質粒pTac15K-LyLCYB和pTac15K-SoNSY,且在產番茄紅素的E.coliBL21(DE3)中進行了異源表達,經過發酵,如圖1所示,在含有lyLCYB基因的菌株發酵產物中檢測到了β-胡蘿卜素,而含有soNSY基因的菌種發酵產物中,僅發現番茄紅素,沒有產生β-胡蘿卜素,由此判斷,LyLCYB可以使番茄紅素環化成β-胡蘿卜素,而SoNSY不可以。

圖1 LyLCYB和SoNSY番茄紅素β-環化功能分析結果

2.2 LyLCYB和SoNSY的結構域劃分

因本研究要在大腸桿菌中實現異源表達,大腸桿菌屬原核生物,缺少膜狀細胞器無法結合具有膜結合域的酶,因此難以使具有膜結合域的蛋白質產生酶活力[20-21]。而本研究所選的研究對象LyLCYB和SoNSY來源于具有膜狀細胞器的真核高等植物,可能具有膜結合域,故首先對LyLCYB和SoNSY進行了膜結合域分析。預測的結果如圖2-a所示,二者都不具備膜結合域。這對LyLCYB和SoNSY的大腸桿菌異源表達是十分有利的。

a-TMHMM-2.0預測LyLCYB和SoNSY的膜結合域;b-SMART預測LyLCYB和SoNSY結構域;c-敲除cTP的QlyLCYB基因番茄紅素β-環化功能分析

接下來對含有498個氨基酸的LyLCYB和SoNSY序列進行了結構域劃分。如圖2-b所示,通過預測發現兩個序列都含有自E2到C51的葉綠體轉運肽(chloroplast transport peptide, cTP);且Q81-P114肽段均為兩基因的FAD結合區域(FAD_binding domain);LyLCYB和SoNSY都包含兩個環化保守基序(279～301Cyclase motif Ⅰ和353～367Cyclase motif Ⅱ)和蛋白N端非保守區域(477～498 NB)?？紤]到cTP主要起引導作用,在真核生物中cTP完成轉運職責后會被切除[22],因此真正發揮活性的天然酶中并不具備cTP,而原核生物體內不具備切除葉綠體轉運肽功能的此類肽酶,因此我們敲除了lyLCYB基因中編碼cTP的部分,構建了編碼QLyLCYB的QlyLCYB突變基因(圖2-b)。如圖2-c所示,敲除cTP后,QlyLCYB仍舊具備番茄紅素β-環化活性。且基于HPLC結果,含有基因QlyLCYB的菌株發酵產物中,β-胡蘿卜素產物的峰面積高于含有lyLCYB基因,因此相較于原基因,敲除cTP的QlyLCYB基因環化能力提高。這可能是由于cTP在大腸桿菌中會阻礙酶發揮功能,所以去除了cTP以后,QLyLCYB對番茄紅素的環化能力提高。因此本研究后續的實驗均在敲除掉cTP的基因上進行。

2.3 影響番茄紅素環化功能關鍵氨基酸的發掘

如圖3-a所示,對LyLCYB和SoNSY進行序列比對,發現除cTP外,LyLCYB和SoNSY共有59個差異氨基酸位點。因此,本研究采用構建嵌合體的方式,將QSoNSY序列的部分肽段替換為對應的QLyLCYB氨基酸序列,分區域判斷關鍵氨基酸位點所在的位置,逐步縮小范圍。構建了如圖3-b所示的4個嵌合體質粒,分別是pTac15K-QLyLCYBa、pTac15K-QLyLCYBb、pTac15K-QLyLCYBc、pTac15K-QLyLCYBd,將這4個嵌合體質粒導入產番茄紅素的E.coliBL21(DE3)中,經過發酵分析后,在含有pTac15K-QLyLCYBa、pTac15K-QLyLCYBb、pTac15K-QLyLCYBd這3個質粒的菌株中均檢測到了番茄紅素和β-胡蘿卜素,而含有pTac15K-QLyLCYBc質粒的菌株發酵產物中,僅發現了番茄紅素(圖3-c)。上述實驗結果表明,導致QLyLCYB和QSoNSY對番茄紅素環化差異的關鍵氨基酸位點在pTac15K-QLyLCYBd質粒替換的這一部分上,將這部分肽段命名為CL(N120～K277)。

a-LyLCYB和SoNSY序列比對結果;b-嵌合體構建示意圖;c-含嵌合體基因菌株發酵產物HPLC結果

在CL肽段內QLyLCYB和QSoNSY共有19個差異氨基酸位點,因此為了進一步縮小影響環化功能的關鍵氨基酸范圍,又將CL肽段進行了分段替換,分別構建了pTac15K-QLyLCYB-FH、pTac15K-QLyLCYB-MID、pTac15K-QLyLCYB-TSH這3個質粒(圖4-a),將這3個質粒進行了轉化發酵分析后,如圖4-b所示,含有這3個質粒的菌株中,僅含有pTac15K-QLyLCYB-FH質粒的菌株發酵產物中檢測到了β-胡蘿卜素,其他2個在發酵產物中沒有發現β-胡蘿卜素。依據上述的實驗結果,將含有關鍵氨基酸的肽段范圍縮小至FH處,即影響番茄紅素環化功能的關鍵氨基酸在209～279。然而在FH肽段內仍舊有10個差異氨基酸位點(圖4-c),因此后續采用定點突變的策略對這10個差異位點的功能進行探究。

a-嵌合體構建示意圖;b-含嵌合體基因菌株發酵產物HPLC結果;c-FH片段中10個差異氨基酸位點分布

2.4 關鍵氨基酸位點219的發掘

為了進一步確定差異的氨基酸位點,將QSoNSY和QLyLCYB在FH區域中的10個差異氨基酸位點209、210、219、223、229、230、241、243、256和276進行突變構建點突變蛋白,即將QSoNSY上的差異位點突變QLyLCYB的對應位置的氨基酸,隨后將改造后的基因轉化到產番茄紅素的大腸桿菌中,經過HPLC檢測發酵產物,如圖5所示,在含有soNSY-D219G基因的菌株中,檢測到了β-胡蘿卜素,這表明改造后的soNSY-D219G基因具備了番茄紅素β-環化功能。而剩余9個突變位點的發酵產物均只檢測到了番茄紅素,并未發現β-胡蘿卜素,這表明這9個突變體蛋白仍不具備環化番茄紅素的能力。在此基礎上,突變了LyLCYB的219位點,構建了pTac15K-LyLCYB-G219D質粒,在轉化分析后發現其失去了番茄紅素的環化功能,在發酵產物中僅檢測到了番茄紅素(圖5)。上述實驗結果表明,219位點是導致LyLCYB和SoNSY對番茄紅素環化功能差異的關鍵氨基酸位點。

圖5 基因QlyLCYB-G219D和QsoNSY-G219D番茄紅素β-環化活性分析結果

3 結論

本研究通過在E.coliBL21(DE3)中構建類胡蘿卜素的異源表達系統,利用嵌合體和定點突變的方式探究類胡蘿卜素合成酶LyLCYB和SoNSY中影響番茄紅素環化功能的氨基酸位點,并且將關鍵氨基酸位點的范圍鎖定到FH(209～279)肽段范圍內,為進一步探究兩個基因的差異位點將FH區域中LyLCYB和SoNSY的10個差異位點進行點突變,最終發現了含有突變體SoNSY-D219G的菌株具備了環化番茄紅素的能力,而含有突變體LyLCYB-G219D的菌株環化功能消失,這表明219位點是影響LyLCYB和SoNSY番茄紅素環化功能差異的關鍵位點。本研究為繼續探究LyLCYB和SoNSY紫黃質催化功能差異提供了理論基礎,同時也為LyLCYB和SoNSY酶作用機制的研究提供參考。