黔產鐵皮石斛不同部位混菌發酵米酒品質的比較

張琳,李秋月,邱樹毅,王春曉,韋朝陽

(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽,550025)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)在藥食同源中分類屬于名貴中藥材,被廣泛應用于各種滋補、營養的食品、保健品中,在我國已經有2 000多年的發展應用歷史。鐵皮石斛中富含多糖、聯芐衍生物、石斛生物堿、類黃酮和氨基酸類等多種活性成分,鐵皮石斛的功效作用有抗氧化活性、降血糖、抗腫瘤、調節機體免疫等[1-3],其藥用價值在藥食同源中極高,因此鐵皮石斛被廣泛應用于食品中。

鐵皮石斛的傳統藥用及食用部位為莖,且研究側重于莖方面,石斛莖采收時石斛花、葉、根通常會被忽視而做廢棄處理。據文獻報道鐵皮石斛經微生物發酵后多糖、黃酮、酚類等活性物質含量會增加[4],可增強其抗氧化、降血糖的活性[5]。越來越多的人研究報道鐵皮石斛在發酵酒中的應用。任紅運等[6]、史學琴等[7]、趙紅等[8]利用混菌發酵的方法,有利于鐵皮石斛的各種活性物質更好地溶出,使發酵酒的風味更加豐富,營養品質提升。將鐵皮石斛滲入黃酒發酵工藝中,得到的黃酒口感爽快,營養價值豐富[9]。隨著鐵皮石斛在創新產品深加工多樣性方面的不斷豐富發展,被人們忽視的鐵皮石斛葉、花和根的活性成分含量等各種研究和深加工利用也開始備受關注。譬如,鐵皮石斛花與人參果共同發酵得到清香爽口的人參果鐵皮石斛花復合果酒[10],鐵皮石斛葉與苦蕎發酵得到苦蕎鐵皮石斛葉復合發酵酒[11]。

近年來,基于鐵皮石斛莖豐富的活性物質,其在發酵酒中的應用較多,鐵皮石斛花和葉在發酵酒中的應用也有極少的研究報道,而根在發酵酒中的應用幾乎沒有。該文從鐵皮石斛根、莖、葉、花的活性成分在混菌發酵米酒的含量變化和理化指標及感官評價方面進行論述,研究4種石斛部位發酵米酒在釀酒酵母和異常威克漢姆酵母混合發酵后的品質比較,旨在擴展鐵皮石斛根、花、莖、葉資源更進一步地利用,促進鐵皮石斛葉、莖、花、根不同部位相關產品的深加工,提高鐵皮石斛的經濟附加值,提高鐵皮石斛根、莖、葉和花的綜合利用度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料:鐵皮石斛,貴州省貴定縣綠春農業發展有限公司;有機糯米,遼寧省大連市大連德禾鑫農產品加工有限公司。

菌種:釀酒酵母FBKL2.8022(Saccharomycescerevisiae,Sc),從貴州傳統塊狀小曲中分離篩選[12],貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室鑒定保藏,保藏編號CCTCC NO:M2019406;異常威克漢姆酵母FBKL2.8023(Wickerhamomycesanomalus,Wa),從貴州傳統塊狀小曲中分離篩選[13],貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室鑒定保藏,保藏編號CCTCC NO:M2019412。

試劑:α-淀粉酶(3 700 U/g)、糖化酶(≥10 萬U/g),北京索萊寶科技有限公司;葡萄糖標品,阿拉丁試劑(上海)有限公司;沒食子酸、蘆丁、福林酚、磺基水楊酸,上海源葉生物科技有限公司;2-辛醇標準品,上海麥克林生化科技有限公司;濃硫酸、濃鹽酸,重慶川東化工(集團)有限公司;氫氧化鈉、六水氯化鋁,四川西隴科學有限公司;苯酚,天津市永大化學試劑有限公司;無水乙醇,天津市富宇精細化工有限公司;亞硝酸鈉,天津市優譜化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-75SII立式蒸汽壓力滅菌鍋、SPX-250B生化培養箱,上海博訊實業有限公司醫療設備廠;GFL-230電熱鼓風干燥箱,天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司;PHS-3C精密pH計,上海日島科學儀器有限公司;NP-30S漩渦混合儀,常州恩培儀器制作有限公司;LC-LX-H185C臺式高速離心機,上海力辰邦西儀器科技有限公司;LT1002E電子天平,常熟市天量儀器有限責任公司;721紫外可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司;S-10生物傳感器分析儀,深圳市西爾曼科技有限公司;固相微萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美國Supelco公司;1260安捷倫高效液相色譜儀、7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀,安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 米酒發酵

采用Sc和Wa進行混合發酵,分別為混菌發酵鐵皮石斛根(Do-Ro),混菌發酵鐵皮石斛花(Do-Fl),混菌發酵鐵皮石斛莖(Do-St),混菌發酵鐵皮石斛葉(Do-Fo),未添加鐵皮石斛作為對照(BC)。

稱取50.0 g糯米加入250 mL蒸餾水浸泡過夜,瀝干水分,于121 ℃滅菌40 min,滅菌后待糯米冷卻至室溫,添加糖化酶0.56%、淀粉酶1.89%(添加量以糯米干重為基準)和75 mL無菌水,60 ℃水浴30 min。將Sc和Wa接種到冷卻至常溫的糯米中(接菌比例為Wa∶Sc=1∶10,接菌量為1×106cell/mL)。添加鐵皮石斛粉2.5 g,置于30 ℃恒溫條件下培養,每24 h稱重1次并記錄,當失重小于0.2 g/d即為發酵停止,發酵結束后檢測發酵液中的相關成分。

1.3.2 鐵皮石斛米酒發酵工藝流程

鐵皮石斛米酒發酵工藝流程如下:

鮮鐵皮石斛→挑選分類(根、莖、葉花)→烘干粉碎→擴大培養→活化→菌種→糯米浸泡→蒸糧→糖化→接菌→發酵→過濾→陳釀

1.3.3 理化指標

pH用pH計直接測定?？偹釁⒄誈B/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法進行測定。酒精度的測定,將發酵酒樣稀釋100倍,利用生物氧化酶膜電化學傳感器吸取25 μL進行待測酒樣的酒精濃度檢測。還原糖參照NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的測定 3,5-二硝基水楊酸比色法》。采用苯酚-硫酸法[14]測定石斛米酒總糖含量。

1.3.4 主要活性物質測定

多糖的測定,同1.3.3節總糖測定方法。黃酮的測定參照繆園欣等[15]測定黃酮的方法?？偡拥臏y定參照朱明明等[16]測定總酚的方法。樣品制備,鐵皮石斛多糖采用水提醇沉法提取并用Savage脫蛋白[17];黃酮和總酚的提取參照劉瑾等[18]、汪江波等[9]的提取方法。

1.3.5 米酒感官評價

感官評價:選擇10名專業人員,從石斛米酒的口感、色澤、香氣、組織狀態4個指標進行評定,滿分100分,感官評分結果取平均值,評價標準見表1。

表1 米酒感官評價

1.3.6 揮發性風味物質測定

發酵液中揮發性成分測定參考史學琴等[7]的方法,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法。質譜數據的定性分析通過比較保留指標和鑒定化合物的質譜進行驗證;以2-辛醇為內標,不考慮揮發性化合物的回收率和響應因子,對各種揮發性化合物進行定量分析。

1.3.7 數據處理

所有實驗設置3個平行,所得數據通過IBM SPSS Statistics 26.0進行單因素檢驗并分析差異顯著性,利用由Excel 2016、Origin 2018 64Bit、聯川生物云平臺等進行圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 理化指標分析

米酒在發酵中,酵母菌利用糖類物質轉化產生酒精、CO2等物質,依據CO2失重變化(失重<0.2 g/d)判定發酵終點。如圖1所示,采用Sc、Wa混合發酵鐵皮石斛4種不同部位的米酒,在發酵第6天失重已小于0.2 g/d,后期發酵狀態穩定,4種米酒均在第9天達到發酵終點;未添加鐵皮石斛的米酒則是在發酵第7天趨于平緩,在第10天達到發酵終點。Do-Fo米酒總失重為20.88 g,Do-Fl米酒為20.38 g,Do-St米酒為20.20 g,Do-Ro米酒為20.04 g,BC米酒為19.04 g,添加鐵皮石斛的米酒在發酵期間整體失重變化無顯著差異,石斛花、葉在發酵前期失重略高于石斛莖、根,但未添加鐵皮石斛的米酒顯著低于其他。因此,添加鐵皮石斛不同部位可有效促進米酒的發酵,縮短發酵周期。

圖1 米酒發酵過程中CO2失重變化

米酒發酵后的基本理化指標如表2所示,米酒因鐵皮石斛不同部位的化學成分差異而存在一定的差異。鐵皮石斛花、葉、莖、根發酵米酒的酒精含量無顯著差異,均顯著低于BC米酒,鐵皮石斛不同部位對酒精發酵均有抑制作用。添加鐵皮石斛后米酒中還原糖、總糖含量顯著增加,Do-Fo和Do-St米酒均顯著高于Do-Fl和Do-Ro。據文獻報道鐵皮石斛莖多糖含量(34.61%)>葉(23.51%)>花(13.47%)[19],石斛根的多糖約是莖多糖的1/5[20],微生物發酵有利于石斛中多糖釋放并降解為小分子糖類物質,因此,發酵中添加葉和莖的米酒糖含量較高,初步推測添加鐵皮石斛后米酒中增加的一部分糖可能來自于原料或酵母對原料的轉化。Do-Fl、Do-Fo、Do-St、Do-Ro、BC米酒的pH依次減小,總酸含量則呈現相反的變化,5種米酒pH和總酸變化相對應,pH越低,總酸含量越高,反之越低。

表2 米酒的理化指標

2.2 主要活性物質分析

鐵皮石斛中含有多糖、石斛堿、黃酮、酚類等多種功能活性物質,不同部位多糖、黃酮類、酚類等有顯著差異[21]。因其不同部位活性物質差異,鐵皮石斛花、葉、莖、根發酵的米酒與對照組米酒,其活性物質含量有顯著差異。如表3所示,添加鐵皮石斛后發酵米酒中活性物質顯著增加,鐵皮石斛不同部位其活性物質含量也有顯著差異,因此鐵皮石斛花、葉、莖、根發酵的米酒活性物質含量也存在差異。米酒中總酚含量為Do-Fl>Do-Fo>Do-St>Do-Ro>BC,而鐵皮石斛不同部位總酚含量為花>葉>根>莖,這與黃彪等[22]研究幾乎一致,因此Do-Fl米酒總酚含量最高為721.02 mg/L。本研究中鐵皮石斛黃酮含量為花>葉>根>莖,與耿文慧等[23]的研究中鐵皮石斛黃酮含量為花>葉>莖的結果相似,值得注意的是在發酵米酒中黃酮含量為Do-Fo>Do-Fl>Do-Ro>Do-St>BC,添加鐵皮石斛葉發酵的米酒黃酮含量最高。真菌會產生可降解植物細胞壁的一系列酶[24-25],因此Do-Fo米酒中黃酮含量最高,這可能與酵母菌內在酶系降解鐵皮石斛葉細胞壁從而釋放其黃酮等活性成分有關。鐵皮石斛多糖含量為莖>葉>花>根,這與張志信等[26]、尚喜雨[27]研究結果一致。鐵皮石斛多糖為葡甘露聚糖,其單糖組成主要是葡萄糖、甘露糖[28-30]。發酵米酒中多糖含量為Do-St、Do-Fo>Do-Fl>Do-Ro>BC,Do-Fo和Do-St中多糖含量顯著高于Do-Fl和Do-Ro,這與前文Do-Fo和Do-St米酒中還原糖、總糖結果一致。有趣的是Do-Fo和Do-St米酒中多糖含量幾乎一致,這可能是因為釀酒酵母發酵能有效降解發酵所得胞外多糖,將大分子多糖降解成小分子多糖[31],把機體不易吸收的大分子物質進行降解并用于新陳代謝[32]。因此,推測酵母菌豐富的酶系能夠更好地促進鐵皮石斛葉中多糖溶出。

表3 米酒及鐵皮石斛的活性物質含量

2.3 感官評價分析

對發酵后米酒的色、香、味、形進行感官評價,評分結果如表4所示。5種米酒中Do-Fl米酒的感官評分最高,其口感和氣味的感官評分也是最高的。

表4 米酒感官評價分析結果

2.4 揮發性風味物質分析

在5種米酒中共檢測到47種揮發性物質,其中醇類物質共17種,酯類物質16種,烷烴類物質共4種,2種醛類,4種酸類,1種烯烴,1種酮,1種揮發性酚類,1種有機化合物,具體檢出的揮發性風味物質見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033542)。鐵皮石斛根、花、莖、葉4個部位發酵的米酒與對照組米酒,揮發性風味物質的組成有所不同,米酒中揮發性風味物質的含量、豐度及百分比組成分如附表1和圖2所示。Do-Ro、Do-Fl、Do-St、Do-Fo、BC米酒中揮發性風味物質的含量分別為60.00、61.21、51.17、64.71、100.01 mg/L;添加鐵皮石斛后米酒中揮發性風味物質含量顯著降低,其中主要降低的是醇類;在鐵皮石斛不同部位發酵的米酒中,根發酵的米酒揮發性風味物質含量最高,花發酵的米酒揮發性成分最豐富,且米酒的揮發性風味物質以醇類和酯類物質為主。

a-米酒中揮發性風味物質聚類熱圖;b-揮發性風味物質個數3D柱狀堆積圖;c-揮發性風味物質百分比含量3D柱狀圖

醇類物質是酒中重要的呈香物質,適量的揮發醇可以增加酒體的醇香,對酒的香氣貢獻作用大[33]。5種米酒中含量較多的高級醇主要有異丁醇、正丁醇、2,3-丁二醇、苯乙醇,適量的高級醇可使酒體更加協調,苯乙醇可賦予米酒更豐富的花果香味;2,3-丁二醇會產生類似黃油、奶油的香味,是為數不多的可呈香的多元醇之一[34];乙醇對米酒的呈香、發酵酒精具有積極作用。相較于BC米酒,添加鐵皮石斛發酵的米酒中醇類物質含量顯著減少,主要是乙醇、異戊醇的減少;相反苯乙醇、異丁醇含量增加;Do-Fl米酒中醇類物質含量最多,種類也較為豐富,一縮二丙二醇、3-己烯-1-醇、丙醇是鐵皮石斛花發酵的米酒中特有的3種醇類物質;Do-St米酒中醇類物質含量雖最少,但其種類較多,米酒中獨有的2-庚醇具有花果香,芳樟醇(閾值為6 μg/L)具有花果香、草木香[35];1-戊醇是Do-Fo米酒中檢出的一種特有的醇類物質。

酯類主要為酒提供水果、鮮花、甜味和牛奶風味[36],發酵米酒中呈酯香的酯類主要是辛酸乙酯(閾值5 μg/L,主要參考賈麗艷等[37]的研究,下同)、月桂酸乙酯(閾值400 μg/L)、乙酸乙酯(閾值12.27 mg/L)[38]。相較于BC,添加鐵皮石斛后,Do-Fl和Do-St米酒中酯類物質種類減少,大部分酯類含量也減少;相反Do-Ro和Do-Fo米酒中酯類含量顯著增加,Do-Ro中最主要的正己酸乙酯增加了約4倍。鐵皮石斛根、花、莖發酵的米酒中均檢出的乙酸異戊酯呈現果香味;米酒均含有的辛酸乙酯、癸酸乙酯(閾值為200 μg/L)具有花果香味,在Do-Ro米酒中含量最高,此外,辛酸乙酯還具有白蘭地的酒香味。Do-Ro米酒中酯類物質含量最高為10.58 mg/L,在米酒中的百分比為16.35%,也是占比最高的。Do-Ro米酒中差異性揮發風味物質主要是酯類物質,包括癸酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、正己酸乙酯(閾值14 μg/L)、3-苯丙酸乙酯等,這些酯類物質大多數具有酯香,可豐富米酒的香氣;Do-Fo、BC米酒中均有12酯類物質,是種類較為豐富的米酒。

5種米酒中主要的揮發性風味物質主要是醇類和酯類,除此以外米酒中還檢出了少量的揮發性烷烴類、醛類、酸類等風味物質,這些物質在米酒中含量雖少,但是對米酒的香氣品質也存在影響。Do-Ro、Do-Fl、Do-St、Do-Fo、BC米酒中含量較少的揮發性酸類、醛類等物質的百分比含量分別為0.40%、1.73%、1.49%、1.44%、1.03%。發酵酒中具有較高香氣活性的苯甲醛可賦予米酒果仁香[39];Do-Fl米酒中的3-羥基-2-丁酮呈奶香味,萘具有焦香,米酒中特有的茶香螺烷[40]來自于鐵皮石斛花。

綜上所述,鐵皮石斛花、莖、葉、根4個部位發酵的米酒因為原料或者原料與酵母菌之間的相互作用使得4種鐵皮石斛米酒揮發性風味存在一定的差異。其中Do-Fl米酒揮發性風味物質種類最豐富,含量也較高僅次于Do-Ro米酒,而在前文感官評價分析中Do-Fl米酒得分最高且其在氣味方面的得分也是最高的。因此,鐵皮石斛花發酵的米酒相較于其他部位發酵的米酒具有更好的風味品質。

3 結論

本論文采用釀酒酵母和非釀酒酵母兩株酵母菌混合發酵鐵皮石斛米酒,比較鐵皮石斛花、莖、葉、根發酵米酒的理化指標、活性物質、揮發性風味物質等,分析鐵皮石斛不同部位發酵米酒的品質差異。結果表明,添加鐵皮石斛后,米酒發酵周期縮短,在一定程度上抑制了酒精發酵作用。Do-Fo、Do-St米酒中還原糖、總糖、多糖含量較高,這可能是因為鐵皮石斛莖和葉中多糖含量高于其他部位;Do-Fl、Do-Fo米酒中黃酮、總酚含量顯著高于其他部位發酵的米酒,其中Do-Fl米酒總酚含量最高,Do-Fo米酒黃酮含量最高;Do-Ro、Do-Fl、Do-St、Do-Fo米酒中揮發性風味成分分別有25、29、27、26種,Do-Ro米酒種揮發性風味物質含量最高但種類最少,Do-Fl米酒中揮發性風味物質種類最豐富,含量也較高。綜上所述,鐵皮石斛花、莖、葉、根不同部位發酵的米酒在理化指標、活性物質、揮發性成分等品質存在差異,其中鐵皮石斛花發酵的米酒品質較佳。