貴州主栽獼猴桃采后低溫貯藏病害真菌多樣性研究

李辣梅,王瑞*,余江平,雷霽卿,馬超,李江闊,吳素芳,陸祥柳

1(貴陽學院 食品與制藥工程學院,貴州 貴陽,550000)2(貴陽市果樹技術推廣站,貴州 貴陽,550000) 3(國家農產品保鮮工程技術研究中心,天津,300384)4(修文縣農業農村局,貴州 修文,550081)

獼猴桃因風味獨特、富含維生素C并含有膳食纖維和其他有利于健康的化合物而深受消費者喜愛[1]。如今,我國獼猴桃栽培品種有59種,主要有“中華獼猴桃”“美味獼猴桃”“軟棗獼猴桃”“毛花獼猴桃”等品種[2]。截至2021年,貴州省獼猴桃種植面積全國第三,產量全國第五,已躋身全國獼猴桃五大優勢產區,形成了以貴陽、六盤水為重點的產業集中發展區,主要栽培“貴長”“紅陽”2個鮮食品種[3-4]。然而,由于微生物潛伏期較長,可在采收前采收、以及采后貯運期間侵染果實,導致獼猴桃果實發生腐爛[5-7],有研究表明,由真菌引起的獼猴桃侵染病害發病率高達30%[8]。因此,解決由真菌病原體所引起的侵染病害,是獼猴桃產業迫在眉睫的問題。

國內外研究者利用傳統的組織培養方法,對新西蘭、智利、中國、韓國地區的“Hayward”“Hort16A”“秦美”“紅陽”等獼猴桃采后侵染病害進行分析,發現主要致病菌有灰霉菌(Botrytiscinerea)、間座殼菌屬(Diaporthespp.)、鏈格孢菌(Alternariaalternata)、鐮刀菌(Fusariumacuminatum)、擬莖點霉屬(Phomopsissp.)、葡萄座腔菌屬(Botryosphaeriasp.)和假尾孢菌(Pseudocercosporaactinidiae)等[9-16]。有報道提出采用組培法分離致病菌,但存在操作復雜、菌群信息不足、具有一定的局限性等問題,難以對群落結構及多樣性進行分析[17]。高通量測序作為一種分析微生物組結構和功能的新手段,可以從宏觀角度揭示真菌群落結構的動態變化,已應用于獼猴桃、草莓、楊梅、蘋果、甜櫻桃等水果領域[17-20]。石浩等[17]采用高通量測序技術研究了湖南省5個地區的“紅陽”紅心獼猴桃軟腐果實門和屬的優勢微生物。其中,優勢門有子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota),優勢菌有間座殼屬(Diaporthe)、葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)。劉娜等[21]采用高通量測序技術對貯后不同發病程度的“貴長”獼猴桃軟腐病致病部位果肉進行真菌多樣性分析。結果表明,“貴長”獼猴桃腐爛后的主要真菌有座囊菌綱(Dothideomycetes)、葡萄座腔屬和間座殼科(Diaporthaceae)。有研究表明,由于地理、氣候差異和品種不同,不同產區同種水果采后侵染病害的致病真菌有所差異[5]。

目前,未見貴州省不同產區“貴長”“紅陽”品種獼猴桃采后貯藏腐爛部位病害微生物群落結構多樣性相關報道。本研究選取貴州省6個縣來自10個果園的“貴長”“紅陽”獼猴桃樣品為試驗材料,采用高通量測序技術對采后貯藏果實腐爛部位進行分析,探究貴州省獼猴桃主產區“貴長”“紅陽”果實采后貯藏過程中的真菌群落多樣性,并結合花期、幼果期、采收期降雨量,對貴州省獼猴桃采后貯藏侵染病害發生情況進行分析。為獼猴桃產業采后病害防控及貯運提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分別于2021年8月23、24日,10月2、3日,采集貴州省6個縣10個果園的“紅陽”“貴長”獼猴桃樣品。其中,水城縣樣品分別命名為紅陽1(HY1)、紅陽2(HY2)、紅陽3(HY3);六枝縣樣品命名為紅陽4(HY4);納雍縣樣品命名為紅陽5(HY5);修文縣樣品分別命名為貴長1(GC1)、貴長2(GC2);息烽縣樣品分別命名貴長3(GC3)、貴長4(GC4);松桃縣樣品命名為貴長5(GC5)。果實采后均運至貴陽學院,使用自發氣調袋包裝,經預冷后置于1～2 ℃條件下貯藏120 d。選擇自然發病、軟化獼猴桃果實作為實驗樣品,將樣品放入無菌塑料袋中,于貴州省農產品產地初加工關鍵技術研發與應用科技創新基地微生物實驗室進行真菌群落分析。

1.2 儀器與設備

Centrifuge 5418臺式高速離心機,Eppendorf;580BR10905 PCR儀,Bio-rad;QIAxtractor SN 002358,QIAGEN;HE-120電泳儀、2500凝膠成像儀,Tanon;2100 Bioanalyzert,Aglient。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本采集與處理

從無菌袋中取出獼猴桃樣品,75%(體積分數)酒精進行表面擦拭,無菌水沖洗3次,滅菌棉球表面擦干。用無菌陶瓷刀取皮下腐爛的部位果肉,液氮凍樣,置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 DNA提取、擴增及ITS1測序

采用MagPure Soil DNA LQ Kit試劑盒Magen D6 356-02提取獼猴桃樣品中總DNA,然后用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000檢測DNA的濃度。以樣本中微生物總DNA為模板,采用通用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)引物對條形碼進行PCR擴增。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s;26個循環,最終72 ℃延伸5 min。重復進行二輪擴增,磁珠純化,取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,然后取1 μL純化過的產物使用Qubit進行濃度檢測。

1.3.3 Illumina NovaSeq 6000測序處理分析

Illumina NovaSeq 6000測序生成原始雙端序列,使用Cutadapt軟件,剪切掉原始測序序列中的引物序列。使用DADA2方法,將上一步序列使用Qiime2默認參數進行質量過濾,降噪,拼接及去嵌合體等質控分析,得到特征序列——擴增序列變體(amplicon sequence variant, ASV)。對各個樣本中分類到該ASV的tags數進行統計,可以獲得各個ASV在每個樣本中的豐度情況。

1.4 數據處理

利用Mothur軟件計算樣本的α多樣性,包括ACE指數、Chao 1指數、Coverage、Shannon指數和Simpson指數,以表征真菌群落的豐富度和多樣性。利用QIIME軟件進行主成分分析(principal component analysis, PCA),構建系統進化樹。通過皮爾森相關系數分析建立降雨量與獼猴桃果實低溫貯藏致病真菌豐度相關性。

2 結果與分析

2.1 測序結果和α多樣性分析

通過Illumina NovaSeq 6000高通量測序測定10個不同果園的獼猴桃樣品,圖1是獼猴桃貯藏期侵染病害的腐爛果實及果肉腐爛圖片。測序結果為:總的序列數據量在78 011～81 993條,優化序列數據量分布在15 459～61 763條,最終用于分析的序列數據量分布在15 459～60 745條,各樣本ASV的數目分布在9～160。采用ANOVA算法進行差異統計,差異ASV為89個,差異屬為30個,差異門為4個。每個樣品的ASV分類信息見表1。ASV數目最低的是樣品HY1、HY5、GC1,ASV平均數目為15～19;ASV最高的樣品是GC3,ASV數目為130～160。

表1 樣品信息

a-“貴長”獼猴桃;b-“紅陽”獼猴桃

圖2是以89個差異ASV作為真菌代表序列,運用ANOVA算法建立的真菌系統發育樹。該圖可分為3層,內層數據在門的水平上對各樣品菌種進行差異區分、分布,中間層和外層顏色區域分別代表“貴長”“紅陽”樣本被檢測出的菌種種類,深顏色部分代表該樣品對應的菌種被檢測出,反之,該菌種未被檢測出。由圖2可知,內層圖中所包含的門類有子囊菌門、擔子菌門和其他門類,分別含有66、7、16個微生物菌群。由中間層和外層可知,“貴長”獼猴桃腐爛部位檢出真菌有間座殼菌屬(Diaporthesp.)、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、Capnodialessp.、格孢菌科(Pleosporaceae sp.)、小新殼梭孢(Neofusicoccummangiferae)、卡羅萊納葡萄孢(Botrytiscaroliniana)、維多利亞隱球酵母(Cryptococcusvictoriae)等。同樣,“紅陽”獼猴桃腐爛部位檢出真菌有間座殼菌屬、Nectriaceaesp.、鐮刀菌屬、Capnodialessp.、格孢菌科、卡羅萊納葡萄孢、維多利亞隱球酵母等。

圖2 真菌系統發育樹

由圖2可知,與“紅陽”獼猴桃(外層)相比,“貴長”獼猴桃(中間層)菌群種類較為豐富,所占的菌種數量相比較多。尤其是GC3果園的真菌菌群種類最多,而對于“紅陽”品種,HY1和HY5所占菌群種類最少。綜上,不同果園的獼猴桃果實中的微生物多樣性存在差異性。

α多樣性分析指數分析包括ACE指數、Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數和Coverage。表2通過上述指數分析了10個獼猴桃果實樣品中真菌群落的豐富度和多樣性。其中Coverage值越高,檢測到樣品中序列的概率就越大,代表了樣品測序結果的真實性。ACE和Chao1指數用于評估真菌群落的豐富度。Shannon指數和Simpson指數用于表征真菌群落多樣性。所有樣品的Coverage均大于0.999,說明大部分低豐度ASV被檢測出。從ACE和Chao1指數分析,真菌群落豐度由高到低排序為GC3>GC5>GC2>HY3>GC4>HY2>YH5>GC1>HY4>HY1。其中,GC3、HY3分別為“貴長”“紅陽”獼猴桃中真菌群落豐富最高的獼猴桃。從真菌群落的多樣性方面分析,“貴長”獼猴桃中GC3檢測結果與其他組差異較大。除GC1之外,其他地區的“貴長”獼猴桃真菌群落豐度均高于“紅陽”獼猴桃。Shannon指數和Simpson指數最高和最低的樣品分別為GC3、GC5,反映出GC3樣品真菌多樣性較高,GC5樣品真菌多樣性低。這2個樣品的ASV數目在所有樣品中分別位居最高和最低。這說明Shannon指數和Simpson指數的高低與ASV數目呈正相關。各果園獼猴桃樣品的真菌群落多樣性由高到低排序為GC3>HY2>GC2>HY4>GC4>HY5>GC5>HY3>GC1>HY1,說明“貴長”獼猴桃果實腐爛部位真菌多樣性大于“紅陽”獼猴桃。推測原因為“紅陽”獼猴桃果實在種植過程中套袋所致?？傮w看來,“貴長”獼猴桃組間的豐度和多樣性大于“紅陽”獼猴桃。然而,大多數果園“貴長”“紅陽”獼猴桃的Shannon指數較低,Simpson指數較高,樣品真菌ASV多樣性低。推測原因可能是由于獼猴桃果實處于腐爛狀態,果實表面的微生物群已破壞,致病菌通過競爭作用占優勢,而呈現較低的ASV。

表2 獼猴桃貯藏期間真菌群落多樣性

2.2 不同品種的獼猴桃真菌群落結構分析

圖3是門水平的真菌群落結構分析。檢測出的門類為子囊菌門、擔子菌門、接合菌門(Zygomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和其他門類(others)。其中,子囊菌門和擔子菌門在“貴長”“紅陽”獼猴桃所有樣品中均占優勢,平均相對豐度分別為88.42%、1.08%。子囊菌門在所有樣品中相對豐度最高,并且在“貴長”獼猴桃中的平均相對豐度(94.09%)大于“紅陽”獼猴桃(82.76%)。這說明“貴長”“紅陽”的主要優勢菌群相同,但相對豐度存在差異。而接合菌門、球囊菌門、壺菌門僅在“貴長”GC3果園中的被檢測到,這3種菌門在“貴長”獼猴桃中的平均相對豐度低于0.04%,相對豐度較低,不具有代表性。國內外已見報道獼猴桃果實致病菌均屬于子囊菌門。綜上可知,子囊菌門在獼猴桃侵染病害中起重要作用。本研究采集貯藏樣品腐爛部位檢測發現,子囊菌門在真菌群落結構中相對豐度較大,占有絕對主導,高達74.16%。說明貴州“貴長”“紅陽”獼猴桃果實采后貯藏腐爛部位真菌也以子囊菌門為主。

圖3 獼猴桃樣品門水平柱狀圖

圖4是在屬的水平上,選取ASV豐度值位于前15個屬繪制柱狀圖。其中相對豐度>1%的有11個屬,包括葡萄孢屬(Botrytis)(15.61%～96.07%)、鐮刀菌屬(Fusarium)(18.62%～72.28%)、新殼梭孢屬(Neofusicoccum)(0%～51.39%)、間座殼菌屬(Diaporthe)(21.34%～33.00%)、擬莖點霉屬(Phomopsis)(0.01%～8.90%)、黑團孢屬(Periconia)(0%～7.53%)、隱球菌屬(Cryptococcus)(0%～2.36%)、假尾孢屬(Pseudocercospora)(0%～3.57%)、木霉菌屬(Trichoderma)(0%～1.44%)、Setophaeosphaeria(0%～1.29%)、擔子菌酵母屬(Naganishia)(0%～1.1%)。對于“貴長”獼猴桃,GC1、GC3果園主要優勢屬為葡萄孢屬(68.57%、35.90%)和鐮刀菌屬(24.97%、18.62%);GC2的主要優勢屬為鐮刀菌屬(47.20%)、間座殼菌屬(9.78%)和擬莖點霉屬(9.04%);GC4和GC5主要優勢屬為新殼梭孢屬(57.77%、51.75%)和間座殼菌屬(25.92%、34.09%)。這說明“貴長”獼猴桃采后貯藏腐爛部位主要優勢菌為葡萄孢屬、鐮刀菌屬、新殼梭孢屬、間座殼菌屬和擬莖點霉屬。與“貴長”獼猴桃果實不同,“紅陽”獼猴桃的真菌群落多樣性較低。其中,HY1的優勢屬為葡萄孢屬(96.07%)。HY2的優勢屬包括鐮刀菌屬(28.53%)、葡萄孢屬(15.6%)、擬莖點霉屬(14.87%)。HY3優勢屬包括葡萄孢屬(63.23%)、間座殼菌屬(26.04%)。HY4的優勢屬包括假尾孢屬(39.64%)、間座殼菌屬(26.04%)。HY5優勢屬包括鐮刀菌屬(72.28%)、間座殼菌屬(21.34%)。說明“紅陽”獼猴桃采后貯藏腐爛部位優勢屬以葡萄孢屬、鐮刀菌屬、間座殼菌屬、假尾孢屬為主。由此可見,葡萄孢屬、鐮刀菌屬、間座殼菌屬、新殼梭孢屬、擬莖點霉屬和假尾孢屬是貴州不同果園“貴長”“紅陽”獼猴桃采后貯藏腐爛部位真菌相對豐度較高的屬。其中HY3、HY2、GC3三個樣品的主要病害是鐮刀菌屬、間座殼屬;HY5、HY1、GC4、GC1 4個樣品的主要病害是葡萄孢屬;GC5、GC2兩個樣品的主要病害是新殼梭孢屬;HY4主要的致病菌為鐮刀菌屬、假尾孢屬。綜上可知,“貴長”“紅陽”獼猴桃不同果園之間采后貯藏真菌群落多樣性和結構存在差異。其中,葡萄孢屬、鐮刀菌屬、間座殼屬是10個樣品的優勢屬。

圖4 獼猴桃樣品屬水平柱狀圖

2.3 β多樣性分析

為了進一步探討不同果園獼猴桃采后貯藏真菌群落結構的相似性和差異關系。以門和屬水平的真菌菌群多樣性數據為基礎,通過PCA比較個體與群體間的差異(圖5)。樣本與樣本之間的距離代表群落結構的差異大小。2個品種之間的距離較近,說明貯藏期間的“貴長”“紅陽”獼猴桃病果的真菌群落結構差異小,多樣性較為相似,這與圖3門水平真菌群落分布研究結果一致。通過比較可見,“貴長”獼猴桃樣品較為分散,說明“貴長”果園之間真菌群落結構存在差異。而“紅陽”獼猴桃樣品距離較近,說明“紅陽”果園之間真菌群落多樣性差異較小。這與圖4屬水平真菌群落分布研究結果一致。說明不同果園紅陽獼猴桃之間真菌群落較為穩定,差異小。

圖5 不同地區獼猴桃真菌多樣性的主成分分析

為闡釋貴州省6縣10個果園獼猴桃病果中真菌群落結構的差異性,本研究根據貴州省氣象局數據[29]調查了2021年“貴長”“紅陽”果實樣品的花期幼果期、采收期降雨量。圖6為不同地區降雨量與獼猴桃侵染病害子囊菌門豐度柱狀圖。如圖6所示,“貴長”3個種植縣各果園所在地花期幼果期(5～7月)、采收期(9～10月)的降雨量與平均降雨量有所差異。其中GC1、GC2果園所在地降雨量最大,GC3、GC4果園在采收期的降雨量最低。結合圖3、圖4可知,GC1、GC2果園對應的子囊菌門豐度與降雨量呈相同趨勢,即“貴長”獼猴桃GC1、GC2果園所在縣降雨量大,其對應的子囊菌門相對豐度高(96.95%,97.15%)。GC3果園子囊菌門相對豐度(89.65%)低于GC1、GC2果園,GC4果園子囊菌門相對豐度(97.20%)與GC1、GC2果園相近。經實地調研發現,GC3為3年初掛果新果園,這可能是由于新果園病害少、植保措施使用頻次較低,其生物多樣性高于GC4果園?！凹t陽”3個獼猴桃種植縣花期幼果期(3～5月)、采收期(8～9月)各果園所在地的平均降雨量與“貴長”具有相同趨勢,“紅陽”品種在采收期HY1果園降雨量較多,其子囊菌門相對豐度高于其他果園。同時,本研究針對花期幼果期、采收期平均降雨量與獼猴桃侵染病害進行相關性分析。如表3所示,皮爾森相關系數為0.628,這說明降雨量與子囊菌門相對豐度有一定相關性,這與我們的分析結果一致?！百F長”獼猴桃種植縣在花期幼果期、采收期的降雨量均大于“紅陽”獼猴桃。其對應的"貴長"獼猴桃病果子囊菌門的平均相對豐度值高于“紅陽”獼猴桃。綜上所述,我們推測獼猴桃病果群落差異性可能與降雨量有關,降雨量過大時,有助于加速病原菌增值、擴繁,加大獼猴桃果實致病菌的侵染幾率,導致真菌多樣性降低,從而造成果實腐爛。

表3 降雨量與獼猴桃侵染病害子囊菌門相對豐度相關性分析

圖6 不同地區降雨量與獼猴桃侵染病害子囊菌門豐度

3 結論與討論

本文研究了貴州省6個縣10個果園的“貴長”“紅陽”獼猴桃低溫冷藏腐爛部位真菌結構多樣性及分布情況。結果表明,10個樣品檢測出的門類為子囊菌門、擔子菌門、接合菌門、球囊菌門、壺菌門、其他門類。其中,子囊菌門為優勢菌門。在屬的水平上,相對豐度>1%的屬類有葡萄孢屬、鐮刀菌屬、新殼梭孢屬、間座殼屬、擬莖點霉屬、隱球菌屬、假尾孢屬、木霉菌屬等11個屬。其中,葡萄孢屬、鐮刀菌屬、間座殼菌屬在所有果園樣品中均有分布,真菌群落相對豐度較高,為貴州“貴長”、“紅陽”獼猴桃真菌侵染病害主要優勢屬。通過真菌菌落PCA,發現本研究所采集“貴長”和“紅陽”各樣品間致病菌豐度雖存在差異,但真菌群落結構相差不大,在品種分布組間差異不明顯,表明貴州獼猴桃采后貯藏病果中真菌群落結構相似。

前人分析我國湖南省“紅陽”、貴州省“貴長”獼猴桃采后優勢微生物為間座殼菌屬、葡萄座腔菌科、座囊菌綱等[17,21],這與本文的高通量測序結果不完全一致,致病真菌差異可能與產地有關。通過相關性分析發現,“貴長”獼猴桃種植縣的降雨量均大于“紅陽”獼猴桃,其病果子囊菌門的平均相對豐度值也高于“紅陽”獼猴桃。降雨量過大時,會導致采后獼猴桃真菌多樣性降低。李黎等[30]研究發現獼猴桃致病菌在早春花期時侵染花蕾,隨后侵染幼果并釋放孢子,隨著風雨的傳播,進一步侵染果實導致腐爛。而獼猴桃果實在采收期易受降雨影響,是真菌病害的發病高峰期[31]。獼猴桃采后侵染病害不僅與花期、幼果期、采收期降雨量有關,也是我國獼猴桃種植端和運輸過程中長期存在的問題。因此,為解決獼猴桃侵染病害問題,可以在種植端適量使用合理的殺菌劑或套袋處理抑制優勢致病真菌的菌絲生長、孢子萌發等,減少貯藏期間的致病優勢菌生長,保持獼猴桃果實表面的真菌多樣性,減少病害侵入,從而減少其在種植端、運輸端等方面的損失。同時,對具有潛在危險性的致病真菌重點防控,并結合真菌代謝組學、獼猴桃果實代謝組學、現代保鮮技術等手段和方法,對獼猴桃果實在貯藏過程中的生理特性進行分析研究。探尋獼猴桃在貯藏過程的抗性機理,提高果實防御能力。

本研究采用高通量測序技術,探討了貴州省6個縣10個果園的“貴長”“紅陽”獼猴桃采后貯藏腐爛部位的真菌群落結構多樣性差異,發現“貴長”獼猴桃果實貯藏腐爛部位真菌多樣性和豐度較“紅陽”豐富。推測原因為“紅陽”獼猴桃果實在種植過程中套袋所致。兩個品種腐爛部位真菌在門水平上,優勢門為子囊菌門?！百F長”“紅陽”獼猴桃采后貯藏致腐真菌主要優勢屬為葡萄孢屬、鐮刀菌屬、間座殼菌屬。通過PCA發現,貴州省的“貴長”“紅陽”品種采后冷藏腐爛部位的真菌群落較為相似。對比采集樣品所在地的氣象條件,推測貴州獼猴桃真菌多樣性與降雨量有關,降雨量與獼猴桃果實多樣性成反比,與獼猴桃果實致病菌的相對豐度成正比,當降雨量較大時,會提高果實貯藏侵染病害發生幾率。為貴州“貴長”“紅陽”獼猴桃侵染病害的致病真菌防控新方法研究提供理論依據。