氯化鈣處理對發芽綠豆營養品質和抗氧化能力的影響

靳曉琳,賈易天,張小梅,回傳胤,田小雨,侯銀臣,張一鳴

1(河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院,河南 鄭州,450046) 2(鄭州工程技術學院 化工食品學院,河南 鄭州,450044)

綠豆又名植豆,在我國有悠久的種植歷史,可藥食兼用,富含蛋白質、碳水化合物和膳食纖維[1]。綠豆芽菜是一種傳統的芽菜食品,因其口感脆嫩而深受人們喜愛,綠豆在發芽過程中為維持生長需要,高分子蛋白、碳水化合物會在自身酶的作用下開始降解,形成小分子的生理活性物質,因而與綠豆相比,綠豆芽菜更易于被人體消化吸收。發芽豆類還含有多種抗氧化成分,可降低人體血糖和血壓、軟化血管、增強肌體免疫力,還能有效地將細胞中泄漏出來的多余活性氧清除掉,從而保護細胞和組織免遭氧化傷害,具有抗癌和抗衰老的功效[2]。

Ca2+是植物生長和發育過程中的重要調控者,尤其是調控植物生理代謝及加速發芽過程中的生化反應[3],Ca2+可激活機體內多種酶、提高淀粉酶活性,增強質膜透性,強化種子活力,在種子萌發過程中起重要作用[4-5]。適宜濃度的Ca2+能促進芽菜生長,縮短芽菜生產周期,提高營養品質,有研究表明,鈣能顯著促進青蒜苗生成可溶性糖、維生素C以及大蒜素[6]。陳士林等[7-8]研究發現鈣能顯著提高玉米、棉花種子的發芽勢,促進胚芽伸長,此外,外源Ca2+處理導致芽菜中的酚類物質及其抗氧化活性增強[9-10]。目前,外源鈣已經被用于農產品保鮮,在果蔬生長季節和采后階段及時地補鈣,可提高園藝產品的保質期和營養品質。然而,有關鈣對綠豆芽菜營養品質和抗氧化能力的影響則很少受到關注。

本研究使用不同濃度的鈣離子處理綠豆芽菜,就豆類在發芽過程中主要營養成分和抗氧化能力的變化規律進行研究,探索最適宜的發芽時間和施鈣濃度,為綠豆芽的工業化生產和豆類的深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆種子:豫綠2號,購于河南省鄭州市秋樂種業,于-20 ℃貯存備用。DPPH、2,4,6-三吡啶基三嗪[2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine,TPTZ]、抗壞血酸、兒茶素,美國Sigma公司;牛血清白蛋白、福林-酚試劑、矢車菊素-3-葡萄苷,北京索萊寶科技有限公司;甲醇(色譜純),天津市康科德科技有限公司;鹽酸、硫酸、乙醇、草酸、硫酸亞鐵、碳酸鈉等(均為分析純),國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilgent 1200高效液相色譜儀,美國安捷倫公司;PGX-150智能培養箱,寧波海曙塞福實驗儀器廠;康麗A370豆芽機,佛山市順德區嘉壕實業有限公司;PYX-DHS-BS型隔水電熱恒溫培養箱,上海躍進醫療器械廠;818型pH計,美國Orion公司;Multiskan FC型酶標儀,上海賽默飛世爾儀器有限公司;UV-2802型紫外-可見分光光度計,上海安亭科學儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 氯化鈣濃度處理

設置3個濃度梯度的CaCl2溶液,分別為0.5、2、5 mmol/L,以蒸餾水作為對照(CK),共4個處理。稱取40 g籽粒飽滿的綠豆種子,使用1.0%(體積分數)的次氯酸鈉溶液浸泡15 min后,使用蒸餾水中漂洗至pH中性,在恒溫培養箱中30 ℃浸泡4 h,然后放置到發芽機中30 ℃黑暗培養4 d。每隔12 h更換噴淋溶液,發芽機每1 h噴淋一次培養液,每次2 min。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 芽長和呼吸速率測定

隨機選取20株綠豆芽菜,用游標卡尺測定其芽長。

參照李海霞等[11]的方法,利用改良的小籃子法測定綠豆芽菜的呼吸速率,呼吸速率表示為mg CO2/(g·h)。

1.3.2.2 可溶性蛋白和游離氨基酸測定

分別采用考馬斯G-250染色法[12]和茚三酮顯色法[13]測定。

1.3.2.3 可溶性糖和總糖測定

總糖和可溶性糖參照張述偉等[14]的方法并稍作修改,總糖的提取:稱取0.5 g綠豆芽菜,加入10 mL 6 mol/L HCl和15 mL蒸餾水,沸水浴中加熱2 h后定容至25 mL,上清液即為提取液?？扇苄蕴堑奶崛∵^程將6 mol/L HCl替換成蒸餾水,其余步驟同總糖的提取。取上述1.0 mL上清液依次加入0.5 mL蒽酮試劑和4.0 mL濃硫酸,充分振蕩,立即放入沸水浴,保溫1 min后自然冷卻至室溫于620 nm下測定吸光度。

1.3.2.4 總酚含量測定

參照SUN等[15]的方法并稍作修改,選取1.0 g綠豆芽菜粉,加入50 mL 1.0%(體積分數)鹽酸甲醇溶液作為提取液,30 ℃下超聲30 min,提取液于3 000×g離心15 min,收集上清液,將沉淀按上述過程二次提取后合并上清液,每個樣品平行3次提取。取0.25 mL上清液,先加1.0 mL 0.2 mol/L福林酚試劑,再加入2.0 mL 2.0% Na2CO3溶液,在25 ℃下進行暗反應90 min,最后在765 nm處測定吸光度值。

1.3.2.5 總黃酮含量測定

參考SUN等[15]的方法并稍作修改,用兒茶素為標準品制作標準曲線。提取方法同總酚含量的測定。取0.3 mL上清液,先加1.5 mL蒸餾水和0.09 mL質量分數為5.0%的NaNO2溶液,充分混勻后靜置5 min,再加0.18 mL質量分數為10%的Al(NO3)3溶液,混勻,靜置6 min;最后再加入0.6 mL 1 mol/L NaOH溶液和0.33 mL蒸餾水,在510 nm處測定。

1.3.2.6 總花青素含量測定

總花青素的含量參照劉婷婷等[2]方法進行測定,結果以矢車菊素-3-葡萄苷當量表示(mg/g樣品)。

1.3.2.7 抗壞血酸含量測定

抗壞血酸含量測定參照SUN等[15]的方法進行測定。

1.3.2.8 DPPH自由基清除率測定

參考陳金祥等[16]的方法稍做改進,稱取1.0 g豆芽,加入8 mL體積分數為50%甲醇溶液進行研磨提取,于8 000×g離心10 min,取1.0 mL上清液,依次加入0.5 mL 0.4 mmol/L DPPH無水乙醇溶液,再加2.0 mL蒸餾水,混勻,避光反應30 min后,在517 nm處測定吸光值。清除率的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0為對照實驗(水代替樣品溶液)的吸光值;A1為樣品實驗的吸光值;A2為樣品干擾實驗(無水乙醇代替DPPH溶液)的吸光值。

1.3.2.9 亞鐵還原能力測定

根據SUN等[15]的方法稍加修改,分別吸取0.1 mL濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8,1.0 mmol/L的FeSO4標準液,加入3.0 mL FRAP工作液[25 mL 0.3 mol/L的醋酸鹽緩沖液(pH 3.6)+2.5 mL 10 mmol/L TPTZ溶液+2.5 mL 20 mmol/L FeCl3混合而成,現用現配],再加入0.3 mL蒸餾水,混勻,于37 ℃下準確反應4 min后于593 nm處測定其吸光度,繪制標準曲線。然后取0.1 mL樣品提取液依次加入3.0 mL FRAP工作液和0.3 mL蒸餾水,混勻,37 ℃準確反應4 min后,于593 nm處測定其吸光度,樣品的抗氧化活性以達到相同吸光度所需FeSO4的毫摩爾數表示。

1.4 數據處理與統計分析

進行3次生物學重復,實驗數據以X±SD表示,利用SPSS 19.0進行數據統計分析,在0.05水平進行顯著性分析。采用Person相關分析對樣品的總酚含量、總黃酮、抗壞血酸含量與DPPH自由基清除能力和亞鐵還原能力進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 氯化鈣處理對發芽綠豆芽長的影響

由圖1可知,在發芽4 d內,與對照和其他濃度氯化鈣處理相比,外源噴淋2 mmol/L氯化鈣下綠豆芽長有顯著提高(P<0.05),在發芽第4天,芽長是對照的1.31倍,而5 mmol/L的氯化鈣生長最慢,在發芽第4天芽長較對照降低了23.96%(P<0.05)。此外,除發芽1～2 d外,0.5 mmol/L氯化鈣處理下綠豆芽長均顯著高于對照(P<0.05),而在發芽1～2 d與對照無顯著差異(P>0.05)。由此可見,這表明低濃度的鈣有促進綠豆芽菜生長的作用,而高濃度鈣則起抑制作用。

圖1 氯化鈣處理對發芽綠豆芽長的影響

2.2 氯化鈣處理對發芽綠豆呼吸速率的影響

由圖2可知,綠豆芽菜在生長過程中呼吸速率不斷增強,在發芽第4天達到最大(P<0.05),其中,0.5 mmol/L 和2 mmol/L氯化鈣處理下呼吸速率表現出相似的促進作用,在發芽第4天分別為對照的1.22 和1.37倍(P<0.05),而5 mmol/L氯化鈣處理下呼吸速率在發芽4 d內均顯著低于對照(P<0.05)。

圖2 氯化鈣處理對發芽綠豆呼吸速率的影響

2.3 氯化鈣處理對發芽綠豆可溶性蛋白含量的影響

由圖3可知,在發芽4 d內,發芽綠豆中可溶性蛋白均呈先上升后下降趨勢,在發芽第3天達到最大(P<0.05)。其中在發芽第3天,0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化鈣處理下可溶性蛋白顯著高于對照,分別較對照增加了11.7%和8.8%(P<0.05),而在發芽第4天,與對照相比無顯著性差異(P>0.05)。0.5 mmol/L氯化鈣處理下的可溶性蛋白含量在發芽4 d內均顯著低于對照(P<0.05)。

圖3 氯化鈣處理對發芽綠豆可溶性蛋白含量的影響

2.4 氯化鈣處理對發芽綠豆游離氨基酸含量的影響

由圖4可知,發芽綠豆中游離氨基酸含量隨時間延長而增加(P<0.05),2 mmol/L氯化鈣處理下游離氨基酸含量最高,分別為對照的1.65、2.05、1.76和1.35倍(P<0.05)。同時,除發芽第1天外,0.5 mmol/L氯化鈣處理下游離氨基酸含量均顯著高于對照(P<0.05),而5 mmol/L氯化鈣處理下游離氨基酸含量在發芽2～4 d均顯著低于對照(P<0.05)。

圖4 氯化鈣處理對發芽綠豆游離氨基酸含量的影響

2.5 氯化鈣處理對發芽綠豆總糖含量的影響

由圖5可知,隨著時間的延長,發芽綠豆中總糖含量先升高后逐漸降低,在發芽第2天達到最大值(P<0.05)。與對照和其他氯化鈣處理相比,2 mmol/L氯化鈣處理下總糖含量在發芽1～3 d顯著提高(P<0.05)。在發芽第4天,5 mmol/L氯化鈣處理下總糖含量顯著低于其他氯化鈣處理(P<0.05),但與對照相比無顯著性差異(P>0.05)。

2.6 氯化鈣處理對發芽綠豆可溶性糖含量的影響

由圖6可知,綠豆芽菜中可溶性糖含量隨時間延長而增加(P<0.05),其中在發芽第4天,0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化鈣處理下可溶性糖含量顯著高于對照,分別增加11.78%和18.38%(P<0.05),5 mmol/L氯化鈣處理下與對照相比無顯著性差異(P>0.05)。

圖6 氯化鈣處理對發芽綠豆可溶性糖含量的影響

2.7 氯化鈣處理下發芽綠豆總酚含量的變化

由圖7可知,綠豆芽菜中總酚含量在發芽1～4 d均呈增加趨勢(P<0.05),在發芽第4天,2 mmol/L氯化鈣處理下的總酚含量最高,達到10.47 mg/g(P<0.05),其次是0.5 mmol/L、對照和5 mmol/L氯化鈣處理,其中0.5 mmol/L氯化鈣處理下綠豆芽菜中的總酚含量,與對照相比無顯著性差異(P>0.05)。

圖7 氯化鈣處理對發芽綠豆總酚含量的影響

2.8 氯化鈣處理下發芽綠豆總黃酮含量的變化

圖8表明綠豆芽菜中總黃酮含量變化趨勢和總酚類似,均在發芽4 d內顯著增加,其中,除發芽2 d外,氯化鈣處理下總黃酮含量均顯著高于對照(P<0.05)。在發芽第4天,0.5、2、5 mmol/L氯化鈣處理下的總黃酮分別比對照增加了15.95%、33.62%和7.89%(P<0.05)。

圖8 氯化鈣處理對發芽綠豆總黃酮含量的影響

2.9 氯化鈣處理下發芽綠豆總花青素含量的變化

由圖9可知,在發芽4 d內,5 mmol/L氯化鈣處理的總花青素含量呈持續增加趨勢,而對照和其他2個濃度氯化鈣處理下總花青素含量表現出相似的變化趨勢,即在發芽3 d達到最大值(P<0.05)。同時,在發芽4 d內,0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化鈣處理下總花青素含量顯著高于對照,而5 mmol/L氯化鈣處理的總花青素僅在發芽第4天顯著高于對照,為對照的1.52倍(P<0.05)。此外,在發芽第4天,氯化鈣處理下的總花青素含量均顯著高于對照(P<0.05),但三者間無顯著性差異(P>0.05)。

圖9 氯化鈣處理對發芽綠豆總花青素含量的影響

2.10 氯化鈣處理下發芽綠豆抗壞血酸含量的變化

由圖10可知,在發芽4 d內,處理下的抗壞血酸含量均呈上升趨勢,其中在發芽1～2 d增加緩慢,在2～4 d急劇增加。此外,3個濃度氯化鈣處理均顯著增加綠豆芽菜中抗壞血酸含量(P<0.05),在發芽第4天,0.5、2、5 mmol/L氯化鈣處理下抗壞血酸含量分別較對照增加了15.8%、27.1%和23.8%,然而這3個濃度間含量無顯著性差異(P>0.05)。

圖10 氯化鈣處理對綠豆芽菜抗壞血酸含量的影響

2.11 氯化鈣處理下發芽綠豆DPPH自由基清除能力的變化

由圖11可知,在萌發過程中氯化鈣處理顯著提高了綠豆芽菜DPPH自由基清除能力,萌發時間、噴淋處理及其交互作用對清除能力有顯著影響(P<0.05),在發芽第4天,2 mmol/L氯化鈣處理下清除能力最高,其次為5、0.2 mmol/L氯化鈣和對照處理(P<0.05)。

圖11 氯化鈣處理對發芽綠豆DPPH自由基清除率的影響

2.12 氯化鈣處理下發芽綠豆亞鐵還原能力的變化

發芽期間,處理和對照的亞鐵還原能力顯著增加,其中2 mmol/L氯化鈣處理下還原能力最高(P<0.05)(圖12)。0.5 mmol/L氯化鈣在發芽2～4 d顯著高于對照,在發芽第1天無顯著性差異(P>0.05),而5 mmol/L氯化鈣僅在發芽3～4 d顯著高于對照。在發芽第4天,0.5、2、5 mmol/L氯化鈣處理下還原能力分別較對照增加了62.7%、74.0%和6.5%(P<0.05)。

圖12 氯化鈣處理對發芽綠豆亞鐵還原能力的影響

2.13 氯化鈣處理下發芽綠豆抗氧化成分與抗氧化性能的相關關系

DPPH自由基清除能力、亞鐵還原能力是目前衡量植物抗氧化性常用的指標。由表1可知,綠豆芽苗菜的DPPH自由基清除能力變化與亞鐵還原能力的相關系數為0.718,達到顯著水平,這說明這2種方法可以基本一致的反映不同發芽時期綠豆芽菜提取液的抗氧化活性。綠豆芽菜中總酚含量、總黃酮、抗壞血酸含量與DPPH自由基清除能力和亞鐵還原能力呈顯著相關(P<0.05)?？偦ㄇ嗨嘏cDPPH自由基清除能力和亞鐵還原能力間的相關性不顯著(P>0.05)。

表1 綠豆芽菜中總酚、總黃酮、原花青素和抗壞血酸含量與抗氧化活性之間的相關性

3 討論與結論

呼吸是種子萌發過程中胚芽的基礎生理代謝活動,種子中各種水解酶的合成和激活以及物質轉化都跟呼吸密切相關,Ca2+通過鈣結合蛋白調節種子萌發過程中的一些代謝酶,提高胚和胚乳中淀粉酶等水解酶的活性,用Ca2+處理糙米種子其呼吸速率有顯著提高[17],同時鈣元素是植物細胞的結構組成元素,適當補充鈣元素可促進芽菜的生長[10],本研究的結果也證實了這一點,綠豆籽粒發芽期間經0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化鈣處理,其芽長和呼吸速率均顯著上升,干物質消耗增加,表明發芽綠豆的生命活動受到氯化鈣處理,物質代謝速度加快,其中2 mmol/L氯化鈣的促進作用最強,而高濃度氯化鈣(5 mmol/L)對芽菜生長有抑制作用,在發芽初期高強度的呼吸速率與種子高活力密切相關[18],從而更快地為細胞合成提供還原力及中間代謝產物。

綠豆作為一種高蛋白、中淀粉、低脂肪的豆類,在發芽期間,貯藏物質水解釋放出大量的能量,轉化成易吸收的可溶性低分子物質,本研究中,在發芽4 d內,綠豆芽菜總糖和可溶性蛋白含量均呈先上升后下降趨勢,這可能是發芽后期消耗增加,而淀粉和貯藏蛋白水解補給有限,因而出現下降趨勢[19-20]。綠豆在發芽過程中,隨著淀粉酶、葡萄糖磷酸化酶等水解酶活力的提高,總糖不斷地被降解,可溶性糖含量增加。同樣,蛋白質在蛋白水解酶的作用下降解成氨基酸,游離氨基酸顯著增加,這種變化趨勢與陳志剛等[21]對糙米的研究結果一致。本研究發現0.5 mmol/L和2 mmol/L氯化鈣處理顯著提高可溶性糖和總糖含量,這與王艷穎等[22]在鮮切芹菜的研究結果相似,這可能是適宜的鈣能夠促進淀粉水解及脂類的分解轉化,從而使糖類增加[23]。

黃酮和酚類物質具有較好的自由基清除能力,是近年來天然抗氧化劑研究的熱點之一。苯丙氨酸解氨酶作為苯丙烷代謝途徑中的關鍵酶,在豆類萌發過程中,苯丙烷類代謝增強[24],有報道認為鈣離子可顯著促進苯丙氨酸解氨酶解氨酶活性,該酶是苯丙烷類代謝途徑中的關鍵酶和限速酶,其活性的大小與多酚、生物堿等重要刺激代謝產物的積累有極其密切的關系,導致黃酮和酚類物質的積累[25-26]。本實驗中總酚、總黃酮和抗壞血酸含量表現出相似的趨勢,在發芽4 d內隨發芽時間延長而增加,并且2 mmol/L氯化鈣處理下表現出更高的總酚和總黃酮含量,這與趙艷等[27]和喻最新等[28]的研究結果一致,本實驗中總花青素與DPPH自由基清除能力和亞鐵還原能力間的相關性不顯著(P>0.05),這可能與花青素極易降解的特性有關[2]。由此表明總黃酮、總酚和抗壞血酸在綠豆芽菜的抗氧化中起主要作用,而不是總花青素,這與魏美霞等[29]和劉婷婷等[2]將豆類的主要抗氧化作用歸因于總酚和黃酮類物質的研究結果相似。

發芽是一項有效改善豆類感官品質和營養品質的加工工藝。本實驗研究了氯化鈣處理對綠豆芽菜基礎營養物質及其抗氧化活性的影響,結果表明,0.5 mmol/L和2.0 mmol/L的鈣濃度處理均可顯著提高綠豆芽菜中游離氨基酸、總糖、可溶性糖含量。2 mmol/L氯化鈣處理下表現出更高的總酚和總黃酮含量。此外,除總花青素外,總酚、總黃酮和抗壞血酸含量均隨著發芽時間的延長而有不同程度的增加。相關性結果表明,抗氧化能力主要與酚類物質和抗壞血酸含量有關,因此綜合研究結果考慮,建議噴施2.0 mmol/L的鈣濃度對綠豆芽菜各方面的影響效果最優,同時發芽時間選取4 d,此時綠豆芽中含有較高的抗氧化物質和較高的抗氧化能力,對人體最有益。