電化學傳感器檢測動物源食品中氟喹諾酮類抗生素殘留研究進展

朱依婷,韓靜,張亞男,曾秋艷,陳姝娟

(四川農業大學 食品學院,四川 雅安,625014)

氟喹諾酮類抗生素(fluoroquinolones, FQs)是第三代喹諾酮類藥物,是對細菌DNA旋轉酶具有活性抑制作用的一類抗生素,其結構通式如圖1所示[1]。FQs因其高效、低毒等特點被廣泛應用于畜牧和水產養殖行業中[2]。但研究表明,FQs在動物源食品中殘留易引起腹痛、頭痛等胃腸道或中樞系統癥狀,以及QT間期延長、主動脈瘤等不良反應[3]。為了更好監控動物源食品中FQs含量,美國已禁止在動物源食品加工過程中使用FQs[4],日本、歐盟以及我國嚴格規定了其在動物源食品中最大殘留限量(maximum residue limit,MRL),如牛奶和畜禽肌肉組織中恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)的MRL均為100 μg/kg,二氟沙星的MRL為400 μg/kg,達氟沙星的MRL分別為200 μ/kg和30 μg/kg;2015年我國農業部第2292號公告禁止在食品動物中使用包括諾氟沙星(norfloxacin,NFX)在內的4種FQs。但《農村農業部辦公廳公布的關于2020年度動物及動物產品獸藥殘留監控結果的通報》中顯示,豬肉、雞蛋等畜禽產品及蜂產品中FQs殘留超標現象仍存在,豬肉中檢出ENR殘留609 μg/kg,高出限量6倍;蜂產品中檢出NFX 163 μg/kg(臨時限量10 μg/kg)。為滿足市場監管需求,相關行業須不斷研究便攜、準確檢測食品中FQs殘留的技術。

圖1 FQs的結構通式[1]

目前,FQs的常規檢測主要包括微生物分析法[5]、酶聯免疫法[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7]、高效液相色譜-質譜法(HPLC/MS)[8]等。HPLC以及HPLC/MS是檢測動物源食品中FQs殘留的國家標準方法,這類檢測方法優勢是靈敏度和準確度高,但它存在分析時間較長、預處理步驟繁瑣以及殘留大量有機溶劑等不足,限制其在快速現場檢測中的應用。

近年來,電化學傳感器具有便攜、快速經濟,易實現在線檢測等優勢,在食品質量安全檢測方面擁有廣闊的發展前景。

本文回顧了近年來運用電化學傳感器在FQs殘留檢測中的研究進展,分析不同類型電化學傳感器的機理和優缺點,重點介紹電化學傳感器檢測技術在動物源食品(如牛奶、畜禽肉及水產品等)中的應用,并展望了該領域的挑戰和發展前景,可為我國動物源食品中FQs殘留的防控、檢測提供參考。

1 電化學傳感器

電化學傳感器是利用電化學分析技術對目標物質進行定量檢測的裝置,包括識別元件和轉換元件。其工作原理是通過轉換元件將目標物質與敏感元件作用產生的化學信號轉變為電信號,由電化學工作站轉換為數字信號顯示于微機,如圖2所示。不同電信號(如電流、電阻及電勢等)與目標物質的濃度呈線性關系,可進行定性或定量分析[9]。電化學檢測通過三電極[工作電極(working electrode,WE),參比電極(reference electrode,RE)以及對電極(counter electrode,CE)]體系來實現,其中WE的性能決定了電化學傳感器的靈敏度。電化學傳感器根據轉換元件響應信號不同可分為電流型、電位型、電導型[10],其中電流型電化學傳感器測試方法多樣,如循環伏安法(cyclic voltammetry,CV)、差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)、方波脈沖伏安法(square wave voltammetry,SWV)、電化學交流阻抗法(electrochemical impedance spectroscopy,EIS)及線性掃描伏安法(linear sweep voltammetry,LSV)等,是目前應用最廣泛的一類電化學傳感器。

圖2 電化學傳感器的工作原理[9]

FQs的氧化還原行為可使其直接進行電化學研究。FQs電化學氧化機理存在2種情況,均發生在哌嗪基上:第一種氧化機理是一步氧化,即C-7位上哌嗪基末端N原子被氧化成N—OH,如NFX、左氧氟沙星(levofloxacin,LEV)、環丙沙星(ciprofloxacin,CIP)等。YE等[11]研究發現NFX的電化學氧化是位于C-7位上的哌嗪基末端氮原子氧化形成羥基,NFX氧化機理如圖3-A所示。第二種氧化機理特指ENR的兩步氧化。ANTILéN等[12]學者研究發現ENR哌嗪基末端氮上的乙基被氧化,形成等量CIP,再次被氧化,最終形成一個三羥基衍生物,其氧化機理如圖3-B所示。任何一種情況下,FQs的氧化過程都會在陽極電位范圍內呈現不對稱伏安曲線圖,這是不可逆反應的典型特征。

A-NFX的氧化機理[11];B-ENR的氧化機理[12]

2 電化學傳感器在FQs檢測的應用研究進展

2.1 納米材料無識別元件電化學傳感器

隨著納米技術和納米科學的發展,納米材料因其特殊的物理化學特性,具有許多與傳統材料不同的性能,如催化活性高、比表面積大、吸附能力強等,因而在電化學傳感界面構筑方面具有重要應用。碳納米材料、金屬納米顆粒和納米金屬氧化物等多種性能獨特、導電性優異、信號放大能力強的納米材料逐漸被引入電化學傳感器中。

電化學領域中使用最多的大致可分兩類:生物質衍生炭材料和碳納米材料。

生物質衍生炭材料(biomass-derived carbon,BC)是利用生物質為碳源,通過高溫碳化和活化后得到的多功能材料,具有比表面積大、孔隙多、吸附性好及來源豐富等優勢[13],通常BC的粒徑可分為微孔(<2 nm)、中孔或介孔(2～50 nm)和大孔(>50 nm),后衍生出納米孔(<100 nm)、次微孔(0.7～100 nm)和超微孔(<0.7 nm)。介孔可提供豐富的離子通道,微孔可以作為物質催化反應的場所,是制備電化學傳感器理想的新型電極材料[14],如MADHU等[15]用香蕉莖高溫下制備含氮硫等雜原子的活性炭。

碳納米材料已被廣泛用于電化學傳感器的制備。其中,碳納米管和石墨烯更是當前的研究熱點。

碳納米管(carbon nanotubes,CNTs)是由石墨烯片層卷曲形成的管狀結構碳材料,按層數不同可分為單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes,SWCNTs)和多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)。功能化的CNTs克服易團聚、分散性差等缺陷,增強了導電性和特異性吸附能力[16]。MORAES等[17]制備了一種利用π-π堆積作用將單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA)與SWCNTs進行雜化后,自組裝于金電極表面的電化學傳感器。對LEV的電氧化行為展現了良好的選擇性和電催化活性,檢測限可達75.2 nmol/L。石墨烯(graphene,GR)是以單層石墨形式存在的二維sp2雜化的六方晶系材料,具有機械強度強以及高載流子速率等優勢,是目前應用廣泛的二維材料[18]。FARIA等[19]應用化學還原氧化石墨烯(chemical reduction of graphene oxide,CRGO)修飾玻碳電極,檢測牛奶中的CIP,檢出限達到0.21 μmol/L。相比未修飾電極,由于CRGO的多孔結構,CIP的電氧化電流增強5倍。石墨烯由于制備方法簡單、快速,現已成為構建免疫傳感器的首選納米材料之一。

然而單一組分的碳納米材料無法完全滿足電化學檢測的需求﹐其在溶劑中的分散性也限制了應用。因此,需對碳納米材料進行改性和功能化,或者與其他功能性納米材料復合,改善碳納米材料的電化學性質,拓展其在電化學傳感領域的應用[20]。

2.2 電化學生物傳感器

電化學生物傳感器是以生物活性物質作為識別元件,與FQs發生特異性結合產生的生物信號轉換為電信號,根據檢測電信號的變化來定量FQs濃度的裝置[21]。根據識別元件的不同可將電化學生物傳感器大致分為電化學酶傳感器,電化學免疫傳感器、電化學微生物傳感器、電化學適配體傳感器。

2.2.1 電化學酶傳感器

電化學酶傳感器是利用酶的氧化還原活性中心直接在電極上發生電催化或因抗生素抑制酶活性而改變電信號強弱的傳感器[22]。檢測FQs的研究較少,大多用于檢測青霉素[23]。FQs的抑菌性是由于它能與DNA促旋酶形成復合物,而CARDOSO等[24]利用這一特性,將DNA促旋酶作為識別元件在羧化碳納米管修飾的絲網印刷碳電極(screen printed carbon electrode,SPCE)上的固定化,成功開發出新型的檢測鹽酸環丙沙星傳感器,并通過對NFX和氨芐青霉素的檢測,證實了DNA促旋酶能選擇性檢測FQs,如圖4所示。羧化碳納米管的添加可顯著增強電流信號,且經活化后的羧化碳納米管表面形成胺化層,增加DNA促旋酶的附著,提高檢測靈敏度。

圖4 使用DNA促旋酶檢測CIP的檢測原理圖[24]

2.2.2 電化學免疫傳感器

電化學免疫傳感器是采用競爭性免疫反應的原理,使電位發生變化,將某物質濃度信號轉化為電信號輸出的裝置[25]。此綜合了電化學傳感器的高靈敏度和抗體的高選擇性,是檢測抗生素殘留的良好分析工具。PINACHO等[25]首次以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)作為酶示蹤劑,將抗FQs抗體(Ab171抗體)固定到磁珠上,磁吸作用下附著到磁性石墨-環氧復合材料電極(magnetic graphite epoxy composite electrode,m-GEC)上,加入CIP標準品后,激活FQs半抗原與Ab171抗體發生免疫應答,通過電極上HBP催化酶促反應產生的電流強度變化進行CIP定量分析,檢測原理如圖5所示。該傳感器無需樣品前處理,可直接用于檢測牛奶中的CIP,檢出限低至2.72×10-2nmol/L。其中磁珠的使用不僅可以保證競爭性免疫反應與酶促反應高效進行,還可以在磁場作用下快速富集到電極表面,且檢測后利用磁場將磁珠分離,達到縮短檢測時間,實現電極表面快速更新等效果。

圖5 m-GEC檢測CIP的檢測原理圖[25]

2.2.3 電化學微生物傳感器

電化學微生物傳感器通過化學方法(共價結合或交叉耦合)和物理方法(如吸附或包埋)將微生物(細菌、真菌等)固定在電極上,利用FQs對微生物的抑制作用,通過檢測微生物的代謝、基因表達或產生的蛋白質導致電信號變化,實現抗生素的定量檢測[26]。姜曉瑜等[27]利用凡納濱對蝦攜帶的副溶血弧菌構建了一種微生物生長傳感器AST法用于檢測ENR的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC),相比于標準的微量肉湯稀釋法,其操作更簡便,失誤率更低且可以實現自動化。PELLEGRINI等[28]利用與抑制敏感細菌生長相關的二氧化碳生產率,選擇大腸桿菌ATCC 11303作為傳感器的識別元件,檢測牛奶中包括ENR、NFX、單諾沙星等喹諾酮類抗生素和四環素類抗生素,檢出限低于25 μg/L。

電化學微生物傳感器的優點是檢測速度快,靈敏度高,無需樣品預處理,樣品用量小,但是微生物細胞容易受到pH和溫度等生長環境條件的影響,細胞數量難以控制,造成重復性差,穩定性差。

2.2.4 電化學適配體傳感器

核酸適配體是運用指數富集方法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)從隨機寡核苷酸庫中篩選出的ssDNA、雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)等能與靶向物質類似抗原抗體間特異性結合的寡核苷酸序列,靶向物質可以是小分子物質(如燃料、藥物、氨基酸等)、大分子(如蛋白質)到細胞[29]。與傳統抗體相比,適配體可保證與靶向物質之間的高親和力,且成本低、性能穩定。電化學適配體傳感器是通過與目標物質間的相互作用導致固定在電極上的適配體構象改變的傳感器,體現在氧化還原電流的增加或減少[30]。因而可以通過體外擴增親和力高的適配體制備電化學適配體傳感器,應用于動物源食品中FQs的檢測。SONG等[31]選取具有混合金屬價態、良好的生物相容性和電化學活性的鈷鎳雙金屬有機骨架材料(2D metal-organic frameworks,2D MOFs)[CoxNi3-x(HITP)2]作為電信號放大裝置,體外篩選出ENR 靶向適體序列作為識別元件,制得檢測牛奶中痕量ENR殘留的電化學適配體傳感器,檢出限可達5.56×10-5nmol/L,檢測范圍為2.78×10-6～2.78×10-3nmol/L,該傳感器具有選擇性好、重現性高、穩定性好的優點,2D MOFs具有超薄納米片結構、粗糙表面、富含氨基的功能和豐富的缺陷,該傳感器與其他檢測ENR的適配體電化學傳感器相比,檢測穩定性能最佳。

2.3 分子印跡電化學傳感器

分子印跡聚合物(molecularly imprinting polymers,MIPs)是通過模板分子與功能單體間形成復合體,再選用交聯劑、引發劑等拓展復合體結構,經洗脫模板分子后生成特定識別模板分子的聚合物空腔。MIPs因其合成簡單、重復性好以及識別能力強,廣泛應用于食品、醫藥檢測領域[32]。分子印跡電化學傳感器是利用模板分子與功能單體間的共價或非共價作用通過電聚合方式制備MIPs的傳感器,基本原理如圖6所示。相比于傳統的MIPs制備方法,電化學制備MIPs過程簡單、用時短、可直接在電極上聚合并且聚合物厚度可控等優點[33]。YAN等[34]以ENR為模板分子,將鄰苯二胺和吡咯作為功能單體通過一步電聚合法在鉛筆石墨電極(pencil graphite electrode,PGE)表面形成能識別ENR的MIPs的分子印跡電化學傳感器。對牛奶中ENR殘留進行檢測,檢出限為6.50×10-4nmol/L,加標回收率為89.7%～97.5%。

圖6 分子印跡電化學傳感器的檢測原理圖

不同種類電化學傳感器檢測FQs的優勢與局限性如表1所示。

表1 不同種類電化學傳感器檢測FQs的優缺點

3 不同電化學傳感器在檢測動物源食品中FQs的應用

3.1 牛奶監測

牛奶中FQs殘留會導致使易感人群出現過敏反應、激素障礙,并造成鮮奶品質下降,影響奶制品產出等危害,已成為奶制品安全問題中消費者、奶農等關注的焦點[35]。電化學傳感器應用于牛奶中FQs的監測,已取得良好效果,具體應用見表2。

表2 2011年—2021年中用于檢測牛奶中FQs的電化學傳感器代表性實例

由表2可知,當前應用于牛奶中FQs殘留檢測的電化學傳感器種類全面。無識別元件的電化學傳感器依靠納米材料的傳感優勢和FQs的電化學氧化行為來實現對FQs的直接檢測。金屬[38,42]和碳基材料[40-41,43]可增強導電性,多孔或框架結構[39]則可提高對FQs的吸附性,有利于傳感器的高靈敏化。此外,基于超分子溶劑(supramolecular solvents,SUPRASs)的電化學傳感器鮮有報道。GISSAWONG等[38]將SUPRASs引入電化學傳感器,應用于生牛奶、UHT牛奶以及零脂肪牛奶中CIP的殘留檢測,使檢測限比AuNPs/AC修飾的傳感器降低約50倍,可為動物源食品中其他類別抗生素監測提供綠色高效的新思路[49]。

電化學酶傳感器可提供較好的檢測靈敏度,但易受環境因素影響。CARDOSO等[24]以CIP和NFX為檢測對象,構建了電化學酶傳感器,并與相應免疫傳感器比較(以Ab-ENRO/CIPRO為識別元件)。以CIP為例,該傳感器的檢出限為1.52 nmol/L,相應免疫傳感器的檢出限為11.3 nmol/L。該研究通過DNA促旋酶傳感層增加結合位點,增強了檢測方法的準確性,但監測溫度會影響讀數準確性,需進行溫度優化測試。而分子印跡電化學傳感器通過改善MIPs的制備方法,進一步提升其檢測性能。KUMAR等[48]制備的磁性分子印跡電化學傳感器易于磁分離,可實現傳感器的重復使用,且樣品基質不易造成干擾,在復雜食品樣品中具有潛在應用前景,但制備耗時長的問題有待解決。此外,電化學適配體傳感器在檢測牛奶中FQs殘留方面表現出極佳的檢測性能。HU等[45]研究了基于SSDNA的電化學傳感器,用于評估牛奶中的CIP,即使在結構類似物存在的情況下,也顯示出高選擇性,且貯存兩周性能依舊,但適配體篩選過程復雜且重復率高的問題仍需解決。未來可利用適配體或MIPs與SUPRASs復合修飾電極,實現綠色環保地檢測牛奶中FQs殘留。

3.2 畜禽肉及副產物監測

我國屬于肉類生產和消費大國,肉類總產量占世界總產量33%左右,其中豬肉占到50%以上[50]。畜禽肉中抗生素殘留問題受到研究者們的關注。表3中匯總了近年來電化學傳感器在畜禽肉及副產物中檢測FQs的應用。

表3 2011年-2021年中用于檢測畜禽肉及副產物中FQs的電化學傳感器代表性實例

由表3可見,基于復合納米材料的無識別元件電化學傳感器,能有效提高其檢測效果。胡玥等[51]結合納米氧化CuO和碳點(carbon dots,CDs),用于豬肝中的鹽酸二氟沙星殘留的檢測,其檢出限為3.30 nmol/L,其加標回收率為97.1%～101.2%,RSD為1.2%～2.9%,該方法準確可靠。雙功能單體的分子印跡電化學傳感器可有效增加結合位點,進一步提升印跡效率。秦思楠等[54]以鄰苯二胺和鄰氨基苯酚為雙功能單體,采用循環伏安法在玻碳電極表面制備MIPs,通過雙功能單體印跡產生了多點協同作用,增強結合力的同時也提高了印跡膜的選擇性,該傳感器已成功應用于雞蛋、雞肉及豬肉等畜產品中ENR殘留檢測。同時,電極基底的改進有助于電化學傳感器的發展。何雅雯[53]將磁珠結合3D打印技術制備電化學轉化電極,再在此電極上修飾ENR的抗體,實現雞肉樣品中ENR檢測。該工作中用絲網印刷電極替換傳統電極體系,3D打印電化學池代替電化學工作站,只需滴加100 μL樣品(約2滴),即可完成電化學分析,有望實現家禽供應鏈中抗生素殘留的快速檢測。此外,該研究選取磺基水楊酸作為提取試劑,利用磺基水楊酸根與蛋白質氨基結合形成不溶性蛋白質鹽沉淀的原理,再通過雙層濾膜過濾實現固液分離,能基本消除樣品基質效應,有利于節省樣品前處理時間,為豬肉、羊肉等復雜樣品的前處理提供參考。

3.3 水產品監測

水產品作為蛋白質的優質來源,其所含的不飽和脂肪酸對人體大腦發育有益,在城鄉居民的食品消費結構中占有十分重要的地位。FQs易在水產品養殖和生產過程中被濫用。近年來電化學傳感器在水產品中檢測FQs的具體應用見表4。

表4 2011—2021年中用于檢測水產品中FQs的電化學傳感器代表性實例

由于水產品種類眾多,組成成分復雜,其基質效應的探究是提高電化學檢測方法準確性的重要保證。楊阿喜等[55]和ZHU等[57]選取了常見的陽離子(如Na+、Ca2+)以及尿素、抗壞血酸等小分子物質進行考察,但基質中的脂質與糖類對檢測也存在背景干擾,未有學者對此進行探究。因此,對水產品中FQs的基質效應的探究將是下一個研究熱點和難點。

電化學傳感器通常僅檢測單一目標物,但對能同時檢測多種目標物的電化學傳感器研究較少。ZHU等[57]開發了基于一種陽離子表面活性劑的電化學傳感器,用于同時檢測蝦中PFX與GTX殘留,兩者的峰電位相差約400 mV,電流峰不重疊,同時測定時互不干擾。該傳感器與現有單獨測定PFX或GTX的電化學傳感器相比,僅需30 s便可完成檢測,其檢測限更低,檢測范圍更寬,為構筑高性能多目標同時檢測的電化學傳感器提供了一種有效方法和途徑。傳統分子印跡電化學傳感器存在傳感信號不穩定、重現性等問題?；诖?CHEN等[59]采用溶膠-凝膠法構建分子印跡電化學傳感器,并將其成功應用于魚和蝦中ENR的檢測,其檢測限可低至0.9 pmol/L,RSD僅為0.38%(n=9),該方法具有良好的靈敏度和精密度,可實現對水產品中超痕量ENR殘留的準確檢測。

目前,水產品中多種FQs殘留能否采用電化學傳感器實現同時檢測還需深入探討,基質干擾機理還不明確,對傳感識別過程的影響還需進一步分析。今后,可通過使用分子印跡、磁分離固相萃取柱減弱水產品基質的干擾,開發更高效、便攜的水產品中FQs的直接監測技術。

4 結語

電化學傳感器相較傳統FQs檢測方法而言更利于實現現場快速檢測,如今已在食品檢測領域有所突破并日趨成熟。雖然電化學傳感器已用于不同類別動物源食品中FQs的高靈敏監測,但許多方法仍處于實驗室階段,在實際應用方面存在著一些挑戰:樣品基質中最常見的干擾因素是蛋白質,但脂質、糖類以及無機鹽等也存在潛在干擾,樣品基質效應仍需進一步研究;制備作為信號放大元件的納米材料的溶劑大多對人體有害;識別元件的選擇性需進一步提高。

今后,可在以下幾個方面有所突破:第一,可針對不同類別的動物源食品基質探究合適的提取溶劑,研制重復性好的特異性吸附材料用于樣品前處理,減少樣品基質干擾影響。第二,探索超分子溶劑、低共熔溶劑以及離子液體等綠色溶劑在信號放大方面的作用,開發出綠色、環保的電極修飾材料。第三,創新MIPs的功能單體種類以及合成方法,提升分子印跡電化學傳感器的穩定性和重現性。第四,動物源食品中會同時共存多種FQs,開發用于多種FQs無交叉同時檢測的電化學傳感器可提高檢測效率、降低樣品消耗和檢測成本。第五,與智能技術(如3D打印技術、微流控技術等)聯用,設計并研制便攜、高效的商業化電化學傳感器。只有不斷改進和完善電化學檢測動物源食品中FQs殘留的技術,才能確保消費者健康和動物源食品安全。