厭氧發酵促進酸茶中抗氧化物質生成的研究進展

潘聯云,趙碧,冉隆珣,夏麗飛,梁名志

(云南省農業科學院茶葉研究所,云南省茶學重點實驗室,云南 勐海,666200)

酸茶(pickled tea)是一種厭氧發酵茶,主要產于泰國北部(稱為“Miang”)[1]、日本四國島(稱為“Awaban-cha”和“Goishi-cha”)、緬甸(稱為“Laphet”)和中國云南省少數民族(布朗族和德昂族)地區[2]。酸茶制作主要通過鮮葉殺青(或蒸煮)、揉捻、裝罐密封發酵后干燥制成。布朗族酸茶、泰國酸茶Miang、緬甸酸茶Lahpet和日本酸茶Goishi-cha的制備經歷前發酵及厭氧發酵這兩個階段的發酵處理,而德昂族酸茶、泰國酸茶Miang-Som和日本酸茶Awaban-cha采用嚴格的非絲狀真菌厭氧發酵。不同地區的酸茶雖存在地理環境、文化和加工工藝的差異,但其加工核心均為厭氧發酵。

特殊的厭氧發酵制作工藝使酸茶具有酸香(也稱為乳香或奶酪香)顯露、湯色金黃、滋味醇厚回甘等品質特征[3-4]。厭氧發酵能夠降低茶葉中咖啡堿和部分兒茶素含量,增加水溶性總糖和游離氨基酸等成分,從而使酸茶苦澀味降低,滋味變柔和醇厚。厭氧發酵微生物能產生大量有機酸促進酸茶“酸香顯露、生津回甘”的品質特征形成。有機酸可以進一步降低茶葉pH值,提高茶多酚穩定性,有助于酸茶“生津回甘”。厭氧發酵還能夠促進沒食子酸(gallic acid,GA)、乳酸、乙酸和間苯二酚等多種功能活性成分積累,抑制表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)水解,增強酸茶抗氧化、抗衰老、抗菌、促進消化和調節脂質代謝等保健功能[5]。厭氧發酵中的部分益生菌,如發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),自身也具有抗氧化活性[6]。

近幾年來,酸茶因其特殊的民族文化屬性和抗氧化等健康屬性成為國內外研究的熱點,本文綜述厭氧發酵及發酵優勢菌對酸茶抗氧化成分形成的影響作用,全面闡述酸茶抗氧化物質,為酸茶的保健功效研究及產品開發提供理論參考。

1 酸茶中抗氧化物質

微生物發酵茶因其醇厚的口感和獨特的保健功效受到人們的青睞,如普洱茶、茯磚茶和酸茶等。微生物發酵促進以酚類化合物為主的茶葉成分發生結構轉化,形成一系列具有生物活性的化合物,如沒食子酸、茶褐素、簡單兒茶素和糖苷化合物等,這些成分具有提高茶葉抗氧化、降血脂、抗動脈粥樣硬化和抗菌等保健功效[7-8]。但不同的發酵方式對茶葉成分轉化和功能作用的影響顯著不同。

在有氧發酵過程中,兒茶素、黃酮及其糖苷等抗氧化成分主要通過氧化聚合、生物降解和糖基化途徑轉化為茶褐素、沒食子酸和糖苷衍生物等降脂功效為主的活性成分。因此,與未發酵茶(曬青茶或綠茶)相比,以六堡茶、茯磚和普洱茶為代表的有氧發酵茶的降血脂作用顯著增強(48%～50%),而抗氧化能力顯著降低(31%～49%)[9]。

酸茶具有與未發酵茶基本相同的抗氧化能力,酸茶的抗氧化活性成分主要有多酚類、有機酸和微生物類(表1)。KETWAL等[10]研究發現,酸茶Miang也具有與其他茶制品一樣的抗氧化能力。CHUPEERACH等[11]證明了酸茶有顯著的體外抗氧化活性,發現蒸煮和發酵后酸茶的總酚含量和抗氧化活性顯著增加,在DPPH的清除能力、鐵離子還原抗氧化能力和氧自由基吸收能力上均顯示出顯著的體外抗氧化活性。

表1 酸茶中的抗氧化物質

酸茶抗氧化物質的生成與其特殊的厭氧發酵工藝緊密相關,厭氧發酵能夠促進酸茶多種抗氧化活性物質的生成(圖1)。在厭氧發酵過程中,乳酸菌和酵母等優勢微生物能夠產生多種有機酸,其中乳酸、檸檬酸和琥珀酸有助于提高酸茶抗氧化能力[12]。有機酸還能降低茶葉pH值,形成酸性的發酵環境。缺氧的酸性發酵環境有助于提高多酚穩定性,抑制EGCG水解,使其在整個發酵過程中保持相對穩定水平[13-14]。酸茶厭氧發酵中存在多條沒食子酸合成途徑,能夠穩定合成高含量的沒食子酸。厭氧發酵還能產生酸茶特有的新抗氧化成分,如間苯二酚[15]和鄰苯三酚[16]。厭氧發酵中的部分益生菌自身也具有抗氧化活性,是酸茶中的主要抗氧化物質之一。

圖1 厭氧發酵過程中酸茶的抗氧化物質生成途徑

2 厭氧發酵中微生物對酸茶抗氧化功效的影響

2.1 酸茶發酵的優勢菌株

微生物對形成發酵茶特有的風味和保健功效具有重要作用。在固態發酵過程中,微生物一方面能夠以茶葉為底物進行轉化反應,合成多種活性成分;另一方面,微生物的代謝產物及菌體本身均可作為活性物質,促進茶葉品質提升。曲霉(Aspergillus)和冠突散囊菌(Eurotium)等真菌是普洱茶和茯磚茶發酵的優勢菌群,而以乳酸菌為主的細菌和酵母是酸茶發酵的優勢菌群[17-18]。與曲霉等真菌相比,細菌具有三羧酸循環、碳水化合物代謝、氨基酸代謝和脂質代謝等多條代謝途徑,在酸性厭氧發酵環境中活性較好[19]。

茶葉富含茶多酚等抗菌活性物質,能夠抑制微生物生長。乳酸菌和酵母等微生物通過生成鞣酸酶、酚酸脫羧酶和苯醇脫氫酶來提高多酚耐受性,成為酸茶的主要發酵菌群[20-21]。其中以植物乳桿菌、發酵乳桿菌和戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)為主的乳酸菌是最主要的發酵細菌菌群[22-23],其次是醋酸桿菌(Acetobacter)[24]和芽孢桿菌(Bacillus)[25-26]。酸茶發酵中的優勢真菌為嗜酒假絲酵母(Candidaethanolica)和畢赤酵母屬(Pichia)[24]。但不同地區的酸茶微生物群落存在差異。日本酸茶Awaban-cha中戊糖乳酸菌占比高于植物乳桿菌[27],而日本酸茶Ishizuchi-kurocha和泰國酸茶Miang中植物乳桿菌占主導地位[22-23]。

2.2 微生物對酸茶抗氧化功效的貢獻

茶葉具有多種有機酸,其含量約為干物質質量的3%左右,是茶葉香氣、滋味及抗氧化功效的主要成分[28-29]。微生物的產酸作用能夠增加發酵茶中有機酸含量和種類[27,30],大量的有機酸的產生有助于酸茶獨特的“酸香”品質特征和酸性發酵環境的形成[13](圖1)。

酸茶發酵中存在多種產酸微生物。醋酸桿菌是產生乙酸的主要微生物,酵母能夠產生乙酸、檸檬酸、葡萄糖醛酸和琥珀酸等多種有機酸,乳酸菌(發酵乳桿菌除外)能夠同質發酵產生乳酸,也能異質發酵產生乙酸和琥珀酸[31]。在整個發酵過程中,酸茶有機酸呈現先增后穩定的動態變化。在發酵初期,乳酸菌和酵母菌豐度增加導致乳酸和葡萄糖醛酸含量迅速增加,其中乳酸量幾乎是其他酸的兩倍[24,32]。酸茶發酵過程中,乳酸含量變化具有先增后減趨勢,這與乳酸菌數量呈正相關。葡萄糖醛酸和琥珀酸含量分別在發酵初期和發酵后期達到最大值后趨于穩定,直至發酵結束[24]。茶葉pH值變化與有機酸含量相關,呈現先降低后趨于穩定(4.5～4.7)的趨勢[13,24]。

乳酸菌還是構成酸茶抗氧化作用的重要組成部分,體內及體外實驗均證實乳酸菌具有抗氧化、抗衰老和抑菌等多種生理活性,且對高濃度膽汁酸具有耐受性[33]。乳酸菌可以單獨作為一種抗氧化劑來緩解鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和全氟辛酸誘導的氧化應激和肝臟損傷[34-35],也能與茶聯合攝入,協同提高黃酮類生物利用度,保護細胞免受d-半乳糖和H2O2誘導的氧化損傷[36-37]。

與有氧發酵茶相比,厭氧發酵的酸茶富含具有抗氧化能力的乳酸菌。CAO等[6]從德昂酸茶中分離出25株乳桿菌,并從中篩選出抗氧化和抗菌活性較好的兩株植物乳桿菌ST和STDA10,發現其對胃腸道環境具有較好耐受性,能夠顯著清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基。KLAYRUNG等[38]從泰國酸茶Miang中也分離出兩株具有高耐酸耐膽汁的發酵乳桿菌FTL10BR和FTL2311,它們能夠分泌抗氧化活性物質,通過降低自由基含量和增強還原能力的機制發揮抗氧化作用。

3 厭氧發酵對酸茶抗氧化成分合成的影響

3.1 厭氧發酵保持酸茶多酚含量的穩定

酚類化合物是茶葉中一種高效、天然安全的抗氧化劑,茶葉中酚類化合物的含量與其抗氧化能力呈正相關,其中以兒茶素最為重要。在有氧發酵過程中,茶多酚通過氧化聚合和生物降解等途徑轉化生成大量茶褐素,表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)和沒食子酸等降脂活性成分,從而大幅度降低普洱茶[39]和茯磚茶[40]中的多酚含量,使其抗氧化能力減弱[9]。而在酸茶加工過程中,蒸煮殺青和厭氧發酵能夠使酸茶中茶多酚保持較高水平。

植物中酚類物質通常以結合酚的形式廣泛存在于植物基質中,蒸煮殺青能夠破壞植物細胞壁,打破酚類物質與植物基質之間的相互作用,增加酚類物質的釋放,導致蒸熟茶葉中酚類物質的含量高于新鮮茶葉[41]。厭氧微生物產生的大量有機酸能夠降低茶葉pH值,形成酸性發酵環境[20, 27]。酸性的厭氧發酵環境有助于提高茶多酚(特別是EGCG)穩定性,減少EGCG的水解[42](圖1)。

由于不同地區酸茶制作工藝的區別,酸茶發酵過程中多酚動態變化的研究結果存在地區性差異。CHUPEERACH等[11]和SOMSONG等[43]的研究均發現,在蒸煮殺青和發酵后,茶鮮葉的生物活性物質發生了結構和數量的變化,總酚含量和抗氧化活性顯著提高,從而使泰國酸茶Miang具有顯著清除DPPH自由基、吸收氧自由基能力和鐵離子還原能力。魏琳等[44]也發現厭氧發酵能顯著增加德昂酸茶中茶多酚的含量。而HUANG等[3-4]研究表明耐單寧的乳酸菌和酵母能夠分泌單寧酶降解茶多酚,將酯型兒茶素水解為非酯型兒茶素和沒食子酸,從而改變兒茶素組并降低酸茶的苦澀度。

3.2 厭氧發酵具有多途徑促進酸茶沒食子酸合成

沒食子酸廣泛存在于多種天然植物中,具有抗氧化、抗菌和抗炎等功能。茶樹中沒食子酸常以酯的形式連接在兒茶素的羥基位上,形成酯型兒茶素衍生物,如黃烷-3-醇沒食子酸酯,因此未發酵茶中的沒食子酸含量較低(1.67 mg/g)[45]。

在微生物發酵過程中,茶葉中黃烷-3-醇沒食子酸酯在微生物的多種水解酶作用下生成沒食子酸[46-48]。近年來的研究表明,普洱茶中沒食子酸含量介于1.61～20.72 mg/g,平均含量為 9.01 mg/g,而厭氧發酵的酸茶沒食子酸含量均可到五倍子的水平(25.7 mg/g)[3,14]。酸茶發酵過程中沒食子酸含量的變化與普洱茶和茯磚茶的類似,呈現先增后減的變化趨勢[14]。但與之不同的是,有氧發酵茶沒食子酸增加的同時總多酚和總兒茶素均降低,尤其是EGCG[9]。酸茶EGCG的含量在發酵過程中保持相對穩定[1,13-14],這說明有氧型和厭氧型發酵茶的沒食子酸合成的前體物和途徑不同。

EGCG屬于黃烷-3-醇沒食子酸酯,是茶葉中含量最高的兒茶素。曲霉和冠突散囊菌介導的EGCG水解是有氧發酵茶沒食子酸生物合成的主要途徑[49]。在酸茶厭氧發酵過程中,曲霉屬的數量與菌群豐富度和多樣性相比非常低,所分泌的水解酶類有限[14]。同時,缺氧和酸性的發酵條件會抑制單寧酶活性,其將大量EGCG轉化為沒食子酸的能力下降,從而使EGCG在整個厭氧發酵過程中保持相對穩定[16](圖1)。

酸茶厭氧發酵過程中具有大量與沒食子酸生成相關的微生物,如芽孢桿菌、乳酸菌、海棗曲霉(Aspergillusphoenicis)和塔賓曲霉(Aspergillustubingensis),這些微生物能夠產生單寧酶、羧酸酯酶以及葡糖苷酶等促進兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、表阿夫兒茶精-3-沒食子酸鹽(epiafzelechin-3-O-gallate,EAF-G)和7-沒食子兒茶素(7-galloylcatechin,7-GC)的水解反應,進而提高沒食子酸含量[14]。

酸茶沒食子酸的增加量(24.6 mg/g)遠大于兒茶素的減少量(4.3 mg/g)[3],表明厭氧發酵中存在多途徑促進高含量沒食子酸的形成,ECG、EAF-G和7-GC的水解并不是增加酸茶沒食子酸的主要來源。研究發現,細菌源的沒食子酸是厭氧發酵中高含量沒食子酸形成的另一途徑(圖1)。微生物除了能夠分泌單寧酶水解黃烷-3-醇沒食子酸酯合成沒食子酸之外,自身也能夠通過莽草酸代謝等途徑合成沒食子酸。芽孢桿菌和植物乳桿菌是兩種已被報道生產沒食子酸的關鍵微生物,它們能夠利用莽草酸脫氫酶合成沒食子酸[50]。

3.3 厭氧發酵能夠產生酸茶特有的抗氧化成分

間苯二酚和鄰苯三酚作為天然抗氧化活性成分存在于多種植物中,如摩洛哥堅果(Arganiaspinosa)和牛乳樹(Mimusopselengi)。間苯二酚的自由基清除活性相當于綠茶中的EGCG,它能夠以濃度依賴的方式降低人胚胎腎細胞系HEK293、人臍靜脈內皮細胞和急性T細胞白血病細胞的ROS水平,且沒有任何毒性作用[15]。鄰苯三酚不僅具有較高的抗氧化和抗糖基化活性,還能夠提高兒茶素的生物利用度。HIASA等[15]和ZHANG等[16]分別從日本酸茶Awaban-cha中分離鑒定出間苯二酚和鄰苯三酚,且這兩種多酚物質僅存在于厭氧發酵茶中。間苯二酚和鄰苯三酚的合成可能與兒茶素和沒食子酸的代謝有關,但生物合成途徑尚未清楚。

4 總結與展望

綜上所述,酸茶厭氧發酵能夠促進多種抗氧化物質生成,包括茶多酚等多種抗氧化活性成分和具有抗氧化作用的乳酸菌。在厭氧發酵過程中,曲霉屬的數量與菌群豐富度和多樣性相比非常低,而以乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌為主的微生物在厭氧環境中代謝活躍,成為酸茶發酵的優勢菌群。在厭氧發酵過程中,乳酸菌和酵母等優勢菌能夠產生多種有機酸,如乳酸、乙酸和琥珀酸,有助于提高酸茶抗氧化活性和形成“酸香”品質特征。大量的有機酸積累還能夠降低茶葉pH值,形成酸性發酵環境,從而提高茶多酚的穩定性,減少多酚物質(尤其是EGCG)的降解。植物乳桿菌ST和STDA10與發酵乳桿菌FTL10BR和FTL2311本身具有抗氧化活性,且對高濃度膽汁酸具有耐受性,能夠通過降低自由基含量和增強還原能力等機制發揮抗氧化作用,緩解多種氧化劑誘導的細胞損傷。

酸茶具有高含量沒食子酸水平,且厭氧發酵中存在多條沒食子酸合成途徑。與有氧發酵不同,少部分酸茶沒食子酸來自芽孢桿菌等細菌介導的ECG、EAF-G和7-GC等黃烷-3-醇沒食子酸酯水解,大部分可能來自微生物自身合成。在厭氧發酵過程中會產生酸茶特有的抗氧化性成分——間苯二酚和鄰苯三酚。目前,對酸茶的研究主要圍繞歷史文化挖掘和加工工藝優化方面,對酸茶健康功效的深入研究較少?，F有的功效研究表明厭氧發酵能夠促進酸茶多種抗氧化活性物質的生成,這些研究結果可以為進一步研究酸茶功效提供理論依據,也為新型功能性酸茶產品的開發提供一定的參考。