不同成熟期稀奶油干酪中蛋白質降解及關鍵風味物質產生的研究

范敏,王夢松,劉慧,張惠玲,魏超昆*

1(寧夏大學 食品與葡萄酒學院,寧夏 銀川,750021) 2(寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室,寧夏 銀川,750021)

稀奶油干酪是由添加了稀奶油的全脂乳制得的新鮮軟質干酪,不經成熟,生產后即可食用,具有奶油和酸奶的風味[1]。其口味柔和清淡,且含有許多對于人體有益的脂肪酸,如部分短鏈脂肪酸、α-亞麻酸、二十碳五烯酸[2]。目前,國內在奶油干酪方面已經做了一些研究;例如,姜姝等[3]以再制奶油干酪為研究對象,探究了不同條件超高壓對再制奶油干酪質構、流變及微觀結構的影響。盧曉明等[4]探究了奶油干酪的關鍵工藝參數。然而,這些研究主要集中在奶油干酪工藝及質構上,對于稀奶油干酪發酵過程中的關鍵風味物質還鮮見報道。

干酪成熟過程中主要涉及三類生化反應,包括糖酵解、蛋白水解和脂肪分解;這些反應不僅會改變干酪的物理化學性質,而且還會賦予干酪獨特的風味。就目前而言,探究干酪成熟過程中蛋白質降解已成為研究熱點,吳倩蓉等[5]通過對加工過程及不同殺菌溫度醬牛肉蛋白質降解的研究,探究加工方式對產品品質的影響。然而隨著研究的不斷深入,蛋白質降解在產品品質風味方面的研究也引發了廣泛的討論,王蔚新[6]研究了酸魚發酵過程中蛋白質降解及對風味的貢獻,發現蛋白質會在微生物及酶作用下降解成肽及氨基酸,能提高產品風味。解春芝[7]研究了腐乳發酵后氨基酸代謝及風味產生原理,最終得出,氨基酸會在轉氨酶、肽酶、蛋白酶及特定微生物的作用下產生小分子風味物質,進一步促進腐乳成熟。而稀奶油干酪作為一種新型的產品,在蛋白質降解與品質控制方面還缺乏研究。此外,偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)作為一種多元統計學分析方法,在風味物質的分類、降維以及篩選方面提供了有力支撐[8]。孫細珍等[9]應用風味檢測技術結合多元統計學分析對醛異味樣品和正常樣品進行判別分析,對兩種樣品進行有效的區分。丁習林等[10]采用主成分分析和PLS-DA等多元統計學方法,對不同KCl替代組宣威火腿進行有效區分。

稀奶油干酪的風味特性以及風味產生機理對于其品質及應用價值的提升非常重要,本研究以稀奶油干酪發酵階段為對象,在明晰不同發酵階段蛋白質降解規律的基礎上,深入研究干酪發酵過程中風味物質的動態變化,并采用PLS-DA結合香氣活性值(odor activity value,OAV)和變量權重值(variable importance for the projection,VIP),篩選出不同發酵時間干酪的關鍵風味物質,為稀奶油干酪加工及品質的提升提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稀奶油 (蛋白質質量分數2.6%,脂肪質量分數37%,碳水化合物質量分數4.6%),英國Pritchitts公司;2-辛醇,Sigma-Aldrich公司;BCA試劑盒,北京諾博萊德科技有限公司;醋酸、MRS培養基,Servicebio公司;三氯乙酸,上海宏瑞化工有限公司;鎘-茚三酮,青島海博生物;濃硫酸,上海裕納化工有限公司。

1.2 儀器與設備

島津Qp2010ultra氣相色譜-質譜聯用儀,日本Shimadzu公司;PHS-25酸度計,廣州銘睿電子科技有限公司;UPT-K1800全自動凱氏定氮儀,北京優譜通用科技有限公司;WJ-3恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;LT202E電子天平,常熟市天量儀器有限責任公司;XW-80A旋渦混合儀,上海嘉鵬科技有限公司;DILITCEN22離心機,蘇州貝銳儀器科技有限公司。

1.3 實驗與方法

1.3.1 樣品的制備

鮮奶油在15～18 MPa下均質后,在95 ℃下殺菌10 min。隨后冷卻到60～70 ℃時,加入檸檬酸(4.5%,質量分數)、攪拌,放置過夜排除乳清后,將成形的干酪置于真空包裝袋,于溫濕度為12 ℃、50%～55%的環境下成熟20 d。取樣點為0、5、10、15、20 d,以發酵0 d的樣品為對照組,放置于-20 ℃環境下等待檢測。

1.3.2 基礎理化指標的測定

1.3.2.1 水分、脂肪、蛋白質含量的測定

水分含量測定參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》;脂肪含量測定參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》;蛋白質含量測定按北京諾博萊試劑盒說明書進行。

1.3.2.2 pH值測定

參考王超等[11]方法,稍作修改。稱取5 g干酪于50 mL 去離子水中研磨勻漿后,用精密pH計進行測定。

1.3.2.3 蛋白水解程度的測定

總氮含量根據GB 5009.5—2016采用凱氏定氮法測定。pH 4.6-可溶性氮(pH 4.6-soluble nitrogen,pH 4.6-SN)和12%三氯乙酸-可溶性氮(12% trichloroacetic acid-soluble nitrogen,12% TCA-SN)根據賈宏信等[12]的方法測定。

1.3.3 蛋白酶活力及乳酸菌總數的測定

蛋白酶活力的檢測:參照SB/T 10317—1999;乳酸菌總數測定參照GB 4789.35—2016。

1.3.4 總游離氨基酸的測定

參照曹瑛瑛等[13]的方法,采用鎘-茚三酮法測定干酪中總游離氨基酸。

1.3.5 感官評定

參照后鵬飛等[14]的方法,對稀奶油干酪進行感官評定。

1.3.6 GC-MS定性及定量分析

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME):取4.0 g粉碎后的稀奶油干酪樣品于20 mL頂空瓶中,置于80 ℃頂空加熱爐內,加熱平衡30 min,將老化好的萃取頭插入頂空瓶中,吸附30 min。

GC條件:載氣為高純氦氣,流速:1.0 mL/min,不分流進樣。E-WAX ETR 色譜柱(30 m×0.25 mm,0.50 μm),升溫程序:起始柱溫35 ℃,保持2 min,以4 ℃/min升至120 ℃,以6 ℃/min升至180 ℃,最后以10 ℃/min升至230 ℃,保持10 min。

MS條件:電子電離源(EI),電子能量70 eV,離子源溫度240 ℃,傳輸線溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,掃描方式為全掃描。

定性定量分析:揮發性物質的定性是根據其質譜數據與NIST14與NIST14S數據庫進行匹配得出,僅將相似度大于80%的化合物進行定性。揮發物定量采用內標半定量法進行,含量表示為mg/kg[15]。

1.4 數據處理

樣品中GC-MS及質構的數據采用Excel進行平均值和標準偏差分析。采用SIMAC14.1軟件對樣品進行PLS-DA,SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析(P<0.05,差異顯著),利用Origin 2021b軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 稀奶油干酪基礎指標的分析

由表1可知,隨著成熟時間的推移,脂肪和蛋白質含量發生顯著變化,分別從36.31%和9.34%下降到34.13%和7.65%。pH值總體呈下降的趨勢,發酵0 d和5 d及10 d和15 d差異不顯著,但整個發酵階段有較大差異,從5.5下降到4.45;這可能是由于奶酪在成熟過程中在微生物及酶的作用下糖酵解產生乳糖,乳糖進一步分解形成酸類物質,從而降低pH[16]。水分含量隨著成熟時間的延長而降低;成熟初期水分含量較高,而到發酵中后期(10～20 d)水分流失較快。產生這種差異的原因可能是稀奶油干酪發酵過程中蛋白質發生降解,從而導致網狀結構的空隙逐漸變大,所以水分較易從空隙中脫落[17]?？偟恐饾u增加,這與稀奶油干酪發酵過程中的蛋白質降解有關。WSN含量是指在pH 4.6時干酪中游離大分子肽、小分子肽和游離氨基酸的總量[18]。由表1 可知,隨著成熟時間的延長,不同發酵階段稀奶油干酪中WSN含量差異顯著(P<0.05),其含量從0.45%增加到6.57%。12% TCA-SN主要包括小分子肽(2～20個殘基)和游離氨基酸的含量,主要是發酵劑中形成的微生物肽酶作用的結果[19];隨著成熟時間的延長,各發酵階段稀奶油干酪的12% TCA-SN差異顯著(P<0.05),由4.1%上升至6.6%,這是由于微生物衰退和自溶后,肽酶從凋亡的細胞體中釋放出來,大分子肽在肽酶和殘余凝乳酶作用下降解為小肽和游離氨基酸,從而導致12% TCA-SN含量逐漸增加?？傆坞x氨基酸則在發酵0～20 d持續上升,且在發酵20 d達到最大值(22.68±1.7) μg/mL;這是因為隨著發酵的進行,稀奶油干酪在微生物及內源蛋白酶作用下會降解蛋白質,進而產生游離氨基酸等非揮發性物質,有助于奶酪滋味的提升。而結合總氮含量、WSN和12% TCA-SN及游離氨基酸含量變化可以得出,稀奶油干酪在發酵過程中蛋白質發生降解。

表1 稀奶油干酪發酵過程中理化指標的測定

感官特征是消費者對產品接受程度的重要因素。稀奶油干酪在發酵過程中的感官評分如表1所示,各個階段感官得分差異顯著,且發酵10 d的感官評分最高;發酵10～20 d評分相較于0～10 d更高一些?？赡艿脑蚴窃诎l酵初期,奶酪的風味物質主要來源于乳酸菌代謝乳糖和檸檬酸產生的;而到發酵后期,乳酸菌自溶釋放出肽酶、脂肪酶,從而加速脂質和蛋白降解,產生更多風味物質。

2.2 稀奶油干酪乳酸菌總數和蛋白酶活力的分析

在稀奶油干酪成熟前期(0～10 d),蛋白酶活力隨著成熟時間的延長而增加,酶活力在10 d達到最高值(11.03±1.06) u/g,成熟10～20 d酶活力顯著下降(P<0.05)?？赡苁窍∧逃透衫以诎l酵后期菌種活力下降,且部分發生自溶及衰亡,從而導致蛋白酶活力下降。微生物在蛋白質降解過程中發揮著重要的作用,由圖1可知,隨著發酵的進行,稀奶油干酪中的乳酸菌總數先增加后降低,且在發酵10 d乳酸菌總數達到最大值,為1.48×106CFU/g,這與蛋白酶活力的變化趨勢相似,這可能是由于隨著成熟時間的延長,干酪營養物質消耗,碳源減少,不利于微生物的生長。而且在發酵過程中乳糖代謝產生乳酸,干酪中pH持續降低,從而導致微生物生長受到抑制。

圖1 稀奶油干酪在不同發酵時間的乳酸菌總數和蛋白酶活力的變化

2.3 稀奶油干酪揮發性風味物質的分析

根據以上理化指標和感官的測定,最終選取0、10、20 d研究其風味物質的變化。由表2可知,利用GC-MS對稀奶油干酪發酵過程中的揮發性風味物質進行鑒定,共鑒定出28種揮發性化合物,其中發酵0 d、發酵10 d和發酵20 d分別檢測出18、28和16種揮發性風味物質。由圖2可知,隨著成熟時間延長,稀奶油干酪中各類物質在種類和含量上均存在不同程度的差異。其中酸類物質的含量最高, 醛類物質的含量最低;隨著成熟時間的延長, 醇類、酸類、酮類和內酯類物質的含量先升高后降低;而其他類物質包括檸檬烯和二十一烷在發酵10 d達到最大值,發酵20 d沒有被檢測到。

圖2 不同發酵時間稀奶油干酪中揮發性化合物的相對含量

表2 不同發酵階段稀奶油干酪揮發性風味物質

GC-MS分析檢測到的10種酸包括乙酸、苯甲酸、異戊酸、癸酸、己酸、辛酸、壬酸、十一酸、丁二酸和3-甲基丙酸,其中大多數酸類化合物含量在成熟過程中存在統計學差異(P<0.05)。稀奶油干酪成熟過程中酸類物質形成主要來源于3個生化途徑:脂質水解、蛋白質降解和糖酵解。其中乳糖在微生物和酶的作用下經糖酵解代謝為乙酸,乙酸是奶酪的特征風味物之一,賦予奶酪酸味;其在稀奶油干酪發酵過程中只在發酵0～10 d被檢測到,且發酵10 d達到最大值,為(0.221 6±0.009 6) mg/kg。此外己酸、丁酸、辛酸、壬酸和癸酸等的形成與脂質水解有關;稀奶油干酪中的甘油三酯被微生物和內源酶水解成短鏈和中鏈脂肪酸以及脂肪進一步降解形成游離脂肪酸,短鏈脂肪酸在稀奶油干酪風味形成中起著重要作用;如癸酸會產生脂肪和柑橘氣味,己酸會產生甜味。但脂質的過度降解會產生令人不愉快的氣味,如己酸會產生汗味、刺鼻味和腐臭味,辛酸具有山羊味。最后,還有部分酸是由蛋白質降解、氨基酸代謝產生的;例如,異戊酸、3-甲基丙酸,這些支鏈脂肪酸大多來源于亮氨酸、異亮氨酸降解,賦予奶酪腐敗、酸臭氣味,是奶酪成熟的標志。

大部分醇類物質含有較高的閾值,所以其對干酪整體風味貢獻不大;在稀奶油干酪發酵過程中醇類物質可以與脂肪酸發生酯化反應,從而影響奶酪的風味。不同發酵階段共檢測到了4種醇類物質,包括1,2-戊二醇、2,3-丁二醇、2-苯乙醇和反-9-十八烯醇;大部分醇類在發酵0～10 d含量上升,而10～20 d則顯著下降,整個含量變化在成熟過程中存在統計學差異(P<0.05),這與酶活性有相似的趨勢。2,3-丁二醇和2-苯乙醇都源于氨基酸降解代謝;其中2,3-丁二醇在發酵0～10 d被檢測到,與多數醇類物質變化趨勢不同,2,3-丁二醇在發酵過程中顯著下降,其可由戊糖乳桿菌降解氨基酸產生,且賦予奶酪水果味。而2-苯乙醇則來源于酵母對苯丙氨酸的降解,其為奶油干酪增添了玫瑰香味。

酮類化合物風味獨特,閾值較低,對稀奶油干酪的風味形成起著十分重要的作用。圖2結合表2可得,稀奶油干酪中共檢測到5種酮類化合物,包括2-庚酮、乙偶姻、2-壬酮、2-十一酮和2-癸酮?？偟膩碚f,在發酵過程中酮類化合物呈現先增加后降低的趨勢,這可能與酮類物質的二次代謝有關。大部分酮類物質的形成與脂質的降解以及脂肪酸的β-氧化有關;如在念球菌的作用下游離脂肪酸會發生β-氧化進而形成2-庚酮和2-壬酮,這會賦予奶酪甜味、花香味和水果味。2,3-丁二酮(二乙酰)和乙偶姻是發酵乳制品中典型的風味物質,賦予奶酪奶油和奶酪風味,但本實驗未檢測到2,3-丁二酮,這可能與其穩定性差有關,其在還原酶的作用下很容易被還原為丙酮。

大多數的酯類化合物閾值較低,且常帶有花香和水果香味,其可以平衡脂肪酸帶來的刺激味和氨基酸產生的苦味[20]。本實驗中,沒有檢測到酯類物質,但檢測到4種內酯類物質包括丁位壬內酯、丁位癸內酯、丁位辛內酯和丁位十二內酯。隨著發酵時間的延長,這些內酯類物質含量先上升后降低,但總的來說內酯類物質是發酵20 d含量最高的物質。大多數內酯類物質都是脂質加熱氧化而產生的。

醛類物質主要源于脂質和脂肪酸的β-氧化以及氨基酸的降解。稀奶油干酪發酵過程中共檢測到兩種醛包括苯乙醛和十一醛,且都只出現在發酵10 d,這是因為醛類的化學性質不穩定,易被還原成相應的醇,因此這類化合物在乳制品中含量較低。苯乙醛是苯丙氨酸在腸球菌、芽孢桿菌和芳香氨基酸轉移酶等共同作用下產生的,其賦予奶酪花香和蜂蜜般的香氣。

2.3.1 稀奶油干酪中揮發性化合物的PLS-DA

PLS-DA是一種將數據進行降維,實現復雜數據的可視化及判別分析和預測[21];同時還可以揭示不同發酵時間段與相應的揮發性物質之間的相關性,具有相似風味物質的樣品相互靠近,否則距離較遠。由圖3-a可知,樣品分布分散,所以該建模方法能較好地區分不同發酵時間稀奶油干酪。擬合模型預測成分的累計統計量R2X=0.91、模型解釋率參數R2Y=0.989、預測能力參數Q2=0.965,均高于0.5,說明該模型對不同發酵時間的稀奶油干酪具有較好的預測能力。最后還觀察到發酵10 d位于第三象限;0 d和20 d則分別位于第二和第四象限,其中發酵10 d與中心原點距離較遠,所以其對模型貢獻率較大。

a-得分圖;b-載荷圖;c-置換檢驗圖;d-VIP排序圖

揮發性化合物對模型的貢獻還可以通過PLS載荷圖反映出來(圖3-b),距離樣品及中心點越近,其對模型的貢獻越大。由圖3-b可知,乙偶姻、丁二酸、苯乙醇、辛酸、異戊酸、苯甲酸、丁位辛內酯、丁位癸內酯在載荷圖中位于第3象限,表明這幾種物質為發酵10 d主要風味物質。同理,癸酸、壬酸和丁位壬內酯等揮發性物質為發酵0 d的主要風味物質。

最后,采用置換檢驗(重復次數200)對PLS-DA模型進行驗證,由圖3-c可知,R2=0.2,Q2=-0.2,且Q2與y軸的截距小于零,表明該模型未過擬合,模型穩定性和預測能力較好,可以用于解釋不同發酵時間稀奶油干酪風味的差異。

VIP可進一步直觀反映變量對模型分類的整體貢獻度,VIP(VIP>1)越高,化合物對稀奶油干酪的貢獻就越大。由圖3-d可知,VIP>1.0的風味物質有11種,這些物質可以作為判別不同發酵時間段的重要物質,分別為癸酸、苯甲酸、二十一烷、丁位癸內酯、2-癸酮、己酸、2,3-丁二醇、2-庚酮、反-9-十八烯醇、檸檬烯、異戊酸。其中苯甲酸和異戊酸分別為氨基酸代謝的產物,賦予奶酪堅果味和奶酪奶油味,是干酪特征風味物質。丁位癸內酯是脂質在高溫下β-氧化而產生,賦予奶酪水果味和甜味[22]。癸酸和己酸分別提供綿羊般的氣味,是奶酪不愉快氣味的來源;然而己酸的含量在發酵后期下降,這可能歸因于脂多酸會經歷二次代謝(氧化和酯化)以產生醛,醇和酯[23]。2-庚酮的閾值較低,為140 μg/L,賦予奶酪草本氣味。2,3-丁二醇是由脂肪酸的自動氧化還原甲基酮而產生的,它表現出奶油的特征氣味[24]。

2.3.2 稀奶油干酪中揮發性化合物的OAV分析

根據OAV可以確定不同發酵階段下稀奶油干酪的關鍵風味物質(表2),其中4種風味物質在整個發酵階段都存在,包括2-庚酮、乙偶姻、2-十一酮和丁位癸內酯;乙偶姻是一種具有乳制品和過熟水果氣味的特征風味化合物,通過乳酸菌的作用與檸檬酸鹽和乳糖代謝有關,也可以通過氨基酸分解代謝產生,它可以在發酵過程中轉化為2,3-丁二醇[25]。檸檬烯和2,3-丁二醇只在發酵前期被檢測到,苯乙醛只在發酵10 d被檢測到,這可能微生物及蛋白酶活性有關。丁位十二內酯只在發酵后期被檢測到,這與脂質發生β-氧化有關。

2.3.3 OAV結合VIP確定關鍵風味物質

OAV結合VIP最終確定2-庚酮、乙偶姻、2-十一酮和丁位癸內酯、2,3-丁二醇、丁位十二內酯、癸酸、苯甲酸、二十一烷、2-癸酮、己酸、反-9-十八烯醇、檸檬烯、異戊酸和苯乙醛為稀奶油干酪發酵過程中對風味貢獻較大的物質。2,3-丁二醇、苯甲酸、異戊酸和苯乙醛的產生與蛋白質降解有關,分別是亮氨酸和苯丙氨酸在支鏈氨基酸轉移酶和芳香氨基酸轉移酶作用下的代謝產物。異戊酸和苯乙醛在發酵10 d達到最大值,這與蛋白酶活性及菌落總數變化趨勢一致。

3 結論

本實驗研究了稀奶油干酪在0～20 d成熟過程中理化指標、蛋白質降解量、酶活力、乳酸菌總數的動態變化,結果表明,隨著發酵時間的延長,微生物發酵干酪導致pH和水分逐漸下降,蛋白質分解量增加,而到發酵后期(10～20 d)蛋白酶活力和乳酸菌總數顯著下降,可能是因為酸性環境對微生物生長有抑制作用,且在發酵后期菌種會衰退自溶,導致酶活性下降。通過對揮發性化合物檢測發現,在發酵過程中風味化合物的總量呈下降趨勢,發酵10 d的風味物質最豐富;2-庚酮、乙偶姻、2-十一酮、丁位癸內酯、2,3-丁二醇、丁位十二內酯、癸酸、苯甲酸、二十一烷、2-癸酮、己酸、反-9-十八烯醇、檸檬烯、異戊酸和苯乙醛為稀奶油干酪發酵過程中的關鍵風味物質,其中,2,3-丁二醇、苯甲酸、異戊酸和苯乙醛與蛋白質降解有關,分別賦予奶酪水果味、堅果味、奶酪味和杏仁味。綜上所述,在稀奶油干酪成熟期間,微生物和酶會促進其蛋白質降解,并產生風味物質;進一步結合感官評價的結果,我們最終得出稀奶油干酪最佳成熟時間是發酵10 d,此期間的干酪香氣濃郁,微彈性、易于吸收,營養豐富。因此本研究可為稀奶油干酪加工和產品開發提供理論依據,但稀奶油干酪風味形成的內在機理有待進一步研究。