基于代謝組學研究蔬菜面條在高溫貯藏環境中的變化

陳麗君,鄧吉斯,金子涵,陳雪寒,蔡甜,陳科偉,4,5*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(西南大學 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心,重慶,400715) 3(西南大學 化學化工學院,重慶,400715)4(西南大學 中匈食品科學合作中心,重慶,400715) 5(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室,重慶,400715)

面條作為亞洲傳統的大宗主食品之一[1],在人們的日常生活中充當著重要的角色。據統計,我國用于加工面條的小麥粉約占小麥粉總量的40%[2]。TRAYNHAM等[3]認為傳統面條營養價值并不理想,主要體現在其蛋白質含量較低,缺乏人體需要的部分礦物質及維生素。此外,汪楨等[4]認為小麥在加工工程中,其營養品質會有一定程度的損耗。BATIFOULIER等[5]也指出,制粉后的小麥,保留的維生素B1只占據總體的43%。而隨著人們生活水平的不斷提高,消費者對于面條的需求已逐漸轉變為對面條多樣化、優質化、營養化的需求。因此,在消費需求和技術升級[6]的雙重要求下,谷物面條、蔬菜面條等營養功能型面條越來越受到消費者的歡迎。其中,蔬菜面條相比于普通面條而言,其維生素及礦物質等營養物質[7]均有一定增加。曹慶穗等[8]認為蔬菜面條不僅提高了面條的營養價值,還可增加消費者的食欲,使膳食多樣化。

近年來,有關蔬菜面條的研究不斷深入。李翼岑等[9]、杜傳來等[10]、陳育楷等[11]以蔬菜面條的感官特性、熟斷條率及吸水率為指標,利用優化實驗已研制出不同蔬菜原料的蔬菜面條配方,張暢等[12]研究了制作蛹蟲草蔬菜魚肉面條的創新工藝。目前,大部分研究都基于蔬菜面條的配方完善與工藝升級,關于蔬菜面條貯藏期間品質變化的研究也大多停留在其色澤、蒸煮品質、質構特性等方面的探討,而有關于其分子水平下的物質變化研究鮮有報道。

姜黃是常用的藥食同源原料,因其含有豐富的姜黃素而具有較強的抗炎癥活性;胡蘿卜中含有豐富的胡蘿卜素、葉酸及膳食纖維;紫甘藍含有豐富的花青素、維生素及膳食纖維;菠菜中維生素、礦物質、膳食纖維含量也較高。上述4種原料均是制作蔬菜面條的優質原料,成型的面條分別具有黃、橙、紫、綠等顏色,滿足消費者膳食多樣化的需求。本實驗在對這4種蔬菜面條在貯藏期間發生的色澤、質構特性變化的研究基礎上,基于超高效液相色譜-高分辨質譜(ultra performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry,UPLC-HRMS)聯用的非靶向代謝組學,分別在APCI、ESI 2種離子源的正、負離子2種電離模式下,對不同貯藏時間下的不同種類蔬菜面條樣本進行數據采集,并通過火山圖代謝物豐度分析、正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)等多因素分析方法,篩選其顯著性差異化合物,以進一步探討蔬菜面條在貯藏期間的代謝組變化規律。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中筋小麥面粉,益海嘉麗金龍魚糧油食品股份有限公司;谷朊粉,高要市蜜丹兒商貿有限公司;姜黃、胡蘿卜、紫甘藍、菠菜,均為市售。

1.2 儀器與設備

MJ-PB12Easy219破壁機,廣東美的集團股份有限公司;YP-B10002電子天平,上海光正醫療儀器有限公司;拜杰JCD-5型壓面機,安徽鑫佰客電子商務有限公司;DPH-9052型電熱恒溫培養箱,上海齊欣科學儀器有限公司;MiniSpin微型高速離心機,德國漢堡艾本德生命科學公司;Vortex-2渦旋混勻儀,上海滬析實業有限公司;CT3質構儀,美國布魯克菲爾德公司;WR-18型精密色差儀,深圳市威福光電科技有限公司;Agilent 1290 infinity II超高效液相色譜儀,美國Agilent公司;Bruker Impact II 四級桿-飛行時間質譜儀,德國Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蔬菜汁制備

參照陳育楷等[11]的方法,將姜黃、胡蘿卜稱取洗凈后切成小塊,將菠菜、紫甘藍去根莖、去殘葉、淋洗清潔后,適當切小,放入破壁機中,加水后榨汁(胡蘿卜、姜黃和水的料液比為4∶1,菠菜、紫甘藍和水的料液比為6∶1)。將所得汁液用網篩過濾以除去榨渣及雜質,以待后續使用。

1.3.2 蔬菜面的制作及其貯藏

將140 g小麥面粉,10 g谷朊粉加入和面盆中,將40 mL蔬菜汁多次少量加入后,充分混勻,手工和面5 min。將面團放入壓面機中,切換設備為揉面狀態,當面團表面光滑無凸起時,將面團從設備中取出,包裹保鮮膜以熟化,10 min后,使面團內部結構更加穩定。熟化10 min后,將面團放入壓面機中,并切換設備為壓面狀態,調好擋位,反復壓延至得到均勻厚度為2 mm的面片時,切換設備為切面狀態,得到所需蔬菜面條。將制作好的蔬菜面條自然晾干后,放入50 ℃恒溫恒濕(相對濕度55%)箱中進行貯藏。分別于0、7、14、21、28 d取樣,密閉封裝,置于-23 ℃保存,以待后續測定。

1.3.3 蔬菜面色澤測定

色差儀采用L*a*b*色空間法分別測定不同種類的蔬菜面條的色澤,其中L*表示面條的亮度值,a*值表示面條的紅綠度,b*值表示面條的黃藍度。每個樣品重復測定10次,取平均值作為最終測試結果。

1.3.4 蔬菜面質構特性測定

1.3.4.1 面條的烹煮處理

參考王靈昭等[13]的方法,取適量面條于沸水中,烹煮5 min后,立即將面條撈出,浸于涼水中10 s,后淋水5 min,放置于托盤中以待后續測定。

1.3.4.2 全質構分析(texture profile analysis, TPA)測定

采用質構儀的TPA模式測定蔬菜面條的質構特性,測試用探頭為TA10,設置測前速率、測試速率、測后速率均為:0.8 mm/s,壓縮程度為75%,2次壓縮停留時間間隔為10 s,觸發值為5 g[14];TPA主要研究指標為硬度、彈性、黏結性等。每個樣品重復測定8次,去除最高值和最低值,取平均值作為最終測試結果。

1.3.5 代謝物檢測分析

1.3.5.1 代謝物提取

將樣品研磨至細膩粉末狀,取1 g裝入5 mL離心管中,加入1 mL的80%(體積分數)丙酮水溶液提取,渦旋充分振蕩后,靜置5 min。于8 000 r/min下離心5 min,用0.2 μm濾膜過濾后于-20 ℃保存,每1組代謝物設置6組平行樣品,用于后續LC-HRMS分析。

1.3.5.2 超高效液相色譜質譜條件

采用UPLC-HRMS進行,UPLC型號為Agilent 1290,配有自動進樣系統。液相分析條件:分析柱為C18柱(Poroshell 120, 1.9 μm),2.1 mm×100 mm,并配有同等材質的保護柱。UPLC流速0.2 mL/min,流動相A為V(甲醇)∶V(水)=8∶2,流動相B為V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1,流動相中均加入10 mmol/L 乙酸銨,進樣量為10 μL。采用梯度洗脫程序:0～15 min,25% B～100% B;15～25 min,100% B;25.1～30 min,25% B。質譜條件為:利用ESI和APCI源對4種蔬菜面條樣品分別進行正離子、負離子模式下的質譜分析,進行MS及MS/MS掃描。正離子模式設置參數為:質量范圍 60～3 000m/z,霧化氣流速為2 Bar,干燥氣流速為8 L/min,干燥氣溫度為220 ℃。毛細管電壓為4 500 V,末端平板電壓為500 V,裂解能量7 eV。負離子模式設置參數為:質量范圍 300～3 000m/z,霧化氣流速為2 Bar,干燥氣流速為 8 L/min,干燥氣溫度為220 ℃。毛細管電壓為3 500 V,末端平板電壓為500 V,裂解能量10 eV。

1.4 數據統計分析

利用MS-DIAL提供的Abf Converter將數據轉換為Abf.格式后,通過MS-DIAL對數據進行峰對齊、矯正保留時間、提取峰面積操作,然后匹配MS/MS數據庫及軟件自建二級質譜數據庫進行代謝物注釋,按不同樣品中同一代謝物的不同峰面積構建代謝物峰表,采用基迪奧平臺對同一種類的蔬菜面條,在不同貯藏時間的數據進行兩兩比較,分別進行T檢驗、火山圖分析、OPLS-DA等多元統計分析,結合變量投影重要性(variable important in projection,VIP)值、差異倍數(fold change,FC)值、P值對樣本進行差異化合物的篩選。采用Excel對數據進行初步分析,后利用Origin 2019軟件繪制相關變化關系圖。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏時間下蔬菜面條的色澤變化

不同種類的蔬菜面條顏色指標隨貯藏時間變化如圖1所示。結果表明:隨著貯藏時間的延長,姜黃、胡蘿卜、紫甘藍、菠菜面條的L*值皆不斷下降,亮度降低,面條顏色發暗,該結果與陳艷等[14]得出的小麥面條隨貯藏時間變化的L*值降低的結論一致。本實驗中蔬菜面條L*值在10 d內的下降趨勢最明顯,10 d后變化幅度較小,逐漸趨于穩定,這與郭穎等[15]的研究結果部分吻合。姜黃、胡蘿卜、紫甘藍、菠菜面條的b*值皆隨著貯藏時間的延長不斷上升,黃度上升,面條顏色變黃,該結果與張芹等[16]認為面條色澤變化與脂肪氧化顏色加深,掛面面筋在貯藏過程中顏色發暗有關,即b*值不斷上升的研究結論一致。本實驗中姜黃面條、菠菜面條的b*值上升較為顯著。造成這種變化的原因一方面是小麥粉的顏色隨貯藏時間的延長,逐漸由乳白色變為淡黃色[17];而另一方面的原因為植物中色素、多酚含量及穩定性差異所導致的,JIANG等[18]認為游離態酚類能顯著影響面條褐變的程度。相比于L*、b*值,a*值的變化較小,幾乎沒有顯著變化。

a-姜黃面條;b-胡蘿卜面條;c-紫甘藍面條;d-菠菜面條

2.2 不同貯藏時間下蔬菜面條的質構特性變化

不同種類的蔬菜面條其質構特性隨著貯藏時間的變化如圖2所示。結果表明:隨著貯藏時間的延長,4種蔬菜面條的硬度都逐漸升高,且上升趨勢較為明顯。閆慧麗等[19]認為面條在常溫貯藏環境中,面粉中的蛋白質與淀粉并未充分結合,其面筋網絡結構遭到一定程度的破壞,導致其蛋白質和淀粉在烹煮過程中流失,所以其硬度隨之下降,而本實驗中4種蔬菜面條硬度隨貯藏時間延長而升高,導致這一不同的原因可能是本實驗中,模擬加速貯藏的環境溫度為50 ℃高溫,高溫環境加速了面條中水分的流失,而導致了面條硬度上升,這與張芹等[16]研究貯藏溫度對面條品質影響中的結果相符合。隨著貯藏時間的延長,4種面條的彈性皆先逐漸增大再減小,彈性是由麥谷蛋白內部的網絡化結構所影響的[20],而這一變化可能是由小麥粉在貯藏期間,其低分子質量麥谷蛋白含量逐漸降低,高分子質量麥谷蛋白含量增加所導致的,而面粉中的麥谷蛋白微觀網絡結構的完整性隨貯藏時間的延長而遭到一定程度的破壞,導致面條彈性在貯藏后期下降。隨著貯藏時間的延長,蔬菜面條的黏結性總體呈上升趨勢,這一變化產生的原因可能是高溫使面條的內部分子作用力增強,使面條黏聚在一起的內聚力增大,所以表現為黏聚力上升。而隨著貯藏時間的延長,姜黃、胡蘿卜、紫甘藍、菠菜面條的咀嚼性隨硬度的上升表現為上升趨勢。

a-硬度;b-彈性;c-黏結性;d-咀嚼性

2.3 不同貯藏時間下蔬菜面條代謝物的代謝組學檢測分析

基于UPLC-HRMS技術分別在APCI、ESI 2種離子源的正、負離子2種電離模式下對不同貯藏時間下的不同種類蔬菜面條樣本進行數據采集。將0、28 d的蔬菜面樣品進行比較,經過預處理的數據在APCI、ESI離子源正離子模式下保留了17 336個峰,負離子模式下保留了19 674個峰,剔除可能的假陽性代謝物后,共鑒定出6 568種代謝物,以FC>2,VIP>1,P值<0.05作為篩選標準后,在正、負離子模式下分別篩選出243種、129種差異代謝物,共得到372種差異化合物含量信息。從整體而言,無論是APCI離子源下的2種模式,還是ESI離子源下的2種模式,正離子模式下所檢測出的差異化合物比負離子模式下的差異化合物更為豐富,說明正離子模式下對蔬菜面條中的差異化合物的檢測覆蓋率更高、種類更豐富。

2.4 不同貯藏時間下蔬菜面條代謝物OPLS-DA

2.4.1 OPLS-DA

OPLS-DA作為偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)的擴展[21],因其可以在有監督的前提下進一步放大樣本組間差異,更好地表達樣本的離散趨勢,且相較于PLS-DA,濾除了與分類信息無關的噪音,進一步提高模型的解釋和預測能力,已成為代謝組學中常用的分析方法。對預處理后的蔬菜面條樣本數據采用有監督的OPLS-DA,并進行建模處理。這里以ESI離子源下的貯藏時間為0、28 d的胡蘿卜面條的OPLS得分圖為例,對其進行分析闡述。其正、負離子模式下的OPLS得分圖如圖3所示。

a-ESI離子源正離子模式下的OPLS-DA得分圖;b-ESI離子源負離子模式下的OPLS-DA得分圖

由圖3可知,貯藏時間分別為0、28 d的胡蘿卜面條樣品,在OPLS-DA模型中較好地分成2組,每組里包含6個數據點,表明2組樣品數據有較好的可重復性,因此可用于后續分析。此外,2組樣本都置于95%置信區間內,區分顯著,表明貯藏時間分別為0、28 d下的胡蘿卜面條,其相關代謝物有顯著差異,差異體現在代謝物類別、數量、濃度等方面。其中正離子模式下的胡蘿卜面條得分圖中,R2X=0.933,R2Y=0.98,Q2Y=0.971;而負離子模式下的胡蘿卜面條得分圖中,R2X=0.931,R2Y=0.975,Q2Y=0.965。其中R2X、R2Y分別對應該模型對于自變量X、因變量Y的解釋率,Q2Y表示模型的預測能力,且三者值越接近1,表示模型的預測及解釋能力越可靠。因此,上述2個模型穩定性較好,具有穩健可靠的預測及解釋能力,能很好的解釋貯藏時間分別為0、28 d的胡蘿卜面條樣本間的差異。

2.4.2 OPLS-DA模型檢驗

不同于主成分分析(principal component analysis,PCA)、非線性映射等無監督的統計分析方法,有監督的多變量統計分析方法,如PLS-DA、OPLS-DA可以進一步放大樣品組間差異,更好地表達其離散趨勢,方便進一步篩選差異化合物。同時,有監督的多變量統計分析方法也存在一定缺點,即模型可能出現過擬合現象,表現為當用模型來預測新的樣品集時,其預測能力較差。因此對于此類模型,仍需驗證模型的可靠性,避免其出現過擬合現象。本實驗采用OPLS-DA置換檢驗方法來檢驗模型。這里仍以ESI離子源下的貯藏時間為0 d和28 d的胡蘿卜面條的OPLS-DA置換檢驗模型為例,對其分析進行闡述。其正、負離子模式下的OPLS-DA置換檢驗圖如圖4所示。

a-ESI離子源正離子模式下的OPLS-DA置換檢驗圖;b-ESI離子源負離子模式下的OPLS-DA置換檢驗圖

一個可靠的有監督模型要求其回歸線在Y軸上的截距小于0,即Q2<0,即可證明該模型不存在過擬合現象,模型可靠。由圖4可知,正、負離子模式下的Q2<0,表明OPLS-DA模型不存在過擬合現象,進一步驗證了所建OPLS-DA模型能有效地區分2組樣本。

2.5 不同貯藏時間下蔬菜面條差異化合物豐度變化分析

在ESI和APCI正、負離子模式下,在鑒定出6 568種代謝物中,本實驗以差異倍數FC>2,VIP>1,P值<0.05作為顯著差異化合物篩選標準,對同種類蔬菜面條的不同貯藏時間下的樣品兩兩進行比較,繪制火山圖。在鑒定出的372種差異化合物中,APCI離子源下篩選出219種差異化合物,ESI離子源下篩選出153種差異化合物,綜合比較,APCI離子源下篩選出的代謝物更為豐富,同時因其正離子模式下代謝物檢出覆蓋率更高,因此,以APCI離子源正離子模式下的檢測樣本分析貯藏時間為0、28 d的蔬菜面代謝物豐度,結果如圖5所示。以胡蘿卜面條代謝物為例(圖5-b),APCI離子源下通過比較該2組樣品共得到126種差異化合物,其中上調的代謝物有81種,下調的代謝物有45種。

a-姜黃面條;b-胡蘿卜面條;c-紫甘藍面條;d-菠菜面條

2.6 不同貯藏時間下蔬菜面條顯著性差異化合物篩選

代謝物的FC能夠反映該代謝物在2組樣本之間的表達倍數關系,由于FC的絕對值越大,表示該代謝物在2組樣本間的含量差異越大,因此通過更嚴格的篩選標準,即FC>2.5,VIP>1、P<0.5,進一步比對篩選,并統計出4種不同種類蔬菜面條隨著貯藏時間變化而鑒定出的顯著性差異化合物,姜黃面條、胡蘿卜面條、紫甘藍面條、菠菜面條隨著貯藏時間變化而鑒定出的顯著性差異化合物如表1所示。

表1 四種蔬菜面條隨貯藏時間變化而鑒定出的顯著性差異化合物

由表1可知,隨著貯藏時間的延長,蔬菜面條的顯著性差異化合物中,花椒堿等生物堿,煙酰胺等維生素、胡蘿卜甾醇等植物甾醇等物質含量呈現上調變化,可能與花椒堿、胡蘿卜甾醇等在貯藏過程中由結合態轉變成為游離態有關。亞油酸、γ-亞麻酸等脂肪酸,甘草素等黃酮類化合物,茄酸、莨菪堿等生物堿,多酚類化合物與萜苷類化合物等物質含量呈現下調變化。亞油酸、γ-亞麻酸等不飽和脂肪酸因其氧化速率較快,導致其含量不斷降低,且貯藏溫度越高,脂肪氧化速率越快[22]。菠菜、胡蘿卜中維生素C、多酚等抗氧化活性物質含量較高,具有良好的抗氧化活性,而隨著貯藏時間的延長,多酚類化合物含量隨之下降,營養價值降低。本實驗發現的差異化合物可以進一步作為蔬菜面質量與品質控制的指標,通過對比差異化合物的理化性質與變化規律進一步完善蔬菜面條加工工藝與貯藏條件,以求最大程度保留其營養價值,而關于部分生物堿等小分子物質在蔬菜面條中的變化與面條品質關系的探討還有待進一步研究。

3 結論

通過本實驗結果發現,隨著貯藏時間的延長,姜黃、胡蘿卜、紫甘藍、菠菜4種蔬菜面條在色澤、質構特性、代謝化學成分3個方面都發生了顯著變化。隨著貯藏時間延長,4種蔬菜面條的L*值都不斷下降,表現為面條亮度降低,顏色發暗;而b*值隨貯藏時間的延長不斷上升,表現為面條黃度上升,顏色變黃;a*值無明顯變化。隨著貯藏時間的延長,4種蔬菜面條的硬度都逐漸升高,彈性逐漸增大后減小,黏聚性總體增大。通過非靶向代謝組學分析方法獲得的6 568種代謝物信息中,根據篩選標準(FC>2,VIP>1,P<0.05)共篩選出372種差異化合物,其中有24種顯著性差異化合物(FC>2.5,VIP>1,P<0.05)。隨著貯藏時間的延長,4種蔬菜面條中的多酚類、黃酮類、脂肪酸類物質都表現為顯著下調,而部分植物甾醇、維生素、生物堿等物質表現為顯著上調。研究結果可為后續蔬菜面條營養保健功能及質量標準控制提供借鑒和參考。