響應面優化橄欖仁紅皮黃酮提取及組成分析

徐瑩,鄒平,徐榮

(常州大學 石油化工學院,江蘇省綠色催化材料與技術重點實驗室,江蘇 常州,213164)

橄欖是我國珍貴的藥食兩用資源,具有較高的營養價值和藥用價值,橄欖中含有豐富的裂環烯醚萜類化合物[1],當暴露在光照、高溫、堿性和酸性環境中時,很容易分解為黃酮[2]。橄欖黃酮具有防治肝病[3]、抗炎癥[4]、抗氧化[5]、抗病毒[6]和解毒[7]等藥理功效,在現代生物化學、日用化學品、制藥行業、食品行業以及精細化工等領域都有廣泛的應用。目前,尚未有對橄欖仁紅皮中的黃酮類化合物的研究。

提取黃酮類化合物的常見方法包括有機溶劑萃取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法以及酶法輔助提取法[8]等。酶法輔助提取中使用的酶脆弱且易失活導致提取成本較高[9]。劉玉紅[10]采用超聲和微波2種技術分別提取橄欖總黃酮,其得率均不足2%。CHENG等[11]采用75%(體積分數)乙醇-水溶液提取甘草中的黃酮類化合物,并對其結構進行鑒定,研究表明了乙醇-水溶液提取的黃酮類化合物活性較高。

本文以橄欖仁紅皮為研究對象,采用乙醇-水溶液進行萃取,在單因素的基礎上通過響應面分析方法得到橄欖仁紅皮黃酮類化合物(flavonoid from red skin of olive kernel, FRSOK)最佳提取工藝,采用液相色譜-質譜聯用(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)技術對最優條件下提取液中黃酮類化合物進行分析,從DPPH自由基清除率、羥自由基清除率以及超氧陰離子自由基清除率三方面測定黃酮類化合物的抗氧化活性,以提高FRSOK得率,為進一步開展植物黃酮的研究和開發應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油橄欖仁紅皮,廣東省云浮市郁南縣;蘆丁(分析純),阿拉丁試劑有限公司;無水乙醇(分析純),上海沃凱生物技術有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵(分析純),上海凌峰化學試劑有限公司;氯化鋁·六水、30%過氧化氫、福林酚試劑、去離子水(H2O)、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、水楊酸、鄰苯三酚、DPPH、抗壞血酸、鄰二氮菲(分析純),國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

721 N可見光分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;MDF-U5412低溫冰箱,三洋電機株式會社;SHB-ⅢA環水式真空泵,上海聚昆儀器設備有限公司;100～1 000 mL移液槍,Shanghai jiaan Analyzer Factory;DF-Ⅱ數顯集熱式磁力攪拌器,金壇市杰瑞爾電器有限公司;UV-3600紫外可見近紅外分光光度計,島津企業管理(中國)有限公司;ATY224精密電子天平,常州萬泰天平儀器有限公司;Tissuelyser-48高通量組織破碎儀,上海凈信;Q Exactive質譜儀、Reacti-thermo氮氣吹掃儀,Thermo;Acquity UPLC,Waters;XH-T漩渦混合器,新寶儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取試驗

具體操作參考文獻[12],修改如下:

通過粉碎機將橄欖仁紅皮破碎成粉,過80目篩備用。稱取5.00 g紅皮粉于燒杯中,加入乙醇-水溶液,保鮮膜封口,放入恒溫磁力攪拌機中,按不同提取要求進行單因素試驗和響應面實驗。浸提完畢后進行抽濾,抽濾得到上清液即為提取液。將提取液在溫度55 ℃,轉速50 r/min下進行旋轉蒸發,去除多余的乙醇后得到濃縮液,凍干保存得到粗橄欖仁紅皮提取物粉末。

1.3.2 單因素試驗

對FRSOK提取的影響因素:料液比(g∶mL)為m(橄欖仁紅皮)∶V(乙醇)=1∶5～1∶25、提取時間5～35 min、乙醇體積分數0%～100%、提取溫度25～65 ℃進行單因素試驗,稱取5.0 g FRSOK粉末,采用控制變量法,對總黃酮類化合物進行提取并計算得率,如公式(1)所示:

(1)

式中:m1,提取液中黃酮含量,g;m2,橄欖仁紅皮質量,g。

1.3.3 響應面優化測試

根據“1.3.2節”單因素試驗結果,選擇提取時間、提取溫度、乙醇體積分數以及料液比為因子,以黃酮提取量為響應值,利用Design-Expret8.0.6軟件分別對橄欖仁紅皮進行曲面響應試驗,得到二元多項式回歸方程,進行重復試驗。

1.3.4 檢測方法

1.3.4.1 橄欖仁紅皮總黃酮含量的測定

FRSOK含量的測定方法參考文獻[13],修改如下:取10 mg蘆丁標準品配制50 mg/mL對照液,稀釋成0.0～50.0 mg/mL不同質量濃度梯度,再加入5 mL 10 g/L AlCl3溶液,搖勻后靜置10 min,以吸光度值(y)為縱坐標,蘆丁含量(x)為橫坐標在415 nm處測定吸光度并繪制標準曲線圖。取200 mL樣品溶液加30%(體積分數)乙醇-水溶液定容至5 mL再加入5 mL 10 g/L AlCl3溶液,搖勻后靜置10 min,在415 nm 處測定吸光度,可計算出樣品液中總黃酮含量。

1.3.4.2 超聲輔助實驗對比

根據單因素試驗結果設計超聲輔助實驗:稱取5.00 g橄欖仁紅皮粉于燒杯中,加入25 mL蒸餾水,分別超聲5、10、15、20、25、30 min后,加入25 mL的無水乙醇,轉入恒溫磁力攪拌器中浸提30 min,均在恒溫55 ℃下浸提。在分別按照“1.3.4.1節”的檢測方法進行檢測,做3組平行實驗,取平均值。此基礎上比較超聲輔助時間對FRSOK提取量影響。

1.3.5 抗氧化能力測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力測定試驗參照文獻[14],稍作改進。樣品為2 mL FRSOK溶液(0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.12、0.24 mg/mL)和2 mL 0.1 mmol/L DPPH自由基溶液(95%乙醇溶解)?？瞻诪?5%乙醇2 mL+0.1 mmol/L DPPH自由基2 mL。室溫下,避光反應30 min,用分光光度計在517 nm處測定。DPPH自由基清除率計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A樣、A0分別代表樣品和空白的吸光度。

1.3.5.2 羥自由基(·OH)清除能力測定

·OH清除能力測定試驗方法參照文獻[15],稍作改進?；旌衔镉? mL 1,10-菲啰啉(5 mmol/L)和4 mL FeSO4(5 mmol/L)組成,然后加入3 mL磷酸鹽緩沖液(16 mL 0.2 mol/mL磷酸二氫鈉+84 mL 0.2 mol/mL磷酸氫二鈉配制,pH=7.4),再加入3 mL H2O2(0.01%)和4 mL FRSOK樣品液,將混合液搖勻后靜置1 h,在536 nm處測量吸光度。對照:用蒸餾水代替FRSOK溶液,其他試劑與樣品相同?？瞻?用蒸餾水代替H2O2,其他試劑與樣品相同?！H清除率計算如公式(3)所示:

(3)

式中:A樣、A損和A0分別代表樣品、對照和空白的吸光度。

1.3.5.3 超氧陰離子自由基清除

參考文獻[16],修改如下,取1.5 mL樣品液,再分別按順序加入0.5 mL 0.30 mmol/L氯化硝基四氮唑藍(pH 8.0 Tris-HCl配制)、0.5 mL 0.468 mmol/L NADH(pH 8.0 Tris-HCl配制)和0.5 mL 0.060 mmol/L吩嗪硫酸甲酯(pH 8.0 Tris-HCl配制),混合均勻后在25 ℃水浴5 min。測定其波長在560 nm處的吸光度,超氧陰離子自由基清除率計算如公式(4)所示:

(4)

式中:A樣和A0分別代表樣品和空白的吸光度。

1.3.5.4 半抑制濃度(IC50)計算

按公式(5)計算IC50值:

(5)

式中:Xm代表樣品最大濃度的對數,I代表樣品最大濃度與樣品相鄰濃度之比的對數,P、Pm和Pn分別代表樣品濃度之和、樣品最大濃度和樣品最小濃度。

1.3.6 組成分析

基于LC-MS非靶向的方式進行檢測[17],重復3次,所得到的數據供生物信息學分析,最終得出代謝物。代謝物的鑒定首先根據精確分子質量進行確認(分子質量誤差為≤30 ppm),后續根據MS/MS碎片模式對Human Metabolome Database、METLIN、Massbank、mzClound以及帕諾米克自建的標準品數據庫進行確認注釋獲得代謝物。

采用Thermo超高效液相系統(Vanquish,USA),根據化合物的性質,采用Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 mm)液相色譜柱,進樣量2 mL,柱溫40 ℃;流動相A(0.1%甲酸-乙腈,體積分數),流動相B(0.1%甲酸-水,體積分數)。流動相梯度如表1所示。

表1 流動相梯度表

質譜采用的是美國Thermo公司的Qexactive高分辨質譜檢測系統,配有電噴霧離子源(ESI)和Xcalibur工作站。采用ESI分析物在正離子同時掃描下以Full-scan-ms2模式進行分析。優化的質譜分析條件如下:鞘氣40;輔助氣10;離子噴霧電壓+3 000 V;溫度350 ℃;離子傳輸管溫度320 ℃。

1.4 數據處理

提取試驗和單因素試驗采用Microsoft Excel進行數據處理;響應面優化測試利用Design-Expret 8.0.6對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 總黃酮標準曲線的繪制

根據“1.3.4.1節”給出的FRSOK標準曲線的繪制方法進行繪制,取3 mL置于10 mm比色皿中于415 nm處進行檢測,繪制蘆丁標準曲線如圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

由總黃酮標準曲線圖可知,蘆丁對照品溶液在0.00～50.00 mg/mL內,吸光度值與質量濃度呈良好的線性關系,回歸方程為:y=(0.027 1±0.000 20)x+(0.010 39±0.005 96),調整后R2=0.999 45。

2.2 單因素試驗結果

FRSOK含量的提取受到料液比、乙醇體積分數、提取溫度以及提取時間的影響,各因素對其影響關系通過單因素試驗表明。取5.0 g橄欖仁紅皮粉末于100 mL燒杯中,分別按照“1.3.2節”中條件進行實驗,結果如圖2所示。

a-提取溫度;b-乙醇體積分數;c-提取時間;d-料液比

如圖2-a所示,由于黃酮類化合物中含有酚羥基結構,適當的溫度可以激活·OH,但過高的溫度會使其氧化分解,55 ℃后黃酮類化學物的結構遭到破壞,導致含量降低。最終提取溫度選擇55 ℃。

如圖2-b所示,黃酮類物質為典型的有機化合物,易溶于有機試劑,因而提高乙醇體積分數,總黃酮的提取量也會隨之升高。黃酮類化合物的抗氧化活性受乙醇的影響,如圖3所示,當乙醇體積分數達到75%時,·OH清除率達到最大值,過高的乙醇體積分數導致大量有機雜質被溶出并擠占黃酮分子的溶出空間,從而導致活性有所下降[18]。最終萃取劑選擇為75%乙醇-水溶液。

圖3 ·OH清除率與乙醇體積分數的關系圖

如圖2-c所示,提取時間在30 min時,提取率達到峰值,超過30 min有所下降,可能是由于時間的延長,黃酮類化合物中酚羥基結構遭到破壞分解為雜質,提取率下降[19],乙醇溶劑的揮發也會導致黃酮分子與乙醇接觸變得不充分,因此提取率隨著溫度升高有所下降[20]。最終選擇提取時間為30 min。

如圖2-d所示,提取量隨著浸提溶劑量的增加而減少。由于FRSOK具有易溶于乙醇的性質,所以在料液比較小的時候,溶液中的黃酮類化合物很快溶出達到飽和?？紤]到隨著浸提溶劑體積的增加,也會增大濃縮工藝的難度,因此浸提溶劑量不宜過大,采用料液比(g∶mL)為1∶10最為合適。

2.3 響應面實驗結果

響應面試驗的因素水平取值由單因素試驗得出,選擇FRSOK的提取時間,提取溫度和乙醇體積分數為因子,以FRSOK提取量為響應值,建立3因素3水平的響應面設計試驗,共17個試驗點(表2)。

表2 響應面實驗因素水平表

利用Design-Expret 8.0.6軟件分別對橄欖仁紅皮進行曲面響應試驗,得到二元多項式回歸方程,探索FRSOK提取的最優條件每次試驗重復3次,結果見表3。

表3 響應面實驗設計

利用 Design-Expert 軟件進行多元次擬合分析,得出總黃酮提取量與浸提溫度、乙醇體積分數以及提取時間為變量的相關回歸方程為:

Y(總黃酮提取量)=34.88+4.60×A+103.00×B+5.99×C+0.38×A×C+8.10×B×C-11.18×A2+79.69×B2+3.11×C2

由表4可知,模型的F=231.33,P<0.000 1,表明該模型具有極顯著性,失擬差為2.56,說明有19.19%可能會因為各種因素影響導致模型不吻合,因而該模型擬合程度較好,實驗誤差小,可用此模型對FRSOK進行預測和分析。二次項中B2的“P>F”值小于0.01,A2的“P>F”值小于0.05,C2的“P>F”值大于0.05,所以二次項對總黃酮提取率的影響大小依次為B2>A2>C2。

表4 回歸模型的方差分析及顯著性結果

2.4 超聲輔助實驗對比結果

超聲輔助實驗根據單因素實驗的最佳條件確定,如圖4所示,可能在超聲過程中溶液揮發,帶走部分溶出的黃酮提取物,從而導致總提取量減少,結果顯示超聲輔助并不能很好的提高提取量。

圖4 超聲輔助與非超聲輔助對比圖

2.5 抗氧化活性測試結果

由圖5-a可知,在所測定質量濃度范圍內,維生素C對·OH始終保持很高的清除能力,當質量濃度大于0.07 mg/mL時,清除率幾乎接近100%[21]。FRSOK在對·OH的清除率隨黃酮含量的增加而提高,樣品溶液質量濃度達到0.25 mg/mL時,清除率達到84.88%。采用公式計算分析,測定結果用IC50表示。如表5所示,維生素C清除·OH的IC50為7.2×10-7mg/mL,如表6所示,FRSOK清除·OH的IC50為0.035 1 mg/mL,說明FRSOK對·OH有較強的清除能力。

a-·OH清除率;b-DPPH清除率;c-超氧陰離子自由基清除率

表5 維生素C清除不同自由基的IC50值

表6 FRSOK清除不同自由基的IC50值

由圖5-b可知,維生素C的DPPH自由基清除能力隨質量濃度增加而升高,當質量濃度為0.12 mg/mL時,清除率達到96.11%,繼續增大質量濃度清除率無明顯變化。FRSOK清除DPPH自由基能力隨質量濃度的增加而提高,當質量濃度為0.12 mg/mL時,清除率達到81.52%,此后隨著質量濃度的增加,清除率穩定在80%左右。如表5所示,維生素C的IC50=0.004,如表6所示,FRSOK的IC50=0.044,IC50低于10 mg/mL說明該物質具有抗氧化能力,數值越小說明其清除(或還原)能力越強[22],因此說明FRSOK對DPPH自由基有較強的清除能力[23]。

由圖5-c可知,在所測定質量濃度范圍內,維生素C對超氧陰離子自由基始終保持很高的清除能力,當質量濃度大于0.03 mg/mL時,清除率為91.76%。此后隨著抗壞血酸濃度的增加,清除率一直保持較高水平。FRSOK質量濃度含量達到0.03 mg/mL時清除率達到了60%,此后隨著黃酮含量的提高,清除率略有上升,含量為0.25 mg/mL時,達到了64.35%,此時達到了最大值。采用公式計算分析,測定結果用IC50表示。如表5所示,維生素C清除超氧陰離子自由基的IC50為0.002 78 mg/mL,如表6所示,FRSOK清除超氧陰離子的IC50為0.015 28 mg/mL。說明FRSOK對超氧陰離子自由基有清除效果。

綜上,FRSOK具有較好的清除自由基的能力,具備一定的抗氧化活性。在實驗中除超氧陰離子自由基外,其余試劑抗氧化能力隨濃度升高而增大,最終趨近于抗壞血酸的抗氧化能力,FRSOK對超氧陰離子自由基的清除還有較大的提升空間。選用市售的A800295L-抗壞血酸, AR>99.99%(T),售價28元/25 g,FRSOK是將果核表皮回收后進行提取其中的天然黃酮類化合物,提高了資源再利用,且具有較強的清除·OH和DPPH自由基的能力,并均呈一定的量效關系,FRSOK在經濟效益方面的優勢彌補了其抗氧化活性略低的不足。

2.6 化學組成分析結果

基于LC-MS非靶向的方式進行檢測,所得到的數據供生物信息學分析[24],為了有效進行組分分離,采用負離子模式和正離子模式分別進行掃描提取物,最終識別出21種化合物。其鑒定原理如圖6所示,其組成分析結果如表7所示(按照含量從高到低排列)。

圖6 FRSOK成分分析圖

表7 FRSOK成分組成表

其中,新橙皮苷含量最高為54.04%,分子式為C28H34O15,保留時間為918.115 2 s;其次為染木料素,含量為9.37%,分子式為C15H10O5,保留時間為96.501 4 s。

以含量最多的新橙皮苷為例,新橙皮苷保留時間為918.12 s,理論質荷比m/z為610.18,經過測定其分子式為C28H34O15,其鑒定圖如圖7所示。新橙皮苷是一種天然的類黃酮化合物,具有抗氧化和抗炎作用,新橙皮苷在人乳腺癌MDA-MB-231細胞中誘導細胞凋亡,在DPPH自由基清除試驗中表現出抗氧化活性[25]。新橙皮苷可降低胃分泌和胃酸輸出量,使口服葡萄糖耐量和胰島素敏感性顯著提高,同時使糖尿病小鼠的胰島素抵抗降低,血清甘油三酯、總膽固醇、瘦素水平和肝臟指數顯著降低[26]。FRSOK中含有大量的新橙皮苷,在消炎、提高免疫力、抗癌抗氧化方面有良好的作用,提高了橄欖仁紅皮的開發利用價值。

圖7 新橙皮苷鑒定分析圖

3 結論

本研究以總黃酮提取量為參考指標,以乙醇溶液為提取劑,經過響應面優化得出最佳的提取條件為浸提溫度57.61 ℃,乙醇體積分數為75%,浸提時間為35 min,預測總黃酮含量243.53 μg/mL。影響FRSOK得率的因素按照影響大小排序:乙醇體積分數>提取溫度>提取時間。采用LC-MS技術分析FRSOK共有21種,其中新橙皮苷含量最高。本研究首次對橄欖仁紅皮中的活性成分進行分析,結果表明FRSOK是一種新型的植物黃酮資源,組成豐富,具有一定的研究空間。目前,對橄欖仁紅皮的研究較少,尤其是在分離提純和活性探究的空間還很大,例如單一黃酮類化合物的提純以及對提純后提取物的抑菌活性、抗氧化、抗癌等方面的分析還有待深入研究。