嗜熱鏈球菌S131對巨噬細胞的免疫調節作用研究

李旭陽,郭潤晴,路江浩,鄢夢潔,張鵬,劉明月,楊玲

(河北一然生物科技股份有限公司,河北 石家莊,050800)

益生菌制劑是天然的免疫激活劑,可以激活巨噬細胞并提高干擾素的含量,激活機體免疫力和抗病能力[1]。當益生菌進入機體后,其可定殖于腸道并繁殖,在機體消化過程中可以產生多種維生素、氨基酸、過氧化氫和乳酸等物質,可抑制腸道內病原菌的生產繁殖,維持腸道健康,促進機體對營養物質的消化和吸收[2-3]。

免疫是機體通過識別和排除抗原性異物,從而保持體內外環境穩定的一種特異性生理反應[4]。在新冠疫情的大環境下,如何提升機體免疫力引起了越來越多人的關注。機體的細胞免疫應答過程主要由T細胞介導,有研究表明,鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus,LGG)能夠促進動物腸道T淋巴細胞的有效增殖,表現為成熟T淋巴細胞(CD3+)和輔助性T細胞(CD4+)數量升高[5];WANG等[6]通過在飼料中添加植物乳桿菌和低聚果糖,顯著提高了動物血清中IgG和IgA含量,從而有效介導機體體液免疫應答反應;此外,腸道免疫屏障作為腸道黏膜免疫系統的第一道防線,益生菌能夠通過對細胞因子分泌量的調節來改善腸道免疫屏障功能,例如,動物腸道白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、Toll樣受體2和γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)的基因表達可經唾液乳桿菌B1進行增強[7],同時,植物乳桿菌ZLP001能夠對產腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)誘導的動物小腸上皮細胞中IL-6、IL-8以及TNF-α分泌的增加產生顯著的抑制作用[8];YANG等[9]報道證實,植物乳桿菌通過NF-κB和MAPK信號通路能夠在一定程度上抑制ETEC K88誘導的IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1α表達的增強及抗炎細胞因子PPAR-γ表達的減弱。目前,益生菌及其制劑對機體免疫功能的調節機制的研究已經日趨全面,然而,對于某單個菌株腸道定殖穩定性及其免疫調節機制的綜合研究較少。

對于人體,具有較強腸道定殖穩定特性的益生菌菌株更能夠有效地發揮其免疫調節機制,從而增強人體免疫力。因此,本研究主要針對嗜熱鏈球菌S131腸道定殖穩定性及其對巨噬細胞免疫調節的功能特性進行研究,并對其提升免疫力的作用機制進行解析,為益生菌及其免疫力調節功能產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉、三氯乙酸、95%(體積分數)乙醇、苯酚、濃硫酸、透析袋(10 kDa)、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)、青鏈霉素混合液、CCK-8試劑盒、0.4%臺盼藍染色液,生工生物工程(上海)股份有限公司;MRS液體培養基、MRS固體培養基,北京陸橋技術股份有限公司;2型豬胃黏蛋白(Sigma M2 378-100G)、吐溫20、曲拉通X-100,生工生物工程(上海)股份有限公司;DMEM高糖培養液,美國Invitrogen公司;快速細胞凍存液(無血清),上海雅酶生物醫藥科技有限公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),美國Sigma公司;中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒,碧云天;ELISA試劑盒,北京四正柏生物科技有限公司;DMEM完全培養液由90%(體積分數)的DMEM、10%(體積分數)的胎牛血清和1%(體積分數)的青鏈霉素混合液組成。

1.2 儀器與設備

CX41顯微鏡,日本奧林巴斯公司;Micro21R離心機、Multiscan Go多功能酶標儀,美國Thermo公司;Accri C6 Plus流式細胞儀,君曉電子。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化富集及細胞培養

將嗜熱鏈球菌S131和陽性對照組鼠李糖乳桿菌LGG在MRS液體培養基中活化3代及以上,分別離心后收集各菌泥;用含10%胎牛血清的DMEM培養液對菌泥進行重懸,0.9%(體積分數)生理鹽水對重懸菌液進行梯度稀釋,用流式細胞儀檢測菌液濃度,調整菌液濃度1.5×108CFU/mL左右,得到活菌菌懸液。滅活菌菌體收集同上,重懸菌體,置于80 ℃水浴鍋中30 min進行滅活,鹽水稀釋后調整菌懸液濃度為1.5×108CFU/mL左右。

將RAW264.7細胞于含有10%胎牛血清的DMEM完全培養液中復蘇,于37 ℃、5%(體積分數)CO2細胞培養箱中進行孵育,待細胞生長狀態良好且密度達80%左右進行傳代,傳代3次后進行后續實驗。

1.3.2 菌株黏附能力測定

向96孔板中各孔加入100 μL質量濃度為1.0 mg/mL黏蛋白溶液,4 ℃過夜孵育,向過夜孵育后的96孔板中每孔加入含1%(體積分數)吐溫20的PBS封閉1 h;去除PBS后,向各孔中加入菌懸液,每組3個平行,空白對照組加入PBS,37 ℃孵育3 h,待孵育完畢后,加入含0.05%吐溫20的PBS,清洗2次,去除未黏附的菌,在60 ℃烘箱中干燥1 h;干燥后向每孔加入結晶紫溶液,室溫放置染色45 min;PBS清洗后加入無水乙醇,靜置10 min;于595 nm波長下使用酶標儀測各孔的吸光值[10]。

1.3.3 菌株產胞外多糖能力檢測

參考李嘉文等[11]的方法對待測菌懸液中的胞外多糖進行粗提取,樣品測定采用苯酚-硫酸法[12],建立葡萄糖標準曲線,并依據標準曲線方程計算胞外多糖含量。

1.3.4 菌株對細胞增殖和吞噬能力影響的實驗

用自動細胞計數儀檢測1.3.1節中活化后的細胞數量并調整細胞濃度為1.5×105個/mL,接種于96孔板,每孔100 μL細胞懸液在37 ℃、5% CO2培養箱中過夜孵育。

細胞貼壁后,棄去上清液,每孔加入100 μL細胞培養液(DMEM培養基,10%胎牛血清)和100 μL的活菌菌懸液或滅活菌懸液(1.3.1節中已調整好),空白對照組為100 μL細胞培養液,每組5個重復,在37 ℃、5% CO2條件下活菌組與RAW264.7細胞一起孵育4 h,滅活菌組與細胞RAW264.7一起孵育24 h。

用CCK-8法檢測細胞活性及增殖情況[13-14]。按公式(1)計算細胞增殖率:

(1)

式中:As表示各個實驗組OD值;Ac表示空白對照組OD值。

中性紅試劑盒檢測細胞吞噬效果[15-16]。按公式(2)計算細胞吞噬率:

(2)

式中:As表示各個實驗組OD值;Ac表示空白對照組OD值。

1.3.5 菌株對細胞免疫因子分泌能力影響的測定

RAW264.7細胞以2×105個/mL濃度接種于24孔板中,待細胞貼壁后,去除上清液,進行不用分組試驗。各組設置如下(每組5個重復):

陰性對照組(DMEM):各孔中加100 μL DMEM,陰性對照組一孵育4 h,陰性對照組二孵育24 h;陽性對照組(LPS):加入LPS,陽性對照組一孵育4 h,陽性對照組二孵育24 h;LGG組:各孔中加100 μL鼠李糖乳桿菌LGG活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,活菌組孵育4 h(24 h)。S131組:各孔中加100 μL嗜熱鏈球菌S131活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,活菌組孵育4 h(24 h);競爭組(S131+LPS):在各孔中同時加入LPS和嗜熱鏈球菌S131活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,活菌組孵育4 h(24 h);預防組(S131+LPS):各孔中先加入嗜熱鏈球菌S131活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,然后再加入LPS,活菌組孵育4 h+4 h(12 h+12 h);治療組(LPS+S131):各孔中先加入LPS,然后再加入嗜熱鏈球菌S131活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,活菌組孵育4 h+4 h(12 h+12 h)。(注:括號內的時間為滅活菌需孵育時間,孵育均于37 ℃,5%CO2培養箱中進行。)

收集細胞培養上清液,1 000 r/min離心10 min后分裝到無菌離心管中,-80 ℃保藏備用。

按ELISA試劑盒說明書測定上述7種不同組中的TNF-α、IL-6和IL-10的細胞因子的分泌量[17-18]。

1.4 統計學分析

2 結果與分析

2.1 菌株黏附能力的測定

通過對不同菌株黏附能力的檢測試驗,結果顯示,嗜熱鏈球菌S131和鼠李糖乳桿菌LGG菌株的活菌與滅活菌均顯示出一定的黏附能力。同一菌株(嗜熱鏈球菌S131或鼠李糖乳桿菌LGG)的活菌與滅活菌的黏附能力未表現出顯著性差異,通過對比不同菌株的黏附能力檢測結果,發現活化3代之后的嗜熱鏈球菌S131相較于鼠李糖乳桿菌LGG,其活菌和滅活菌株均表現出較強的黏附能力,且滅活菌結果具有顯著性差異(P<0.01),結果見圖1。從該結果可以推論,具有較好黏附能力的嗜熱鏈球菌S131,也應具備更加優異的機體腸道定殖穩定性潛力。該結論可以為嗜熱鏈球菌S131益生菌相關產品的開發與創新提供腸道定殖穩定性的理論依據,為后續研究提供良好的基礎。

圖1 菌株黏附實驗各組吸光度值

2.2 嗜熱鏈球菌S131菌株產胞外多糖能力檢測

以MRS為對照組,葡萄糖標準曲線為y=0.005x-0.01,R2=0.998時胞外多糖含量為(304.2±0.416 3) μg/mL[19]。同條件下,嗜熱鏈球菌S131的胞外多糖產量測定結果為(444.2±2.013) μg/mL,存在極顯著差異(P<0.000 1)。研究表明,不同乳酸菌產胞外多糖的能力不同,產量大致在25～600 μg/mL[20]。本研究結果S131胞外多糖的產量在合理范圍之內。此外,胞外多糖作為一種具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和調節機體免疫的作用的活性生物大分子[21-22],嗜熱鏈球菌S131高產胞外多糖的生物特性,為其在調節免疫功能方面的應用提供理論依據。同時,結合糖代謝和生物信息學分析研究其菌株遺傳背景,為運用基因工程獲得高產優質胞外多糖菌株奠定基礎。

2.3 嗜熱鏈球菌S131對巨噬細胞增殖和吞噬能力的影響

通過對嗜熱鏈球菌S131對RAW264.7細胞增殖和吞噬試驗結果進行分析。如圖2所示,嗜熱鏈球菌S131的活菌與滅活菌對巨噬細胞均具有一定的促增殖能力;且進一步試驗研究表明,在同為活性菌株或者同為滅活菌株條件下,嗜熱鏈球菌S131對巨噬細胞的增殖能力高于鼠李糖桿乳菌LGG,且無顯著性差異。

圖2 不同菌株處理RAW264.7細胞的增殖率

如圖3所示,嗜熱鏈球菌S131的活菌與滅活菌均可促進巨噬細胞的吞噬作用,且在同為活菌或同為滅活菌株條件下,滅活的嗜熱鏈球菌S131對巨噬細胞吞噬能力的促進作用高于鼠李糖乳桿菌LGG,且該結果具有顯著性差異(P<0.01)。巨噬細胞在宿主抵抗外來物質入侵機體,免疫防御和創傷修復等過程中發揮著重要作用[23],結果顯示,嗜熱鏈球菌S131可以提高巨噬細胞增殖和吞噬能力,說明S131可以激活巨噬細胞,進而可以改善機體免疫力。此結果與FOO等[24]的結果相近,益生菌可以促巨噬細胞RAW264.7細胞增殖和吞噬,進而提升機體免疫力。

圖3 不同菌株處理RAW264.7細胞的吞噬率

2.4 菌株對巨噬細胞炎癥因子分泌量的影響結果

由表1可知,與陰性對照相比,S131活菌組和LGG活菌組與細胞共孵育可促進細胞因子IL-10、IL-6和TNF-α的分泌,活菌組S131可上調TNF-α、IL-6和IL-10的分泌,引起生理性炎癥反應,提高機體免疫,且活菌組促細胞分泌IL-10的能力高于LGG活菌組,表現出較良好的激活免疫系統的能力;當LPS誘導細胞形成炎癥細胞時,S131活菌的競爭組、治療組、預防組的TNF-α和IL-6值沒有出現差異,且分泌抑炎因子IL-10增多,說明S131活菌可以增加炎癥反應中抑炎因子IL-10的分泌,從而調節細胞炎癥反應。細胞因子是由多種組織細胞合成分泌的小分子多肽或糖蛋白,且具有多種生物學功能,可以直接表征細胞功能。此結果與王琳琳[25]的研究結果相似,益生菌具有菌株特異性,部分菌株可以降低由LPS誘導的巨噬細胞炎癥模型中促炎因子TNF-α和IL-6的分泌量,還可促抗炎因子IL-10的分泌。結果表明,S131在細胞處于正常狀態時,可以促細胞分泌細胞因子,進而激活免疫細胞,提升免疫系統免疫能力;同時,當細胞處于炎癥狀態時,S131可以下調促炎因子的分泌量,提升抗炎因子的分泌量,進而緩解細胞炎癥狀態,說明S131可以雙向調控巨噬細胞分泌細胞因子,證明其可激活細胞的免疫功能,進而提升機體免疫力。

表1 各組中RAW264.7細胞分泌細胞因子結果

3 結論

本研究結果表明,嗜熱鏈球菌S131具有良好的黏附能力,即可以較好地在腸道內定殖;對菌株產胞外多糖能力的測定結果表明,嗜熱鏈球菌S131相較于對照組具有更優良的產胞外多糖特性,大量研究表明,胞外多糖是益生菌生長代謝過程中的主要次級代謝產物,其具有多種生理功能,可增強人體免疫力等[26]。同時,也可作為增稠劑、穩定劑、乳化劑等運用到食品、醫藥及生化產品等領域[27]。為進一步研究S131代謝產物的開發利用提供基礎。

巨噬細胞在機體免疫系統中處于關鍵位置,在機體免疫過程中,它發揮著監視、防御、抗原識別和呈遞、調節和清除凋亡細胞等功能,是免疫反應的第一道防線[28]。S131可以提升巨噬細胞的增殖和吞噬能力,其中增殖率和吞噬率作為巨噬細胞的活化能力最顯著的特征,具有增強宿主防御和自身免疫的能力[29]。說明S131可以活化巨噬細胞,并提升機體的免疫力系統的免疫能力。

綜上,嗜熱鏈球菌S131可以定殖于腸道,并且可以高產胞外多糖,為之后繼續研究S131的功能方向提供良好的基礎實驗依據。同時通過免疫細胞實驗,S131不僅可以激活正常狀態下的免疫細胞,增加其增殖和吞噬能力,還可促其分泌相關細胞因子;此外,S131還可降低炎癥狀態下促炎因子的分泌量,提升抗炎因子的分泌量,進而緩解細胞的炎癥狀態,S131可雙向調節免疫細胞,改善不同狀態下免疫細胞的相關指標。因此,認為嗜熱鏈球菌S131具有調節免疫的功能,對于應用于保健食品和提升機體免疫力益生菌產品開發提供理論依據。