花椒中代森聯·吡唑醚菌酯的殘留分析及膳食風險評估

張耀海,趙其陽,王成秋,焦必寧

1(西南大學/中國農業科學院柑桔研究所,重慶,400712)2(農業農村部柑桔及苗木質量監督檢測測試中心,重慶,400712)3(農業農村部柑橘類果品質量安全控制重點實驗室,重慶,400712) 4(農業農村部柑桔產品質量安全風險評估實驗室,重慶,400712)5(國家柑桔工程技術研究中心,重慶,400712)

花椒,屬于蕓香科、花椒屬,是一種落葉小喬木。其果實是一種重要的食品添加劑和中草藥,尤其在川菜中具有獨特的麻木味道,具有溫中行氣、逐寒、止痛、殺蟲等功效[1-2]。近年來,花椒產業快速發展,種植面積已達50萬hm2以上,產量已達10萬t以上,是我國西南地區最主要的經濟作物之一[3]。然而,花椒在種植過程中極易受到病蟲害的侵襲,會導致產量和品質嚴重下降[4]?；ń飞a上遇到的最大挑戰為病蟲害問題:主要病害如根腐病、銹病、潰瘍病、黑莖腐病、果實黑腐病等,主要害蟲如蚜蟲和鳳蝶等。

為了防治病蟲害,人們會在花椒生長期間施用殺蟲劑和殺菌劑等多種農藥,這會導致花椒中農藥殘留的污染[2]。長期或短期食用受農藥污染的食品可能對人類健康造成潛在危害,導致各種癥狀,如頭痛、惡心、生殖功能下降、內分泌系統紊亂等[3]。因此,食品中的污染物含量是否超過相關機構設定的最大殘留限量(maximum residue limit,MRL),已引起公眾和科學界的關注。遺憾的是,國內外明確的花椒農藥殘留MRL標準甚少。在我國,花椒上只登記了2種農藥,分別是40%環丙唑懸浮劑和40%丙環唑水乳劑。目前,人們對殺蟲劑、殺菌劑等農藥在花椒上殘留消解狀況及其膳食風險的報道甚少:ZHOU等[5]開展了花椒四地田間試驗,以QuEChERS結合超高效液色譜-二級質譜分別測定干、鮮花椒中吡蟲啉及其5種代謝物殘留量,并進行了膳食風險評估;唐光輝等[6]研究了樹干注藥后戊唑醇在花椒樹不同組織中的分布殘留動態;范金平等[7]開展了烯效唑在冷凍條件下花椒貯藏穩定性研究;楊雙昱等[8]評價戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯3種殺菌劑在青花椒中的殘留消解行為。

作為一種高效殺菌劑,60%百泰水分散粒劑是德國巴斯夫公司研制的新型復配殺菌劑,有效成分為5%吡唑醚菌酯和55%代森聯,可有效防治真菌性病害,并且對非靶標生物和環境安全,為果蔬、油料作物等農作物的品質和產量都起著積極的作用。國內外陸續報道了百泰在葡萄[9]、蘋果[10]、柑桔[11]、荔枝[12]、花生[13]、棉花[14]等上的使用狀況,但未報道在花椒等香辛料中的使用現狀和殘留現狀。而在GB 2763—2021食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量中,僅制定了部分香辛料中的MRL(香辛料允許使用的滅菌劑如毒菌酚MRL為0.01 mg/kg、樂殺螨MRL為0.05 mg/kg、氯苯甲醚MRL為0.05 mg/kg和乙烯菌核利MRL為0.05 mg/kg,代森聯在胡椒、茴香和豆蔻中MRL均為0.1 mg/kg),但花椒中代森聯和香辛料中吡唑醚菌酯的MRL尚無明確標準。此外國外已評估了百泰的遺傳毒性,結果表明百泰能夠損傷DNA,并毒害細胞[15]。因此有必要通過田間試驗,探明百泰在花椒上的殘留消解規律,并探討其可能產生的膳食健康風險,為制定其在花椒中的MRL提供數據支撐。

本研究以花椒為對象,采用超高效液相色譜-串聯質譜法和氣相色譜-火焰光度檢測器(gas chromatography coupled with flame photometric detector, GC-FPD)檢測技術,分析了代森聯和吡唑醚菌酯在花椒中的消解與殘留分布,并對其可能產生的人群膳食風險進行評估,以期為我國花椒安全生產、監測和消費引導提供重要的技術依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

代森聯(純度≥75%),上海源葉生物科技有限公司;二硫化碳(純度≥99%)、甲酸(色譜純)和氯化亞錫二水合物(分析純),上海麥克林生化科技有限公司;吡唑醚菌酯(純度≥98%)和乙撐硫脲(ethylene thiourea, ETU)(純度≥99.5%),德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、甲醇和正己烷(色譜純),美國Sigma-Aldrich公司;抗壞血酸(分析純),上海國藥化學試劑有限公司;無水硫酸鎂和氯化鈉(均為分析純),江蘇強盛化工有限公司;鹽酸(分析純),重慶川東化工有限公司;氨水(分析純)、乙二胺基-N-丙基(40～63 μm,6 nm)和石墨化碳黑(120～400目),上海安譜科學儀器有限公司;60%代森聯·吡唑醚菌酯水分散粒劑,上海悅聯化工有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890B氣相色譜儀,配FPD 檢測器(含硫濾光片)、DB-1(30 m×0.25 mm×1.0 μm)氣相色譜柱、Agilent 1290-6495A液相色譜串聯質譜儀,美國Agilent公司;Acquity UPLC BEH C18超液相色譜柱(2.1 mm×10 cm,1.7 μm),美國Waters公司;CL31/CL31R冷凍離心機,美國Thermo Fisher公司;CK2000高通量研磨儀,北京托摩根公司;Milli-Q 超純水器,美國Millipore公司;THZ-C恒溫振蕩器,蘇州培英實驗設備有限公司;有機相針式濾器(0.22 μm),上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 田間試驗和樣品采集

花椒于2020年4～5月在重慶市江津區(消解和終殘)、重慶市忠縣(消解和終殘)、山東省濟南市(終殘)、四川省資陽市(終殘)四地采集。施藥方法:60%吡唑醚菌酯·代森聯水分散粒劑于花椒葉斑病發生初期噴霧施藥,推薦施藥劑量400～800 mg a.i./kg(稀釋倍數750～1 500倍),用水量1 500～2 250 L/hm2;施藥次數:2～3次;施藥間隔7～10 d,安全間隔期:14 d。施藥器具:背負式電動噴霧器。

最終殘留量試驗設置4個試驗點。每個試驗點設1個處理小區,小區面積50 m2(約6～8棵花椒樹),以800 mg a.i./kg(750倍稀釋液)的有效劑量,用水量為2.5 L/棵樹(即處理小區每次施藥稱取26.67 g 60%吡唑醚菌酯·代森聯水分散粒劑,用20 L水勾兌配制而成),于花椒成熟前28 d進行第一次施藥,分別間隔7 d再進行第2次、第3次施藥。每個試驗點在末次施藥后間隔14、21 d分別采集,每小區每次均采集2個獨立樣品。對照區:另外設置,不施藥。采集處理小區時,應同時采集對照小區。

殘留消解試驗設置2個試驗點。在最終殘留試驗小區中開展,無需額外設置小區。每個試驗點在末次施藥后間隔2 h、7 d和28 d分別采集,每小區每次均采集2個獨立樣品。對照區:另外設置,不施藥。第一次和最后一次采集時,應同時采集對照小區。

樣品采集:應戴一次性手套,先采對照區,再采集處理小區。按設計方案要求,采用隨機法在樹的不同方向及上、下、中、外、里、向陽和背陰面等不同部位采集不少于2 kg無明顯病害、正常生長、成熟的果實樣品,裝入容器中,包扎妥當,容器內外各加上標簽。處理小區需分2次采集2個獨立樣品。樣品運輸:采集后在8 h內進行處理,并冷凍保存。樣品在冷凍狀態下運輸,并記錄運輸過程中的溫度。

將田間采集的花椒的每個獨立樣品在實驗室內均分別制備鮮花椒150 g樣品2份、干花椒150 g樣品2份,分別裝入封口袋中,貼好標簽,-18 ℃低溫保存。干花椒制備,參照相關標準GH/T 1289—2020 干花椒流通規范和GB/T 30391—2013 花椒。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 代森聯的樣品前處理

代森聯樣品前處理采用衍生方法,在加熱的密閉頂空瓶中,樣品中代森聯遇氯化亞錫鹽酸溶液反應生成的二硫化碳氣體被瓶中的正已烷吸收,形成二硫化碳的正已烷溶液,GC-FPD測定有機相中的二硫化碳的量,用二硫化碳定量代森聯的含量。

具體步驟參考相關文獻[16-17],并做了一定改進,如下:稱取樣品10.00 g(精確到0.01 g)于100 mL頂空瓶中,加入50 mg抗壞血酸、40 mL氯化亞錫鹽酸溶液、10.00 mL水、10.00 mL正已烷,迅速將瓶口密封,放入恒溫振蕩器中85 ℃下2 h,時間到后拿出冷卻至室溫,吸取上層有機相,0.22 μm有機相濾頭過濾,經GC-FPD測定。

1.3.2.2 吡唑醚菌酯和ETU的樣品前處理

吡唑醚菌酯和ETU樣品前處理采用優化的QuEChERS法提取凈化,液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀檢測。

具體步驟如下:準確稱取2 g(精確到0.01 g)樣品于50 mL離心管中,加入20.00 mL 1%(體積分數)氨水乙腈和2.00 mL去離子水,于高通量組織研磨儀上以1 000 r/min振蕩提取10 min;加入2.0 g無水硫酸鎂和0.5 g NaCl,振蕩2 min;10 000 r/min離心5 min,吸取1.00 mL上清液于含有50 mg乙二胺基-N-丙基、30 mg石墨化磷黑的離心管中,再加入1.00 mL乙腈稀釋,渦旋2 min;3 000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm有機濾膜,待測。

1.3.3 標準工作液的配制

二硫化碳的標準母液:25 mL容量瓶中加入5 mL正已烷,向其中加入25.00 mg二硫化碳,用正已烷定容至刻度,即為1 000 mg/L的母液,于-50 ℃避光保存。

二硫化碳的標準工作溶液:用正己烷將標準母液逐級稀釋配成30、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 mg/L系列標準溶液,測試前現配。

吡唑醚菌酯和ETU的標準母液:分別稱取吡唑醚菌酯和ETU標準品10.00 mg于10 mL棕色容量瓶中,用乙腈定容,搖勻,配制成1 000 mg/L標準母液,轉移到帶蓋棕色試劑瓶中,置于-50 ℃超低溫冰箱中待用。

吡唑醚菌酯和ETU的標準工作溶液:各取1 mL 1 000 mg/L吡唑醚菌酯和ETU標準母液,乙腈定容至10 mL,配制成100 mg/L的混合標準溶液,用花椒基質空白將混合標準溶液逐級稀釋配成1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.002 mg/L系列標準溶液,測試前現配。

1.3.4 儀器條件

1.3.4.1 氣相條件

色譜柱:DB-1(30 m×0.25 mm×1.0 μm);流速:0.8 mL/min;柱溫:50 ℃(1 min),以20 ℃/min升溫至120 ℃(1 min);進樣口溫度:120 ℃;檢測器:200 ℃,載氣:氮氣,30 mL/min;空氣:60 mL/min;氫氣:50 mL/min;進樣量:1 μL。

1.3.4.2 高效液相色譜-串聯質譜條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×10 cm),1.7 μm;柱溫:40 ℃;進樣量:1 μL;流動相A:0.1%(體積分數)甲酸水溶液;流動相B:乙腈;流速:0.25 mL/min。梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫

離子源:AJS-ESI+;掃描方式:MRM模式;干燥氣溫度:250 ℃;干燥氣流速:14 L/min;氮氣壓力:30 psi;鞘氣溫度:375 ℃;鞘氣流速:12 L/min;毛細管電壓:4 000 V;噴嘴電壓:500 V。MRM質譜條件見表2。

表2 MRM監測條件參數

1.3.5 定性和定量方法

代森聯測定采用GC-FPD進行定性定量,其中代森聯的衍生物二硫化碳定性采用其相對保留時間,定量采用代森聯的衍生物二硫化碳標準曲線法。用二硫化碳的含量[ω(二硫化碳)]定量代森聯的含量,單位以毫克每千克(mg/kg)表示,按公式(1)計算:

ω(代森聯)=1.79×ω(二硫化碳)

(1)

式中:ω(代森聯),代森聯質量濃度,mg/kg;ω(二氧化硫),二氧化硫質量濃度,mg/kg。

吡唑醚菌酯和ETU采用液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀進行定性定量,如表2所示。根據《農藥登記殘留試驗待測殘留物和植物源性食品膳食風險評估殘留物目錄(2021版)》的要求,代森聯與ETU的殘留量之和計算如公式(2)所示:

總殘留量=ω(代森聯)+7.5×ω(ETU)

(2)

式中:ω(代森聯),代森聯質量濃度,mg/kg;ω(ETU),ETU質量濃度,mg/kg。

當代森聯或ETU質量濃度小于其定量限(limits of quantitation,LOQ)時,以LOQ計算總殘留量。

1.3.6 降解動態方程

按照一級反應動力學方程擬合代森聯和吡唑醚菌酯在花椒中的殘留降解動態,消解系數K通過公式(3)計算,半衰期通過公式(4)計算:

CT=C0e-KT

(3)

T1/2=ln(2/K)

(4)

式中:CT,T時間目標農藥的殘留濃度(mg/kg);C0,施藥后目標農藥的初始沉積量(mg/kg);K,消解系數;T1/2,降解半衰期,d;T,施藥后時間,d。

1.3.7 加工因子

采用加工因子(processing factor,PF)表示鮮花椒加工成干花椒過程對農藥殘留的影響,其計算如公式(5)所示:

加工因子=干花椒中的農藥殘留量/鮮花椒中的農藥殘留量

(5)

1.3.8 膳食評估

根據WHO規定的方法,花椒中農藥殘留慢性膳食風險(chronic risk quotient,RQc)按公式(6)和公式(7)計算,急性膳食風險(acute risk quotient,RQa)按公式(8)和公式(9)計算,風險值<1時,健康風險在可接受范圍內;而風險值>1時,存在不可接受的健康風險。

NEDI=(STMR×F)/bw

(6)

RQc=NEDI/ADI

(7)

NESTI=(LP×HR)/bw

(8)

RQa=NESTI/ARfD

(9)

式中:NEDI,每日估計攝入量(the national estimated daily intake), mg/kg bw/d;STMR,農藥殘留試驗中值(the supervised trials median residue), mg/kg;F,花椒人均消費量(the average fruit consumption), kg/d;bw,人群體重(the average body weight), kg;ADI,每日允許攝入量(the acceptable daily intake of pesticide), mg/(kg bw·d);NESTI,短期估計攝入量(the national estimated short term intake), mg/(kg bw·d);LP, 花椒消費大份餐(the large portion), kg/d;HR,最終殘留試驗得到的最高殘留濃度(the highest residue in available samples), mg/kg;ARfD,急性參考劑量(the acute reference dose of pesticide), mg/(kg bw·d)。代森聯的ADI為0.03 mg/(kg bw·d),吡唑醚菌酯的ADI和ARfD分別為0.03和0.05 mg/(kg bw·d)[18]。

2 結果與分析

2.1 方法驗證

二硫化碳的標準色譜圖見圖1-A,ETU和吡唑醚菌酯的總離子色譜圖見圖1-B。

A-二硫化碳;B-ETU和吡唑醚菌酯

二硫化碳的峰面積Y對數與其質量濃度X(0.1～30 mg/L)對數呈現正相關,決定系數(R2)為0.997 2,標準曲線方程為:lgY=2.317 4×lgX+2.771 2,這與文獻吻合[22]。鮮花椒、干花椒均不存在較強的基質效應,因此樣品檢測采用正己烷配標定量。

吡唑醚菌酯和ETU的峰面積Y均與其質量濃度X(0.002～1 mg/L)呈現正相關,標準曲線方程分別為:吡唑醚菌酯:鮮花椒Y=1 583 872.991 3X-3 374.619 9,R2=0.999 9,干花椒Y=747 048.453 9X-3 102.174 2,R2=0.999 7;ETU:鮮花椒Y=295 622.614 4X+44.255 6,R2=0.999 9,干花椒Y=165 530.301 7X-1 578.354 8,R2=0.996 7?？梢钥闯?標準曲線相關性良好,決定系數均在0.996以上。

分別在空白鮮花椒、干花椒中添加4檔質量濃度的代森聯標準溶液,3檔質量濃度的吡唑醚菌酯和ETU混合標準溶液,每檔加標質量濃度水平均重復5次,結果見表3。代森聯回收率為85.5%～106.7%,RSD為1.0%～4.2%;ETU回收率為81.2%～93.1%,RSD為1.6%～9.5%;吡唑醚菌酯回收率為83.4%～91.3%,RSD為2.3%～4.6%。

表3 代森聯、ETU和吡唑醚菌酯添加回收率結果

代森聯、ETU和吡唑醚菌酯在鮮花椒、干花椒中的定量限均為0.05 mg/kg。

由上可見,采用的方法具有良好的準確度和精密度,根據農作物中農藥殘留試驗準則(NY/T 788—2018),可滿足所選農藥殘留檢測分析要求。

2.2 降解動態曲線

施藥2 h后,吡唑醚菌酯在2個產地鮮花椒上的初始沉積量為3.96～5.80 mg/kg,在干花椒上的初始沉積量為8.97～9.20 mg/kg(圖2)。施藥28 d時,吡唑醚菌酯在鮮花椒中的消解率可達94.1%～96.9%,在干花椒中的消解率可達97.3%～97.5%。消解規律均符合一級動力學方程,消解曲線決定系數(R2)為0.840 7～0.992 2,指數關系良好。吡唑醚菌酯在鮮花椒中的半衰期為5.59～6.93 d,在干花椒中的半衰期為5.87～6.13 d。

圖2 吡唑醚菌酯在花椒中的殘留消解變化

施藥2 h后,代森聯、ETU在2個產地鮮花椒上的初始沉積量分別為15.44～32.68 mg/kg和2.87～8.03 mg/kg,在干花椒上的初始沉積量分別為6.88～18.16、2.26～4.77 mg/kg(圖3)。施藥28 d時,代森聯在鮮花椒中的消解率分別可達95.3%～97.7%,在干花椒中的消解率分別可達92.4%～96.2%。代森聯消解規律均符合一級動力學方程,消解曲線決定系數(R2)為0.916 0～0.993 8,指數關系良好。代森聯在鮮花椒中的半衰期為5.10～6.86 d,在干花椒中的半衰期為5.63～7.37 d?？梢?代森聯和吡唑醚菌酯在花椒上的消解速度都比較快。

A-鮮花椒重慶市江津區;B-干花椒重慶市江津區;C-鮮花椒重慶市忠縣;D-干花椒重慶市忠縣

2.3 最終殘留

表4顯示,14 d鮮花椒中代森聯、吡唑醚菌酯殘留量分別為4.31～11.33 mg/kg、0.25～0.94 mg/kg,干花椒中代森聯、吡唑醚菌酯殘留量分別為2.17～9.09 mg/kg、0.30～2.86 mg/kg;21 d鮮花椒中代森聯、吡唑醚菌酯殘留量分別為2.29～4.41 mg/kg、0.11～0.59 mg/kg,干花椒中代森聯、吡唑醚菌酯殘留量分別為1.87～3.63 mg/kg、0.21～2.02 mg/kg。

表4 代森聯和吡唑醚菌酯在花椒上的最終殘留量

2.4 加工因子

由表5可知,干花椒中代森聯的殘留量均低于鮮花椒中的殘留量,加工因子均小于1(0.47～0.83),而干花椒中吡唑醚菌酯的殘留量均高于鮮花椒中的殘留量,加工因子均大于等于1(1.00～3.86)。加工后能顯著降低代森聯在干花椒中的殘留,而吡唑醚菌酯在干花椒中發生了顯著的富集效應。

表5 代森聯、吡唑醚菌酯在花椒中的加工因子

2.5 膳食評估

膳食暴露風險評估是農產品質量安全評估的重要組成部分,也是衡量產品安全性的手段之一。由表6可知,慢性和急性暴露風險值隨安全間隔期延長而降低,均低于安全界限1。慢性暴露風險表現為代森聯>吡唑醚菌酯,吡唑醚菌酯的分布范圍為0.000 26～0.000 67,代森聯的分布范圍為0.001 8～0.003 8;急性暴露風險,吡唑醚菌酯的分布范圍為0.000 37～0.001 8。由于代森聯缺乏ARfD值,故暫不考慮其急性暴露風險。與加工因子相似,對代森聯而言,鮮花椒的慢性暴露風險>干花椒的慢性暴露風險;對吡唑醚菌酯而言,干花椒的慢性暴露風險>鮮花椒的慢性暴露風險,干花椒的急性暴露風險>鮮花椒的急性暴露風險。因此,按照良好農業規范在花椒上施用代森聯·吡唑醚菌酯農藥后,間隔14、21 d,花椒中代森聯和吡唑醚菌酯的急性和慢性膳食暴露風險均在可接受范圍內。

表6 代森聯和吡唑醚菌酯殘留對我國消費者的慢性和急性膳食風險

利用GB 2763—2021中代森聯和吡唑醚菌酯在不同食物中的MRL,結合19種食物的人均膳食量,通過公式(6)和公式(7),評估了代森聯和吡唑醚菌酯在19種食物中的慢性暴露風險,如表7所示。代森聯和吡唑醚菌酯在不同食物中的慢性暴露風險貢獻率差異較大,累計慢性暴露風險均超過了100%,代森聯和吡唑醚菌酯在醬油類食物的慢性暴露風險貢獻率占總比僅分別為0.83%和0.47%。再結合表6中農藥最高殘留值,估算出代森聯在鮮花椒和干花椒的風險閾值分別為15、10 mg/kg,吡唑醚菌酯在鮮花椒和干花椒的風險閾值分別為1、3 mg/kg。

表7 代森聯和吡唑醚菌酯殘留在不同食物中的慢性膳食風險

3 結論

花椒樣品分別經QuEChERS方法處理和衍生化,再分別采用高效液相色譜-串聯質譜法和氣相色譜-火焰光度檢測器檢測代森聯和吡唑醚菌酯。結果表明該方法操作簡單,具有良好的準確度和精密度,可滿足試驗農藥殘留檢測分析要求。在花椒生長發育過程中,代森聯和吡唑醚菌酯均快速消解。按照良好農業規范在花椒上施用代森聯和吡唑醚菌酯后,花椒中代森聯和吡唑醚菌酯的急性或慢性膳食暴露風險均在可接受范圍內。