具有調節血糖功效的復合植物酵素的研究

陳青青,董墨思,石巖,張雨婷,楊宇峰,李蘇紅*

1(沈陽農業大學 食品學院,遼寧 沈陽,110866)2(遼寧中醫藥大學 中西醫結合學院、中醫學院,遼寧 沈陽,110847)

糖尿病是由于胰島素代謝異?；蛞葝u素分泌不足而導致的慢性高血糖疾病,僅次于惡性腫瘤、心腦血管疾病,是危害人類健康的第三大疾病[1]。長期的高血糖會增加心血管疾病、視網膜病變及神經性病變的風險,同時會導致患者產生糖尿病足、創口不愈合潰瘍等現象[2-4]。目前糖尿病尚無治愈的方法,因此控制血糖對預防糖尿病及并發癥具有重要作用,日常生活中人們食用具有調節血糖功效的功能性食品具有廣闊的應用前景。

食用植物酵素是以可用于食品加工的植物為主要原料,經酵母菌、乳酸菌和霉菌等益生菌發酵制得含有特定功能性成分可供人體食用的產品[5]。益生菌發酵能在改善產品風味的同時產生新的次級代謝產物和活性成分,增加酵素的保健功能。近年來,酵素的市場需求量日益增大,市售酵素種類逐漸增多,其研究主要集中在降脂減肥[6]、改善腸道菌群[7]、提高免疫力[8]、增強消化功能和胃腸道吸收[9]及抗氧化[10]等方面,調節血糖的酵素產品研究相對較少,且進口食用酵素售價普遍昂貴。故本研究以紅參、玉竹、馬齒莧、枸杞、柚子、南瓜、生姜、芹菜、山藥為原料,復合乳酸菌為菌種,α-淀粉酶抑制率為評價指標,通過星點設計-響應面試驗優化發酵工藝,旨在探討乳酸菌發酵對酵素α-淀粉酶抑制率的影響,為開發具有調節血糖功效的功能型食用酵素提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

柚子、南瓜、生姜、芹菜、山藥,市售;紅參、玉竹、馬齒莧,同仁堂;枸杞,安徽藥知源中藥飲片有限公司;復合乳酸菌Novum F312(活菌數為1×1010CFU/g,包含乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌),山東中科嘉億生物工程有限公司;低聚果糖,河南旗諾食品配料有限公司;豬胰α-淀粉酶、鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ),Sigma公司;糖化酶,上海瑞恩生物科技有限公司;可溶性淀粉、無水乙醇、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)(均為分析純),國藥集團化學試劑有限公司;中藥復方益糖康[紅參、黃芪、黃精、甘草、白術、丹參、枸杞子、葛根、三七、茯苓、五味子、黃連(10∶10∶13∶4∶3∶3∶3∶3∶3∶3∶3∶3)],遼寧中醫藥大學附屬醫院。

試驗動物信息:SPF級雄性Wistar大鼠[體質量(200±20) g,許可證號:SCXK(遼)2020-0001],遼寧長生生物技術有限公司。

電熱式壓力蒸汽滅菌鍋,浙江新豐醫療器械有限公司;超凈工作臺,蘇州凈化醫療器械有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋,常州智博瑞儀器制造有限公司;數顯高速分散均質機,上海標本模型廠制造;UV-5100紫外分光光度計,上海元析儀器有限公司;電腦控溫恒溫培養箱,寧波樂電儀器制造有限公司;SC-3614低速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;ACCU-CHEK血糖儀,中國羅氏制藥有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵素發酵工藝流程

原料→粉碎→調配→均質→滅菌→冷卻→接種→發酵→離心→成品

操作要點:選取干燥的紅參(30 g)、玉竹(40 g)、馬齒莧(40 g)、枸杞(30 g)與新鮮的柚子(40 g)、南瓜(40 g)、生姜(30 g)、芹菜(40 g)、山藥(40 g)進行粉碎,原料與蒸餾水按3∶10(質量比)的比例于榨汁機中磨漿,之后12 000 r/min均質5 min。將均質后的樣品于115 ℃條件下滅菌30 min,冷卻至室溫后接入復合乳酸菌進行發酵,最后于4 500 r/min離心3 min,即得到復合植物酵素。由于酵素原液含量較高,試驗測定時將其稀釋至不同含量,稀釋后酵素含量的計算如公式(1)所示:

(1)

1.2.2 單因素試驗設計

考察發酵時間(0、12、24、36、48、60 h)、發酵溫度(28、31、34、37、40 ℃)、復合乳酸菌添加量(0、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%,質量分數,下同)、低聚果糖添加量(0、2%、4%、6%、8%、10%,質量分數,下同)對酵素α-淀粉酶抑制率的影響。

1.2.3 星點設計-響應面優化試驗

根據單因素試驗結果,利用Design-expert 8.0.6分析軟件設計響應面試驗,優化酵素的發酵工藝。以發酵時間(h)、發酵溫度(℃)及復合乳酸菌添加量(%)為自變量,以α-淀粉酶抑制率為響應值,試驗設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.2.4 α-淀粉酶抑制率的測定及IC50的測定

參照LI等[11]的方法略做修改。取28 μL 25 mL/L的酵素溶液、1 mL的PBS(pH 6.8,0.1 mol/L)、100 μL α-淀粉酶(29 U)溶液依次加入到10 mL離心管中,混合均勻,37 ℃反應20 min后,加入5 mL 1%(質量分數)可溶性淀粉溶液,5 min后立刻取1 mL于試管中沸水浴,冷卻后加入1 mL蒸餾水和1.5 mL DNS溶液,沸水浴中反應5 min,冷卻后加蒸餾水補至10 mL,于540 nm處測定吸光度,用PBS代替酵素作為空白組,用PBS代替α-淀粉酶作為樣品對照,用PBS代替酵素和α-淀粉酶作為空白對照。分別取12.5、16.7、20、25、33.3 mL/L的酵素28 μL,計算抑制率和IC50。抑制率的計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A,空白吸光度;A0,空白對照吸光度;Ax,樣品吸光度;Ax0,樣品對照吸光度。

1.2.5 酵素對α-葡萄糖苷酶抑制率及IC50的測定

試驗參照劉雪蕊[12]的方法。取40 μL不同濃度的酵素(33.3、50、66.6、100、200 mL/L),分別與40 μL葡萄糖苷酶(0.02 U)溶液于37 ℃加熱10 min后,加入20 μL 7.5 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,pNPG)溶液,混合液反應10 min后加入100 μL 0.1 mol/L NaCO3溶液終止反應,于405 nm處測定吸光度,用0.1 mol/L pH 6.8的PBS代替酵素作為空白組,用PBS代替α-葡萄糖苷酶溶液作為樣品對照。計算抑制率和IC50。抑制率的計算如公式(3)所示:

(3)

式中:A,空白吸光度;Ax,樣品吸光度;Ax0,樣品對照吸光度。

1.2.6 酵素的指標測定

pH的測定:采用pH計;總酸(以乳酸計)的測定參考GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》;乳酸菌的測定參考GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》;大腸菌群的測定參考GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》;霉菌的測定參考GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》;金黃色葡萄球菌的測定參考GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》;沙門氏菌的測定參考GB 4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》。

1.2.7 糖尿病大鼠造模方法

選取SPF級健康Wistar大鼠40只,隨機設定10只大鼠作為正常組,普通飲食喂養,其余30只大鼠連續喂養高脂飲食(在飼料中加入豬油、蔗糖、膽固醇、膽酸鈉等成分)。維持上述喂養方法2周后,禁食16 h,稱重后,腹腔注射鏈脲佐菌素,劑量為45 mg/kg,建立2型糖尿病大鼠模型,以隨機血糖值>16.7 mmol/L作為造模標準?？瞻捉M大鼠根據體重注射同等體積的檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mmol/L)。

1.2.8 實驗分組和給藥

造模成功后的大鼠隨機分為模型組、中藥組(中藥復方益糖康)、酵素組,每組10只。各組大鼠采用每日經口灌胃方式給藥1次,連續8周。正常組和模型組每日10 mL/(kg·d)的生理鹽水灌胃,中藥組以每日10 mL/(kg·d)的中藥復方益糖康灌胃,酵素組以每日10 mL/(kg·d)的酵素灌胃。

1.2.9 大鼠空腹血糖測定

大鼠禁食16 h后尾尖取血,使用血糖儀測量各組大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)。

1.3 數據處理

使用Origin 2019b和Excel 2019軟件進行作圖,Design-Expert.V 8.0.6進行響應面分析。使用SPSS 11.6進行二次多項式回歸分析,P<0.05表示具有顯著性差異。所有實驗均重復3次,數值用平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

如圖1-a所示,隨著發酵時間在0～60 h增加,酵素的α-淀粉酶抑制率逐漸增大。48 h內的α-淀粉酶抑制率增長較快,超過48 h趨于平穩;24 h內的pH急劇下降,48 h的pH降至最低,說明乳酸菌在發酵前24 h代謝旺盛,產酸速率快,到48 h時發酵基本完成。因此確定最適發酵時間為48 h。

a-發酵時間對α-淀粉酶抑制率的影響;b-發酵溫度對α-淀粉酶抑制率的影響;c-菌添加量對α-淀粉酶抑制率的影響;d-低聚果糖添加量對α-淀粉酶抑制率的影響圖1 單因素試驗結果Fig.1 Single-factor test results注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05),相同代表差異不顯著。

如圖1-b所示,28～37 ℃內,酵素的α-淀粉酶抑制率逐漸增大,超過37 ℃呈下降趨勢。37 ℃時pH降至最低,說明溫度過高或過低都會影響乳酸菌的生長,導致發酵能力差,不利于抑制酶活性的功能性成分生成[13]。故選擇37 ℃作為最適發酵溫度。

由圖1-c可知,隨著復合乳酸菌添加量的增加,α-淀粉酶抑制率出現先增大后平穩的趨勢。當添加量大于0.1%,α-淀粉酶抑制率基本保持不變,且酵素pH值趨于平穩,說明發酵完成。故選擇0.1%作為最適復合乳酸菌添加量。

為探究低聚果糖對酵素α-淀粉酶抑制率的影響,將發酵時間調整為30 h。由圖1-d所示,不添加低聚果糖時,酵素的α-淀粉酶抑制率約為60%。為提高α-淀粉酶抑制率,繼續添加2%、4%、6%、8%、10%的低聚果糖。結果發現,0～10%的低聚果糖對α-淀粉酶抑制率和pH均無顯著差異(P>0.05),說明添加低聚果糖不影響酵素的發酵速度及對α-淀粉酶的抑制作用。由此說明乳酸菌依靠原料中的碳源能夠完成發酵,并不需要額外添加。因此選擇不添加低聚果糖,且響應面試驗中去掉該因素。

2.2 星點設計-響應面試驗優化結果

星點設計-響應面試驗優化發酵工藝結果見表2。以α-淀粉酶抑制率(Y)為響應值,利用Design Expert.V8.0.6對試驗結果進行分析,建立發酵時間(A)、發酵溫度(B)、復合乳酸菌添加量(C)3因素的二次多項回歸方程為:

表2 星點設計-響應面試驗設計及結果Table 2 Central composite design-response surface test design and results

Y=95.28+11.18A-3.46B+16.96C+4.49AB+4.21AC-8.46BC-10.55A2-20.54B2-12.27C2

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Regression model ANOVA results

2.3 酵素的質量評價

以復合乳酸菌為菌種制備酵素,可提高發酵速度,顯著降低酵素的pH值,提高總酸含量[14]。由表4知,各項理化指標均符合QB/T 5323—2018《植物酵素》的要求。酵素發酵前對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,經乳酸菌發酵后抑制率顯著提高,可能是原料本身保留了營養成分的同時,乳酸菌發酵有利于2種酶活性抑制成分的生成。且最佳發酵工藝制備的酵素色澤良好,甘苦味適中,口感細膩無異味,質地均勻,無致病菌檢出。

表4 酵素的指標Table 4 Indicators of Jiaosu

2.4 酵素對α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的抑制作用

如表5所示,酵素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制呈濃度依賴性特征,計算得出酵素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC50值分別為(16.54±0.40)和(46.54±6.50) mL/L,表明酵素對α-淀粉酶的抑制率達到50%所需要的濃度低于同等酶活力時α-葡萄糖苷酶抑制率達到50%所需要的濃度,即在同濃度下,酵素對α-淀粉酶的抑制強于α-葡萄糖苷酶。

表5 酵素對α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的抑制作用Table 5 Inhibition of α-amylase and α-glucosidase by Jiaosu

2.5 酵素對大鼠空腹血糖的影響

酵素干預糖尿病大鼠的空腹血糖變化結果如表6所示,造模成功后,與正常組相比,喂食高脂飼料的3組大鼠在干預前空腹血糖值顯著升高(P<0.01)。干預2周后,與模型組相比,中藥組大鼠的FBG明顯降低(P<0.05);從第4周開始,中藥組和酵素組的FBG顯著降低(P<0.01)。干預8周的中藥組和酵素組大鼠血糖水平分別降低了44.64%和37.12%,說明酵素組效果接近于中藥組,能明顯改善大鼠的空腹血糖。

表6 各組大鼠空腹血糖值 單位:mmol/LTable 6 Fasting blood glucose values of rats in each group

3 討論

與化學合成物相比,天然產物更加經濟、安全,利用天然產物開發調節血糖的功能性產品已成為預防和治療糖尿病的新趨勢[15-17]。發酵能在改善產品風味的同時提高其功能性,故發酵產品的研制已成為研究熱點。研究顯示,水果酵素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率分別為99.57%和81.67%,酶抑制率較高,其中多酚對α-淀粉酶有抑制效果[18],但該酵素為自然發酵,發酵周期長,易受多種微生物影響,需要嚴格控制發酵條件以保證品質[19];紫薯汁發酵后對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率分別為63.5%和70.9%,且發酵后提高了多糖、總酚、總酮含量[20];由乳酸菌發酵制備出富含多酚的接骨木果汁,其對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率分別為68.62%和72.39%[21]。大量研究表明,發酵可提高多糖含量[22],釋放黃酮[23]和多酚物質[24],且植物中的黃酮、多酚、多糖等高活性物質是天然降血糖提取物的研究熱點[25]。結合上述研究,推測酵素中含黃酮、多酚或多糖類物質,并具有改善血糖的效果。

本研究酵素碳源充足,制備工藝簡單,發酵周期短,微量酵素抑制酶活性效果顯著,經發酵后對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別提高了4.86倍和3.41倍,且酵素濃度為33.3 mL/L可完全抑制α-淀粉酶活性。該酵素可改善糖尿病大鼠的空腹血糖,可能與其抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性有關,或酵素發酵過程中提高多糖、多酚或黃酮類物質含量,同時產生的有益次級代謝產物起協同降糖作用。本研究僅對酵素調節血糖的能力進行初步研究,還需對活性成分進行分離鑒定,這也為后期深入研究其調節血糖能力及其相關機制、發酵過程中代謝物的變化規律等研究提供參考。

4 結論

本研究采用單因素試驗及星點設計-響應面法得出了酵素的最佳發酵工藝,最終確定發酵時間為49.5 h,發酵溫度為37 ℃,復合乳酸菌添加量為0.1%。該酵素發酵周期短,發酵工藝簡便,適合工業規?；a,應用此模型繼續優化酵素的其他保健功效,與改善血糖作用相結合,具有更為廣闊的研發價值和市場潛力,并在產業化中具有一定的指導意義,有利于滿足國內日益增多的糖尿病患者的需求,減少患者副作用的同時降低國民生活成本。