雞毒害艾美耳球蟲病防控技術研究進展

陳祥杰,戚南山,廖申權,李 娟,呂敏娜,林栩慧,蔡海明,胡俊菁,張健騑,張浩吉,孫銘飛*

(1.佛山科學技術學院,廣東佛山 528000;2.廣東省農業科學院動物衛生研究所,廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室,農業農村部禽流感等家禽重大疾病防控重點實驗室,廣東廣州 510640)

雞球蟲病是一種由艾美耳屬球蟲引起的以腸道嚴重損傷為特征的寄生性原蟲病,該病可造成肉雞飼料利用率降低、增重緩慢、腹瀉甚至死亡等[1],每年給家禽養殖業帶來超過100億美元的經濟損失[2]。 目前認為有7種艾美耳球蟲能感染雞,分別是毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)、柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)、堆型艾美耳球蟲(E.acevulina)、布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)、和緩艾美耳球蟲(E.mitis)、早熟艾美耳球蟲(E.praecox),其中毒害艾美耳球蟲是毒力最強蟲種之一。毒害艾美耳球蟲寄生在雞體小腸中段,主要引起8～18周齡的雞發生急性小腸球蟲病,嚴重時可擴展到整段小腸,剖檢可見腸管腫脹和黏膜增厚,腸腔內充滿血液。

目前針對毒害艾美耳球蟲病的預防和控制主要依靠抗球蟲藥物和雞球蟲病減毒活卵囊疫苗,但由于臨床大量抗球蟲藥物的低效使用,導致臨床蟲株幾乎對所有現有抗球蟲藥物呈現不同程度的耐藥性[3-4],且當前臨床應用的雞球蟲病活卵囊疫苗對于毒害艾美耳球蟲仍存在保護力不足等問題,安全高效的防控手段亟待開發。近年來,國內外學者在毒害艾美耳球蟲的新型藥物開發與疫苗研制等方面開展了大量的研究工作,鑒于此,本文綜述了近年來毒害艾美耳球蟲病防控技術的研究進展,以期為毒害艾美耳球蟲新的抗球蟲藥物研發及新疫苗的研制提供理論借鑒。

1 毒害艾美耳球蟲病防控技術種類及特點

1.1 卵黃抗體防治技術

卵黃抗體(egg yolk antibodies,EYAs)是雞蛋卵黃中的一種γ免疫球蛋白,是禽類免疫系統中有效的保護性抗體,在母源被動免疫中發揮重要作用,有助于提高禽類的生長性能[5]。通過給蛋雞多次服用艾美耳球蟲孢子化卵囊后采集雞蛋,從卵黃中提取和純化卵黃抗體。白細胞介素10(IL-10)是一種有效的抗炎細胞因子,原蟲可通過刺激宿主IL-10的上調,逃避宿主的免疫反應,減少炎癥反應對于病原體的破壞。研究證明,卵黃抗體可靶向作用于腸腔的宿主肽,可改善因雞母源抗體傳遞給雛雞時引起的全身性抑制IL-10所導致的促炎癥狀[6]。雞在口服抗IL-10卵黃抗體可以改善因雞球蟲感染導致的飼料轉化率下降及生長抑制,但對卵囊排量無影響[7]。隨著卵黃抗體技術的不斷進步,該技術將來可配合雞球蟲疫苗使用,改善雞體的生長及飼料轉化效率,改善養殖生產中對于毒害艾美耳球蟲病的預防治療效果。

1.2 藥物防治技術

1.2.1 化學類和抗生素類藥物 目前已有數十種藥物用于防治雞球蟲病,一類是化學合成類藥物,如氨丙啉、尼卡巴嗪、托曲珠利、磺胺喹惡啉、地克珠利等藥物作用于雞球蟲子孢子和裂殖子階段,抑制球蟲的生長發育[8]。另一類是聚醚類載體藥物,包括鹽霉素、拉沙里菌素、莫能菌素、馬杜霉素等藥物,主要作用于雞球蟲無性生殖階段,通過擾亂球蟲體內陽離子濃度,破壞細胞膜內外正常滲透壓。自1954年球蟲抗藥性問題的出現及公眾要求減少食物鏈的藥物殘留,促使科學家尋求天然、安全和有效的替代化合物。

1.2.2 植物提取物及中草藥制劑 植物及中草藥制劑作為抗球蟲病藥物的天然替代品之一,具有許多優點。據研究發現,有1200多種植物具有抗原蟲活性,其中有一些植物提取物及其制劑可以增強雞腸道免疫力,抑制雞球蟲和有害菌的增殖且對腸道有益菌有拮抗作用[9-10]。目前研究表明,能對毒害艾美耳球蟲有作用的植物提取物及草藥制劑見表1。

表1 不同的植物提取物及草藥制劑對毒害艾美耳球蟲的影響

1.2.3 納米藥物 納米藥物遞送系統(nano drug delivery system,NDDS)是指將治療藥物與納米載體材料復合形成的納米藥物載體復合物。納米技術方法被引入獸醫領域,不僅用于疾病診斷,而且還用于治療和預防[20]。它們在生物醫學領域具有研究前景,由于它們的體積小和獨特的物理化學特性,可以調節藥物釋放,靶向給藥,以及體內免疫調節。有趣的是,微量元素納米顆粒顯示出抗菌、抗寄生蟲和抗氧化的作用[21]。

制備含托曲珠利聚合物納米膠囊,通過飲水作用于雞體,攻蟲后發現飲水中加入納米膠囊的抗球蟲效果與含托曲珠利的參照藥物相似,均可有效減少腸道病變計分和卵囊排出量,且72 h內對雞成纖維細胞沒有毒性[22]。氧化鋅納米顆粒的抗球蟲效果與地克珠利相似,能有效降低死亡率、腸道損傷及卵囊排出量[23]。氧化鋅納米顆粒能夠改善黏膜絨毛的作用面積及隱窩深度,從而提高腸道吸收能力,因此氧化鋅納米顆?？赡芫哂写偕L作用。 抗球蟲藥物與納米載體形成的復合物是一種具有潛力的預防控制雞球蟲病、改善家禽健康以及生產性能的替代措施。

1.3 輔助性防治技術

1.3.1 益生元和益生菌 益生元被定義為不可消化的寡糖,是腸道微生物區系的有效調節劑,能選擇性地促進體內有益菌的代謝和增殖,刺激新生雛雞的腸道相關免疫系統,從而保護它們免受疾病的侵襲。相比之下,益生菌是一種活的微生物飼料補充劑,通過改善宿主動物的腸道微生物平衡而對其產生有益影響。自2006年歐盟提出“禁抗”以來,益生元及益生菌有望成為雞球蟲病防治中替代抗生素的方法之一。

在日糧中添加1×108CFU/g的植物乳桿菌P8,有助于改善因包括毒害艾美耳球蟲在內的多種艾美耳球蟲混合感染導致的高死亡率、卵囊排出量及腸黏膜損傷程度[24]。把反式低聚半乳糖(Bi2tos)益生元注射入黑羽肉雞的受精卵中,雛雞自然感染艾美耳球蟲,發現益生元添加組的體重、脂肪酸有一定改善且卵囊排出量減少、腸道損傷降低[25]。在基礎日糧中添加益生元(甘露寡糖和β-葡聚糖)和益生菌(枯草芽孢桿菌),后者可以通過競爭性排除沙門氏菌和大腸桿菌等病原體,有助于肉雞消化器官的發育且能降低飼料轉化率[26-27]。在飼料中添加丁酸梭菌配合含有毒害艾美耳球蟲的雞球蟲活卵囊疫苗聯合免疫肉雞后,可顯著降低卵囊排出量、減輕所有腸道損傷,提高增重率,并提出擬桿菌屬、產糞甾醇真桿菌的相對豐度的增加有利于腸道微生物群落對抗艾美耳球蟲的感染[28]。在日糧中添加枯草芽孢桿菌配合球蟲活卵囊疫苗使用后的肉雞腸道中小梭文肯菌的豐度顯著增加,包括產氣莢膜梭菌在內的厚壁菌門細菌豐度降低,可能會改善因球蟲入侵造成腸道黏膜損傷而引起的壞死性腸炎[29]。因此,益生菌和球蟲活卵囊疫苗聯合應用有助于減輕毒害艾美耳球蟲活疫苗免疫引起的小腸損傷。

1.4 疫苗防治技術

1.4.1 活卵囊疫苗 幾十年來,疫苗一直被用來控制球蟲病。目前生產中主要以活卵囊疫苗防治為主,其中強毒活卵囊疫苗有CocciVac-B、CocciVac-D、Immucox等,但難以把握的免疫劑量會導致雞群具有疾病暴發或產生免疫力不足的風險。減毒活卵囊疫苗有Paracox及國內研制的雞球蟲病四價活卵囊疫苗等,這些疫苗是通過篩選更早熟的艾美耳球蟲分離株來完成的,即生命周期更短、繁殖能力更弱的減毒蟲株,但具有生產成本高、保質期有限、低溫運輸及保存、繁殖指數低、存在散毒風險等缺點。

減毒活卵囊疫苗對毒害艾美耳球蟲的保護性較低,由于臨床上雞球蟲的感染病例中多為幾種球蟲的混合感染,但并不都是同等程度的感染而產生的“擁擠效應”[30],即在寄生部位相同的種類中,潛在期越短的種類,越有優先增殖的傾向,一個時期多以一種球蟲占絕對優勢。在毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合感染的情況下,前者的有性繁殖體不能充分發育,因而不能產生卵囊,導致毒害艾美耳球蟲減毒活卵囊疫苗無法循環感染雞體而刺激其產生有效免疫力。用重組基因佐劑pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP配合活卵囊疫苗對雞進行聯合免疫,可有效提高疫苗效果及抗體產生期縮短[20]。因此,臨床上的減毒活卵囊疫苗對毒害艾美耳球蟲的保護性較低,研發合理高效的疫苗接種策略已成為全球養禽業的當務之急[31]。

1.4.2 亞單位疫苗 亞單位疫苗是將保護性抗原基因通過真核表達或原核表達,最終以多肽或蛋白質制備而成的新型疫苗,具有成分純度高、穩定性好、生物安全性高等優點,能誘導機體產生體液免疫及細胞免疫,但需要通過加入佐劑和采取不同的免疫策略才能達到較好的免疫效果。腸淋巴細胞中高度表達的雞抗菌肽cNK-lysin可誘導促炎細胞因子產生免疫調節作用,對毒害艾美耳球蟲子孢子有抑制作用[32]。通過原核表達系統獲得卵囊壁基本成分中的配子體蛋白EnGAM59免疫雛雞,發現免疫組的腸道病變有顯著改善,且體重和免疫球蛋白IgY水平有明顯提升[33]。Enp25、EnSAG、EnMIC13基因在轉錄水平與蛋白水平呈差異性表達,通過制備重組蛋白免疫動物發現,3種重組蛋白均顯示有良好的免疫原性及免疫保護效果,可有效改善腸道病變,明顯增加體重及減少卵囊排出[34]。桿狀病毒表達系統相較于原核表達系統所表達的外源蛋白能更好地誘發機體產生免疫保護力,可能是外源蛋白的空間結構影響其生物學活性[35]。構建多價多表位亞單位疫苗pET-32a-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1,發現對雞體免疫重組蛋白后,感染柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球蟲試驗組的腸道病變及增重情況有明顯改善,抗球蟲指數ACI值在130以上,表明該重組蛋白可提供交叉免疫保護力[36]。鑒于亞單位疫苗有著制備流程簡單、易大批量生產、貯存運輸方便的優勢,多價多表位的亞單位疫苗有望成為雞球蟲病新型防控的重要手段。

1.4.3 DNA疫苗 核酸疫苗是將編碼抗原蛋白的外源基因插入到載體質粒中,導入雞體細胞內,利用宿主表達系統合成抗原蛋白,激活宿主的細胞或體液免疫,以達到預防和治療疾病的目的。鑒于球蟲生長階段的復雜性,含有多階段抗原的多表位重組抗原的免疫保護效果比單一階段的多表位重組抗原的效果好,雞體能產生更有效的免疫應答。篩選具有保護性的T細胞表位片段構建多表位DNA疫苗,對毒害艾美耳球蟲在內的多種雞球蟲產生免疫保護效果,免疫組的體重增加,抗球蟲指數均能達到170以上,腸道損傷有明顯改善[37];該學者還選擇柔嫩艾美耳球蟲子孢子階段抗原基因SO7及裂殖子階段的抗原基因MZ5-7 T細胞表位集中的片段來構建多表位DNA疫苗pVAX1-m1-m2-s1-s2,能提供良好的免疫保護效果。T細胞及細胞因子的激活對于雞體抵御球蟲感染是至關重要的,通過構建含有T細胞或細胞因子表位片段的多價多表位疫苗或許是未來研發安全高效DNA疫苗的方向。

2 展望

雞球蟲作為危害肉雞腸道健康的最重要病原之一,隨著集約化養禽業的迅速發展以及減抗替抗的養殖要求,傳統的抗球蟲藥物防控方案危及食品安全,安全高效、經濟便捷的新型防治策略研究迫在眉睫,綠色安全的天然抗球蟲藥物、高效的納米藥物有望成為替代抗生素的新型防控方案。目前大量研究發現雞球蟲入侵關鍵抗原分子在蟲體入侵宿主過程中起著關鍵作用,鑒于雞球蟲在體內存在不同發育階段的復雜性特點,選擇免疫原性良好且適用于球蟲不同發育階段的保護性抗原構建的多表位亞單位嵌合疫苗具有巨大潛力。隨著現代分子生物學技術發展和對雞球蟲致病機制、保護性抗原基因等研究和認識不斷加深,新一代抗球蟲分子疫苗將為新形勢下毒害艾美耳球蟲病等多種雞球蟲病防控帶來新的希望。