超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定黨參和當歸中23種植物生長調節劑的殘留量

劉志榮,張明童,馬 瀟,謝 楠,郭朝暉,杜海娟

(甘肅省藥品檢驗研究院 甘肅省中藏藥檢驗檢測技術工程實驗室 國家藥品監督管理局中藥材及飲片質量控制重點實驗室,蘭州 730070)

植物激素對于植物生長發育具有非常重要的作用,幾乎調控著植物生命過程的各個方面,如植物的生長發育以及對生物和非生物的應激反應等。植物激素分為天然植物激素和植物生長調節劑(PGRs),PGRs又被稱為外源性植物激素,屬于合成農藥,具有與天然植物激素相似的生物活性,能有效地促進、抑制或改變植物的生長發育過程[1-2]。PGRs可被單獨使用,也可被組合使用,能增加農作物產量和提高農作物品質[3-4]。PGRs也會帶來一些危害,如作物收獲階段殘留的PGRs,如多效唑、矮壯素等不能被吸收或降解,進而可能對人和環境產生危害[5-7]。近年來,中藥材種植中PGRs過量使用的現象越來越普遍,而中藥材中PGRs殘留限量標準尚未制定,導致中藥材中PGRs 的殘留問題越來越受人關注[8-11]。中藥材成分復雜,PGRs的物理化學性質也較為復雜,因此開發中藥材中PGRs多殘留同時檢測的方法具有一定的挑戰性。本工作通過優化前處理、色譜、質譜條件,建立了超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)同時測定黨參、當歸中23種PGRs殘留量的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-30AD 型液相色譜儀;AB SCIEX QTRAP 5500型三重四極桿質譜儀;5418R 型高速離心機;MS 3型渦旋振蕩器;XPR205型電子天平;Milli-Q型純水系統。

單標準儲備溶液:1 g·L－1,取23種PGRs標準品各10 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,于－20 ℃儲存。

單標準中間液:10 mg·L－1,取各單標準儲備溶液適量,用乙腈稀釋而成。

混合標準溶液系列:取適量單標準中間液,用50%(體積分數,下同)乙腈溶液逐級稀釋,配制混合標準溶液系列,各PGRs的濃度點見表1。參考上述步驟,以空白樣品溶液作稀釋劑配制基質匹配混合標準溶液系列。

標準品:胺鮮酯質量分數97.6%,批號D0 009326;烯效唑質量分 數 99.8%,批 號D0 009823;氯吡脲質量分 數 98.8%,批號D0 009378;6-芐基氨基嘌呤質量分數99.2%,批號C0 008824;6-糠氨基嘌呤質量分數98.8%,批號D0 009286;抑芽唑質量分數 99.7%,批號D0 009876;多效唑質量分數 96.6%,批號D0 009887;3-吲哚乙酸質量分數98.2%,批號23519;矮壯素質量分數99.6%,批號G 738578;丁酰肼質量分數99.5%,批號D0 009824;抗倒酯質量分數99.8%,批號D0 009825;吲熟酯質量分數97.2%,批號D0 010273;4-氯苯氧乙酸質量分數98.6%,批號D0 009863;2,4,5-涕質量分數97.9%,批號D0 009875;2-萘氧乙酸質量分數98.4%,批號23627;5-硝基愈創木酚鈉質量分數98.4%,批號24341YM;2,3,5-三碘苯甲酸質量分數96.6%,批號D0 009326;赤霉素質量分數98.4%,批號D0 009834;4-硝基苯酚鈉質量分數98.4%,批號D0 009839;3-吲哚丁酸質量分數98.1%,批號23525;2,4-滴質量分數99.5%,批號D0 009844;噻苯隆質量分數99.5%,批號25991;助壯素質量分數98.5%,批號23899。

甲醇、乙腈為色譜純;無水硫酸鎂(AMS)和氯化鈉為優級純;N-丙基乙二胺(PSA)填料粒徑為40～60μm;十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)粒徑為40～70μm、石墨化碳黑(GCB)粒徑為40～70μm;試驗用水為超純水。

46批黨參樣品收集于甘肅岷縣和文縣地區,30批當歸樣品收集于甘肅岷縣、渭源縣以及隴南地區,76批樣品均由甘肅省藥品檢驗研究院主任中藥師馬瀟鑒定。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Waters AQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫40 ℃;流動相A 為含5 mmol·L－1甲酸銨的0.05%(體積分數,下同)甲酸溶液,B 為含5 mmol·L－1甲酸銨和0.05%甲酸的乙腈溶液;流量0.3 mL·min－1;進樣量5μL。梯度洗脫程序:0～1.0 min時,A 為70%;1.0～7.0 min時,A 由70%降至5%;7.0～8.0 min時,A 由5%升至70%,保持2.0 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正(ESI＋)、負(ESI－)離子模式;保留時間依賴多反應監測(s MRM)模式。

ESI＋模式:離子源電壓5 500 V;離子源溫度500 ℃;氣簾氣壓力241 kPa;噴霧氣壓力345 kPa;加熱氣壓力345 kPa。

ESI－模式:離子源電壓－4 500 V。其他參數同ESI＋模式。

其他質譜參數見表2。

表2 質譜參數Tab.2 MS parameters

1.3 試驗方法

樣品經晾干,反復粉碎后過65 目(250μm±9.9μm)篩。取3.0 g樣品粉末,置于50 mL 聚丙烯離心管中,加入1.0%(體積分數)冰乙酸溶液5 mL,渦旋使樣品完全浸濕。浸泡30 min 后加入乙腈15 mL,以500 次·min－1速率劇烈 振搖10 min。將AMS 4.0 g和氯化鈉1.0 g加至上述離心管中,先劇烈搖散,防止鹽結塊,然后以500 次·min－1速率劇烈振搖10 min,以5 000 r·min－1轉速離心10 min。收集全部上清液,轉移至15 mL 離心管中,于40℃氮吹至近干,加入50%乙腈溶液1 mL溶解殘渣,按照優化的儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

用針泵將500μg·L－1單標準溶液以10μL·min－1流量注入質譜儀,進行一級質譜掃描,其中12種目標物在ESI＋模式下響應較好,對應的母離子多為[M＋H]＋;其他11種目標物在ESI－模式下響應較好,對應的母離子多為[M－H]＋。對母離子進行二級質譜掃描,選擇信號強度較高且更穩定的子離子作定量和定性離子,并對去簇電壓和碰撞能量進行手動模式優化,優化后的質譜參數見表1。

2.2 色譜條件的優化

流動相的組成會影響目標物的峰形、分離度、信號強度等。因此,試驗考察了分別以甲醇、乙腈作有機相,水、甲酸溶液、甲酸銨溶液作水相時對各目標物分離效果的影響。結果顯示:以乙腈作有機相時,各目標物的分離度整體優于以甲醇作有機相時的;以水作水相時,各目標物的響應均較好,但是ESI－模式下3-吲哚乙酸、3-吲哚丁酸、2-萘氧乙酸、2,4,5-涕等酸性PGRs的峰形較差;以甲酸溶液作水相時,上述4種目標物的峰形得到明顯改善,且甲酸體積分數為0.05%,0.1%,0.2%時各目標物的分離效果相差不大;在甲酸溶液和乙腈中加入5 mmol·L－1甲酸銨時,23種目標物的峰形較加甲酸銨前的明顯改善,ESI＋模式下大多數目標物的信號強度隨著流動相中甲酸銨濃度的增加而增大,ESI－模式下大多數目標物的信號強度隨流動相中甲酸銨濃度增加而減小,但ESI－模式下各目標物的信號強度均較小,甲酸銨濃度的影響并不顯著。綜合考慮,試驗選擇的水相為含5 mmol·L－1甲酸銨的0.05%甲酸溶液,有機相為含5 mmol·L－1甲酸銨和0.05%甲酸的乙腈溶液。

2.3 提取溶劑的選擇

在采用乙腈提取樣品中目標物時,需先加入適量水潤濕樣品,從而使乙腈穿透樣品,將樣品內部的目標物提取出來。試驗比較了乙腈和水的體積比分別為2∶1、3∶1、4∶1 時加標黨參樣品(加標量0.5μg·g－1)中各目標物的回收率。結果顯示:上述3種體積比下目標物的回收率為70.0%～120%,其中助壯素和矮壯素的回收率隨著乙腈占比的增加而增大,其他21種目標物的回收率變化不大。綜合考慮回收率和易操作性,試驗選擇乙腈和水的體積比為3∶1。

考慮到酸化的提取溶劑有利于酸性目標物的提取,試驗采用冰乙酸溶液5 mL＋乙腈15 mL提取,比較了冰乙酸溶液的體積分數分別為0,0.5%,1.0%,2.0%,3.0%時對加標黨參樣品(加標量0.5μg·g－1)中酸性目標物回收率的影響,結果見圖1。

圖1 冰乙酸溶液體積分數對酸性PGRs回收率的影響Fig.1 Effect of volume fraction of glacial acetic acid solution on the recovery of acid PGRs

由圖1可知,冰乙酸溶液體積分數為1.0%時,加標樣品中酸性目標物的回收率整體較高,冰乙酸溶液體積分數繼續增加,各目標物的回收率變化不大。因此,試驗選擇冰乙酸溶液的體積分數為1.0%。

2.4 凈化過程的影響

在凈化樣品提取液時,通常將吸附劑(PSA、GCB、C18等)和AMS組合使用,有利于去除提取液中的共提取物和水分,提高目標物的回收率。其中:吸附劑PSA 主要用于吸附有機酸、糖類和色素等雜質,但也會吸附酸性目標物;GCB 主要用于吸附類胡蘿卜素、葉綠素和甾醇類等雜質,但也會吸附具有平面型結構的目標物;C18主要用于吸附脂類、固醇類和其他復雜化合物,但也會吸附部分親脂性目標物。按照試驗方法提取加標黨參樣品(加標量0.5μg·g－1),離心后在上清液中加入不同組合吸附劑[450 mg AMS(組合A1),450 mg AMS＋200 mg C18(組合A2),450 mg AMS＋200 mg PSA(組合A3),450 mg AMS＋200 mg C18＋200 mg PSA(組合A4),450 mg AMS＋200 mg C18＋200 mg PSA＋50 mg GCB(組合A5)],以500次·min－1劇烈振搖5 min,5 000 r·min－1離心10 min后,收集上清液,后續處理步驟同試驗方法,比較了在上述5種吸附劑分組下23種PGRs的回收率,結果見圖2。

圖2 吸附劑對23種PGRs回收率的影響Fig.2 Effect of adsorbent on the recovery of the 23 PGRs

由圖2可知:A1、A2組合所得23種PGRs的回收率在70.0%～120%內,均能滿足痕量分析的要求;A3、A4組合中存在PSA,PSA 對2,4-滴、2-萘氧乙酸、4-氯苯氧乙酸和2,3,5-三碘苯甲酸等目標物的親和力較強,導致這4種目標物的回收率均低于40.0%;A5組合中不僅存在PSA,還存在GCB,GCB對6-芐基氨基嘌呤、6-糠氨基嘌呤、噻苯隆和氯吡脲的親和力較強,導致這4種目標物的回收率均低于30.0%。A1、A2組合雖然均能滿足痕量分析的要求,但是A2組合所得矮壯素、助壯素的回收率分別為70.9%和70.4%,回收率相對較低?？紤]到A1、A2 組合所得回收率結果與不凈化時的(70.0%～120%)基本一致,試驗選擇不加吸附劑。由于提取液未采用吸附劑凈化,儀器污染風險加大,需要縮短儀器維護周期,以延長儀器使用壽命。

2.5 基質效應

基質效應(ME)是指樣品提取液中的共提取物對目標物測定的影響。在痕量分析中,基質效應對分析結果準確度的影響無法忽略,可通過計算同濃度水平基質匹配標準溶液和標準溶液中目標物峰面積的百分比(ME 值)來評價。一般認為:ME 值在85%～115%內時基質效應較弱,對分析結果準確度影響較小,可忽略[9,12];如果超過了上述范圍,則說明基質效應不能忽略。按照試驗方法處理黨參、當歸空白樣品,分別以空白樣品溶液和50%乙腈溶液作稀釋劑,配制對應的混合標準溶液,按照儀器工作條件測定。結果顯示,黨參和當歸基質中有78.3%目標物的ME 值不在85%～115%內,說明大部分目標物的基質效應無法忽略。為了降低基質效應的影響,試驗采用基質匹配法定量。

2.6 工作曲線和測定下限

按照試驗方法測定基質匹配混合標準溶液系列,以各目標物的質量濃度為橫坐標,其對應的定量離子的峰面積為縱坐標繪制工作曲線。結果顯示,黨參和當歸基質中各目標物的質量濃度均在一定范圍內(表3)和對應的峰面積呈線性關系,工作曲線的相關系數均不小于0.990 0。以10倍信噪比(S/N)計算測定下限(10S/N),結果見表3。

表3 線性范圍和測定下限Tab.3 Linear ranges and lower limits of determination

2.7 精密度和回收試驗

按照試驗方法分別對黨參、當歸空白樣品進行低、中、高等3個濃度水平(3,10,50μg·kg－1)的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定5次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)。結果顯示,23種PGRs在黨參、當歸兩種基質中的回收率為75.2%～109%,測定值的RSD 為1.8%～13%,滿足痕量分析要求。

2.8 樣品分析

按照試驗方法分析收集到的46批黨參和30批當歸樣品,結果顯示:3-吲哚乙酸、矮壯素、多效唑、4-硝基苯酚鈉、5-硝基愈創木酚鈉等5 種PGRs被檢出,其中3-吲哚乙酸、4-硝基苯酚鈉、5-硝基愈創木酚鈉在所有樣品中幾乎均被檢出且檢出量較大,其他兩種PGRs檢出量均較低。3-吲哚乙酸毒性較低且植物能夠微量產生,5-硝基愈創木酚鈉已被聯合國糧農組織推薦為綠色食品工程PGRs,這兩種PGRs的檢出情況無需關注;4-硝基苯酚鈉在黨參和當歸中的檢出量分別為19.6～169.3μg·kg－1和13.6～191.4μg·kg－1。參考GB 2763－2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》對蔬菜或水果中復硝酚鈉(5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉、鄰硝基苯酚鈉和4-硝基苯酚鈉)殘留限量(100μg·kg－1)的規定,有5批黨參(檢出率10.9%)、2 批當歸(檢出率6.7%)中4-硝基苯酚鈉的殘留量超標。這是由于種植時使用了復硝酚鈉類PGRs產品,而4-硝基苯酚鈉在自然界中難以降解,進一步被作物吸收,導致作物中4-硝基苯酚鈉殘留量超標。

本工作通過優化前處理條件和儀器工作條件,提出了UHPLC-MS/MS 同時測定黨參、當歸中23種PGRs殘留量的方法。該方法簡單、準確、可靠,符合痕量分析要求,可為中藥材中PGRs殘留量的測定提供參考。黨參和當歸中均存在4-硝基苯酚鈉超標現象,下一步應加強該方面的監管,并開展PGRs對中藥材質量影響的研究。