QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定茶葉中伏馬毒素B1、B2、B3 的含量

梁劍鋒 ,李 亞* ,賓月景 ,溫 宇 ,蔣德莉 ,梁燕妮

(1.梧州學院 食品與制藥工程學院,梧州 543002;2.梧州學院 六堡茶現代產業學院,梧州 543002;3.梧州市食品藥品檢驗所,梧州 543002)

伏馬毒素是一種由串珠鐮刀菌產生的水溶性代謝產物,是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結構類似的雙酯化合物。目前發現的伏馬毒素有53種,主要以伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3等3種形式存在[1-3]。2017年,世界衛生組織國際癌癥研究機構將伏馬毒素B1、伏馬毒素B2列為2B類致癌物,這兩種毒素對人和家畜有急性毒性及潛在的致癌性。伏馬毒素在玉米、高梁、大豆和豌豆等植物性作物食品中經常被檢出[4-6]。近年來,普洱茶等后發酵茶葉是否受到了有害真菌毒素污染的話題成了社會熱點,茶葉的飲用安全受到了消費者的廣泛關注[7-9]。在茶葉特別是后發酵茶葉生產加工過程中,雖然有高溫雙蒸、干燥等工藝進行滅菌,但是在渥堆發酵、陳化、倉儲過程中茶葉水分比較高,容易滋生一些真菌,增大了茶葉受到伏馬毒素污染的風險[10-12]。目前我國尚未對食品中伏馬毒素殘留量進行安全限量規定,因此研究茶葉中伏馬毒素的檢測方法,對于制定茶葉中伏馬毒素殘留安全限量標準具有現實意義。

食品中伏馬毒素的檢測方法主要有酶聯免疫吸附測定法(ELISA)[13-14]、高效液相色譜法(HPLC)[15-16]、液相色譜-質譜法(LC-MS)[17-19],其中LC-MS具有靈敏度高、抗干擾能力強、選擇性好的特點,應用較為廣泛。相關前處理方法主要有免疫親和柱法、固相萃取法、凝膠色譜凈化法等,但這些方法存在操作繁瑣、檢測成本高、適用范圍窄等缺點。QuEChERS具有高效、經濟、快速等特點,在食品檢測前處理中被廣泛使用[20-21],適合應用在蔬菜和茶葉等植物性食品中農殘、真菌毒素項目的檢測。因此,本工作以QuEChERS前處理茶葉樣品,采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3的含量,可為快速開展大批量茶葉中伏馬毒素殘留檢測提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC1290-QQQ6490 型超高效液相色譜-串聯質譜儀;YF500 型中藥粉碎機;X-30 型高速冷凍離心機;Million Q 型超純水器;CPA225D 型電子天平。

混合標準儲備溶液:伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3的質量濃度均為100 mg·L－1。

混合標準中間液:500μg·L－1,取0.50 mL 混合標準儲備溶液至100 mL容量瓶中,用50%(體積分數,下同)乙腈溶液稀釋至刻度,搖勻,于－18 ℃避光保存備用。

混合標準溶液系列:取適量混合標準中間液,用50%乙腈溶液稀釋,配制成0.5,2.5,5.0,10.0,25.0,50.0,100.0μg·L－1的混合標準溶液系列。

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;無水硫酸鎂為分析純;多壁碳納米管(HC-C18)粒徑為40～63μm;試驗用水為超純水。

50批茶葉樣品購自當地市場,均具有明顯霉變特征。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agilent Poroshell 11 色譜柱(100 mm ×3.0 mm,2.7μm);柱溫35℃;流動相A 為0.1%(體積分數,下同)甲酸溶液,B為乙腈;流量0.40 mL·min－1;進樣量2.0μL。梯度洗脫程序:0～1.00 min時,A 由95%降 至90%;1.00～3.50 min 時,A 由90%降至55%;3.50～4.50 min時,A 由55%降至10%;4.50～5.50 min時,A 由10%升至95%。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI＋)模式;多反應監測(MRM)模式;毛細管電壓4 000 V;干燥氣溫度325 ℃;干燥氣流量12 L·min－1。其他質譜參數見表1,其中“*”代表定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

將茶葉樣品用中藥粉碎機粉碎,過80目(孔徑0.18 mm)篩。分取2.50 g置于50 mL 聚乙烯離心管中,加入2.0 mL水潤濕,再加入20 mL含1%(體積分數,下同)甲酸的乙腈溶液,搖勻,渦旋3 min,在4℃下以轉速4 000 r·min－1離心10 min。取出離心管,放置至室溫(約10 min),分取1.0 mL上清液,置于含有凈化劑(250 mg無水硫酸鎂和150 mg HC-C18)的2.0 mL離心管中,搖勻后渦旋3 min,在4 ℃下以轉速15 000 r·min－1離心10 min。取出離心管,放置至室溫,將上清液過0.22μm 有機相濾膜,棄去初濾液,取續濾液上機測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的選擇

取50.0μg·L－1混合標準溶液進樣分析,全掃描發現3種伏馬毒素在ESI＋模式下的響應值高于負離子模式的,母離子均為[M＋H]＋;對[M＋H]＋進行產物離子掃描,得到相應的子離子,選擇響應最強的子離子作為定量離子,響應次強的子離子作為定性離子,同時優化了碰撞能量等參數,優化結果見1.2.2節。3種伏馬毒素定量離子的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 伏馬毒素B1、B2、B3 的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of fumonisins B1,B2 and B3

2.2 提取溶劑的選擇

茶葉主要成分為茶多酚、氨基酸、咖啡堿、兒茶素、芳香物質、色素、有機酸、可溶性多糖、維生素等,其中色素和可溶性多糖等雜質[22]對目標物的干擾較強。因此,需要選擇一種既能有效提取3種目標物,又能有效降低茶葉基質干擾的提取溶劑。綜合考慮目標物、雜質、提取溶劑的物理性質后,選擇以乙腈、含1%甲酸的乙腈溶液、甲醇、含1%甲酸的甲醇溶液、體積比75∶25的甲醇-乙腈混合溶液、體積比50∶50的甲醇-乙腈混合溶液作提取溶劑,并考察了這6種提取溶劑對加標樣品(加標量10.0μg·L－1)中3種目標物回收率的影響,結果見表2。

表2 不同提取溶劑下伏馬毒素B1、B2、B3 的回收率Tab.2 Recoveries of fumonisins B1,B2 and B3 under different extraction solvents

由表2可知,采用含1%甲酸的乙腈溶液提取時3種伏馬毒素的回收率最優,回收率為87.1%～111%,其他5 種提取溶劑所得的回收率均小于70.0%。推測原因可能是:甲醇極性較乙腈的強,會將樣品中大量極性雜質提取出來,干擾目標物的測定;在乙腈中添加適量甲酸可以增加提取溶劑的酸度,抑制茶葉中酸性雜質的溶出,降低基質干擾。綜合考慮,試驗選擇的提取溶劑為含1%甲酸的乙腈溶液。

2.3 凈化劑用量的選擇

用含1%甲酸的乙腈溶液提取后,提取液中還含有無機鹽、色素、可溶性糖類等共提取雜質。試驗采用無水硫酸鎂、HC-C18等兩種凈化劑去除雜質,并考察了這兩種凈化劑用量對上述加標樣品中3種目標物回收率的影響,結果見表3。

表3 不同用量凈化劑下伏馬毒素B1、B2、B3 回收率Tab.3 Recoveries of fumonisins B1,B2 and B3 under different amounts of purifiers

由表3可知:當無水硫酸鎂用量不大于250 mg時,伏馬毒素B1、B2、B3的回收率隨著無水硫酸鎂用量的增加而增加,這可能是由于無水硫酸鎂在吸附提取液中水分的同時還吸附了樣品中水溶性較強的強極性雜質,提高了伏馬毒素B1、B2、B3的回收率;但當無水硫酸鎂用量達到300 mg時,目標物的回收率顯著下降,可能原因是過量的無水硫酸鎂在提取液中形成了大量結塊,產生局部放熱現象,導致目標物被結塊包裹,回收率下降。HC-C18主要用于去除脂溶性色素等非極性雜質,當HC-C18用量為150 mg時,3種目標物的回收率均較優。因此,試驗選擇的凈化劑為250 mg無水硫酸鎂和150 mg HC-C18。

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以各目標物的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,各目標物的質量濃度均在0.5～100.0μg·L－1內和對應的峰面積呈線性關系,其線性參數見表4。

表4 線性參數、檢出限和測定下限Tab.4 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

以3,10倍信噪比(S/N)計算出檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結果見表4。

2.5 精密度和回收試驗

在空白茶葉樣品中添加混合標準溶液,使樣品中伏馬毒素B1、B2、B3加標量達到10.0,25.0,50.0μg·kg－1,每個加標濃度水平按照試驗方法重復測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表5。

表5 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表5可知,伏馬毒素B1、B2、B3的回收率為82.1%～108%,測定值的RSD 為2.7%～5.3%,均符合GB/T 27404－2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》附錄F.1、F.2要求,說明該方法適用于茶葉中伏馬毒素B1、B2、B3安全檢測分析與風險防控。

2.6 樣品分析

按照試驗方法分析50批市售茶葉樣品,在一批黑茶樣品中檢測出了伏馬毒素B1,檢出量為8.321μg·kg－1,說明茶葉中有伏馬毒素殘留,需加強監測與調查,并盡快制定茶葉類食品中伏馬毒素殘留安全限量的相關標準。

本工作提出了Qu ECh ERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定茶葉中伏馬毒素B1、B2、B3含量的方法,方法具有操作簡單、分析成本低、回收率高等優點,適用于高纖維茶葉類基體中伏馬毒素B1、B2、B3的檢測,可為茶葉中真菌毒素殘留的調查與防控工作提供技術支撐。