余氯對小球藻和錦鯉的毒性效應研究

馬原野， 丁 誼， 李自榮， 趙珊珊

(1.信陽市南灣水庫事務中心， 河南信陽 464000； 2.信陽農林學院水產學院， 河南信陽 464000)

氯制劑作為一類常用的消毒劑被廣泛地應用在人們的日常生活和生產中。 當前，生活污水、工業廢水及農業面源污染使得自然水體含有較高的余氯，尤其在養殖業，氯制劑的使用更加頻繁，如在水產養殖過程中，常使用氯制劑對養殖環境進行消毒，以便消除養殖環境中的病原或病原宿主， 來切斷病害的水平傳播途徑[1]。 此外，由于自然水域含有高濃度的余氯， 在注水或換水過程中往往也使養殖水體賦加了過量的氯。

小球藻是一種單細胞藻類， 在自然界中分布范圍廣泛。 另外， 小球藻也是重要的生物指示物種之一，對環境污染的反應非常靈敏，因此其被廣泛應用于環境毒理學研究中。 已有研究結果表明，不同濃度的余氯會對小球藻的生長狀況產生影響， 而且小球藻會對低濃度的余氯表現出一定適應性， 使其生長加快，藻細胞濃度上升[2]，但到達一定濃度以后，余氯毒性累積表現出抑制效應[3]。

余氯對魚類的呼吸、鰓組織、血紅蛋白含量也會產生一定的影響[4]，而且不同濃度的余氯會對魚苗產生不同程度的毒性效應[5]，余氯可以使魚類的活動減緩和鰓絲損傷、死亡等危害[6]。

基于以上原因， 為了深入探究不同濃度余氯對魚類和藻類的影響，本實驗以常見的藻類和魚類，即以小球藻和錦鯉為例， 驗證余氯對魚類和藻類的毒性效應，為水產養殖業余氯控制、減少余氯對養殖動物和養殖環境的影響提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

f/2培養基：微量元素、維生素、硅酸鈉（10 mg/L）、硝酸鈉與磷酸二氫鈉復合物、蒸餾水；篩選來自信陽農林學院水產繁育基地的錦鯉約150尾 （10 g/尾）、500 mL錐形瓶、小球藻藻種、牛皮紙、皮筋、光照培養箱、顯微鏡、10 mL量筒、余氯檢測儀、玻璃棒、廣口瓶、移液器、浮游植物計數板、計數器、塑料箱、充氣泵、蓋玻片、載玻片、解剖刀、標簽紙。 試驗用于配制余氯溶液的次氯酸鈉（活性氯含量≥7.5%）購自鄭州派尼化學試劑廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 余氯母液的配制方法

取2 mL次氯酸鈉溶液加入量筒中， 再加入8 mL的蒸餾水中稀釋5倍。 隨后取10 mL稀釋后的溶液倒入盛有7 L經過充分曝氣的自來水中，用玻璃棒攪拌均勻，取10 mL經充分曝氣的自來水加入比色瓶中調零，調零后加余氯檢測試劑(HR)，搖勻至無粉末狀顆粒后擦干，放入余氯檢測儀中，計時1分鐘后讀數，讀出余氯濃度為8.79 mg/L。 以此余氯母液濃度按一定比例稀釋至實驗所需濃度即可。

1.2.2 小球藻的毒性試驗方法

余氯濃度的設置：根據黃洪輝等研究，當余氯濃度低于0.02 mg /L時， 對海洋生物的毒性作用非常小[7]。 因此，當余氯濃度低于0.02 mg /L時毒性試驗不予考慮。 預實驗結果表明：藻類在0.1-1.5 mg/L的余氯濃度下，小球藻的生長情況差別不明顯。 因此，本實驗中余氯濃度分別設置為A：0 mg/L、A1：0.5 mg/L、A2：1.0 mg/L、A3：1.5 mg/L、A4：2.0 mg/L、A5：2.5 mg/L、A6：5.0 mg/L、A7：7.5 mg/L。

在余氯對小球藻的毒性實驗中， 首先按照f/2培養基配方，配制f/2培養基，隨后在每一實驗組的錐形瓶中倒入350 mLf/2培養基溶液， 然后分別在每組錐形瓶中接入1 mL的小球藻藻種，混合均勻后，再加入不同濃度的余氯溶液， 經計算每個對照組與實驗組錐形瓶中需要加入余氯溶液的體積分別為：0 uL、28.5 uL、56.8 uL、85.3 uL、113.8 uL、142.3 uL、284.3 uL、426.5 uL，隨后將各錐形瓶中的溶液搖晃混勻，用牛皮紙包扎好， 打亂順序， 隨機將錐形瓶放入光照培養箱中，光照周期為12L∶12D。每天手動搖晃錐形瓶3次。分別在培養至24 h、96 h時，將不同組錐形瓶中的藻細胞培養液充分搖勻， 取對照組和實驗組錐形瓶中的液體1 mL放入離心管中， 搖勻后用移液器吸取100 uL液體到浮游植物計數板中， 在光學顯微鏡下進行計數。

1.2.3 錦鯉的毒性試驗方法

余氯濃度的設置：根據林可椒等研究，當余氯濃度低于0.02 mg /L時， 對魚類產生的毒性作用較小[8]。在此，當余氯濃度低于0.02 mg /L 時毒性試驗不予考慮。 預實驗的結果表明：余氯濃度在0.1-1.5 mg/L時， 對錦鯉產生毒性作用較小，12 h、24 h、48 h時間段內錦鯉正常游動， 沒有死亡現象。 基于以上因素，余氯濃度設置分別為：0（對照組）B：0 mg/L、B1：0.5 mg/L、B2：1.0 mg/L、B3：1.5 mg/L、B4：2.0 mg/L、B5：2.5 mg/L、B6：5.0 mg/L、B7：7.5 mg/L。

在余氯對錦鯉的毒性實驗中， 對照組和實驗組各設置3組平行實驗，實驗首先將對照組和實驗組的每個塑料箱加7 L經過曝氣2天的自來水， 然后經過計算，在對照組與實驗組中分別加入的余氯體積為：0 uL、570 uL、1135 uL、1705 uL、2275 uL、2845 uL、5685 uL、8530 uL，用玻璃棒攪拌均勻，隨后在對照組和實驗組每個塑料箱中分別放入4條錦鯉（來自信陽農林學院水產繁育基地， 規格約10 g/尾）， 分別在24h、48h時觀察錦鯉活動狀況、存活情況，并在48h后分別取每個塑料箱中仍存活的錦鯉1條，并剪取適量鰓絲，在顯微鏡下觀察錦鯉鰓絲損傷情況。

2 結果與討論

2.1 小球藻的生長情況

在24 h和96 h觀察不同余氯濃度下錐形瓶中小球藻的生長情況（圖1A、B）。 結果表明，小球藻對余氯具有一定的敏感性，在24 h時，實驗組和對照組的小球藻生長狀況逐漸呈現出差異性， 當余氯濃度≤0.5 mg/L時，小球藻生長狀況良好，培養液顏色為淺綠色，當余氯濃度為1.0 mg/L時，培養液顏色變淺，為淡綠色，余氯濃度＞1.0 mg/L時，小球藻生長開始受到明顯抑制， 培養液無色； 在96 h時， 當余氯濃度≤1.0 mg/L時， 實驗組與對照組小球藻生長狀況相似， 培養液顏色均為深綠色， 當余氯濃度＞1.0 mg/L時，小球藻生長受到明顯抑制，培養液無色。

圖1 各實驗組24 h（A）和96 h（B）小球藻生長情況

實驗結果表明，從24 h至96 h，小球藻對低濃度余氯呈現出一定適應性，且小球藻生長速度加快，藻細胞濃度上升，培養液顏色由淺綠色變為深綠色，但小球藻在高濃度的余氯下生長受到明顯抑制， 培養液顏色不發生變化，仍為無色。

2.2 小球藻對余氯的敏感性

在本實驗中，在24 h、96 h，對各組單位體積小球藻培養液中小球藻數量進行了顯微計數，結果如表1所示。

表1 24 h和96 h時各組小球藻的數量（1＊10^6）

實驗結果表明，同一時間內，小球藻在不同濃度余氯下， 其生長狀況存在明顯差異。 余氯濃度為0.5 mg/L時，與對照組相比，余氯對小球藻的生長出現了促進作用，但當余氯濃度＞0.5 mg/L，余氯對小球藻的生長產生了抑制， 且余氯濃度達到2.0 mg/L時，小球藻的生長速率比對照組下降50%以上， 出現了明顯的抑制效應。 此外，培養時間從24 h到96 h時，隨著時間的延長，小球藻在相同濃度的余氯下，生長狀況也出現明顯差異。 當余氯濃度≤1.5 mg/L時，隨著時間增長，小球藻數量急劇增加，而當余氯濃度＞1.5 mg/L，隨著時間增長，小球藻數量出現了明顯下降。

實驗結果表明，小球藻對余氯的敏感性較高，余氯濃度的提高和攻毒時間的延長都會加劇對其生長的抑制。

2.3 余氯對錦鯉的毒性效應

在本實驗中，在24 h和48 h分別對不同余氯濃度下的錦鯉活動情況進行了觀察。 在24 h時，觀察錦鯉的活動情況，發現不同濃度的余氯對錦鯉活動、存活產生一定的影響，當余氯濃度≤1.5 mg/L，錦鯉的活動正常，當余氯濃度＞1.5 mg/L，錦鯉活動異常，時而性情急躁，時而游動緩慢，多在水上層游動，且在余氯濃度為7.5 mg/L時，錦鯉出現了死亡現象。 在48 h時，觀察錦鯉的活動情況發現，當余氯濃度≤1.5 mg/L，錦鯉亦正?；顒?， 但當余氯濃度為5.0 mg/L和7.5 mg/L時，錦鯉的活動異常緩慢，身體側游，并且死亡率逐漸上升。

余氯可以使魚鰓組織增生，并且積滿黏液，在錦鯉受余氯污染的影響方面， 錦鯉的主要表現為活動減緩、性情暴躁、鰓絲受損、魚體表面黏液增多、缺氧、死亡等毒性反應[9]。 本實驗中，在48 h分別取對照組和實驗組中錦鯉一條， 取鰓絲并在顯微鏡下進行觀察（圖2）。從圖中可以看出，余氯濃度為1.5 mg/L時對錦鯉鰓絲產生的影響不明顯，鰓絲顏色正常，沒有潰爛。 余氯濃度＞1.5 mg/L時，余氯對錦鯉的鰓絲產生了損傷，錦鯉的鰓絲出現發白，顏色變淡，甚至出現爛鰓現象。 因此，在對水體進行消毒時，應當采取適當措施控制余氯含量，防止余氯超標，進而對水生生物產生不良影響。

圖2 各實驗組48 h錦鯉鰓絲狀況顯微觀察

2.4 余氯對錦鯉死亡率的影響

實驗結果表明， 培養時間在24 h， 余氯濃度為7.5 mg/L時，錦鯉的死亡率達到50%，而對照組和其他實驗組的錦鯉均未出現死亡現象。 培養時間在48 h時， 當余氯濃度為5 mg/L， 錦鯉的死亡率達到50%，而當余氯濃度上升至7.5 mg/L時，錦鯉的死亡率達到100%。 實驗結果表明，高濃度余氯對錦鯉的毒性效應非常明顯， 余氯濃度和培養時間的增加都會導致其死亡率增加。

3 小結

本實驗以小球藻和錦鯉為例， 我們初步了解到余氯對藻類和魚類產生的影響， 并發現余氯對藻類和魚類的毒性效應存在濃度和時間依賴性， 亦即過高的余氯濃度會對藻類和魚類在短時間內產生損傷或引起死亡， 而藻類和魚類長時間暴露在較低濃度的余氯環境中時也會對其造成損傷，甚至引起死亡。