一氧化氮參與調控油菜素內酯增強高山離子芥懸浮細胞抗寒性

劉亞潔 安黎哲

（1.蘭州大學草種創新與草地農業生態系統全國重點實驗室/農業農村部草牧業創新重點實驗室/草地農業教育部工程研究中心/草地農業科技學院，蘭州 730020； 2.蘭州大學生命科學學院，蘭州 730000； 3.北京林業大學生態與自然保護學院，北京 100083）

低溫是限制植物分布、生長、發育和降低農作物產量的最為嚴重的脅迫因子之一［1］。植物可以通過改變其細胞代謝和激活各種防御機制響應和適應低溫。低溫誘導植物體內產生過量的活性氧（ROS），包括過氧化氫（H2O2）、單線態氧（1O2）、超氧陰離子（O·–2）和羥自由基（OH-）［2］，過量產生的ROS 可導致膜脂過氧化程度加劇、DNA 損傷和蛋白質變性，也就是氧化損傷［1，3］。低溫脅迫造成的氧化損傷是植物敏感組織響應低溫的最初反應，也是造成低溫損傷的一個重要因素［3］。植物體內有效清除ROS，修復氧化損傷的保護機制是抗氧化防御系統，它包括酶促和非酶促防御系統兩類。酶促防御系統包括各種抗氧化酶如抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）等。非酶類抗氧化劑包括脂溶性抗氧化劑（維生素E、類胡蘿卜素）和水溶性抗氧化劑［抗壞血酸（AsA）、還原性谷胱甘肽（GSH）］［2］。諸多研究表明植物抗低溫脅迫能力的增強通常與抗氧化防御能力的提高密切相關，這對清除過量的ROS和修復低溫造成的氧化損傷具有重要作用［3-4］。因此開展植物低溫脅迫響應機制的研究及預防低溫對植物造成傷害具有重要意義。

油菜素內酯（BRs）是一類甾醇類植物激素，在植物界中普遍存在，其中24-表油菜素內酯（EBR）是使用最多、用途最廣泛的一種。BRs 可以增強植物對低溫、干旱、鹽、高溫、金屬離子和病原體侵染等各種非生物和生物脅迫的抗逆性，特別是在緩解低溫對植物造成的損傷以及提高植物耐冷性方面表現出良好效果［2，5-6］。研究表明，BRs提高植物抗寒性與其提高細胞膜穩定性，調節光合作用以及增強細胞的滲透調節能力有關［6-9］。BRs 還可以通過影響植物膜脂脂肪酸的組成及不飽和程度來調節其對低溫脅迫的響應［10-11］。

一氧化氮（NO）是一種具有生物活性的小分子氣體自由基，它可以自由擴散透過細胞膜，參與調控植物生長發育的許多過程，如種子的萌發和休眠、植物組織的生長和發育、光形態建成、植物細胞的成熟和衰老、開花、氣孔關閉以及程序性細胞凋亡等［12-14］。在植物對各種生物及非生物脅迫的響應過程中，如干旱、鹽、極端溫度、紫外輻射、機械損傷、除草劑、臭氧、重金屬以及病原體侵襲，NO 作為一個重要的信號分子發揮調節功能，緩解逆境造成的損傷，提高其抗逆性［13-15］。已有研究證實NO 通過參與滲透調節、維持細胞膜的完整性以及提高抗氧化酶活性等增強植物的抗寒能力［3-4，16］。植物細胞內NO 的產生主要有以下途徑，即類似于哺乳動物一氧化氮合酶（NOS）、硝酸還原酶（NR）、其他酶促反應如亞硝酸還原酶和黃嘌呤氧化酶以及非酶促反應［12，15］。此外，NO 在植物激素如生長素、細胞分裂素、脫落酸等調控的生理反應中發揮重要作用［12-14］，然而，作為第六大類植物激素，BRs 增強植物抗寒性是否與NO 信號分子有關的研究鮮見報道，NO 在BRs 調控植物響應低溫脅迫中的作用機理及信號路徑尚不明確。高山離子芥（Chorispora bungeana）是十字花科（Brassicaceae）離子芥屬（Chorispora）的高山冰緣多年生草本植物，和模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）有較高同源性，是低溫逆境生理學研究的理想材料［17］。本研究以高山離子芥懸浮細胞作為一個未分化的、均一的、相對脆弱的植物細胞模型，通過用NO 清除劑PTIO 以及NOS 抑制劑L-NAME進行處理，研究在NO 信號阻斷的情況下BRs 對細胞抗寒程度、ROS 水平和抗氧化防御系統的影響，闡明NO 信號分子是否與BRs 提高細胞抗寒性、BRs 在低溫脅迫下調節ROS 水平以及抗氧化防御有關，從而揭示BRs 誘導提高植物抗寒性的信號轉導機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

高山離子芥取材于新疆天山烏魯木齊河源區（43°46′N，87°15′E，海拔3 700 m），懸浮細胞的培養參照Guo等［18］的方法。

為探究低溫脅迫下BRs 對高山離子芥懸浮細胞抗寒性的影響，將培養好的處于指數生長期的同一批材料轉接于0.01、0.10、1.00 μmol·L-1EBR和不加EBR的MS液體培養基中，隨后置于光照培養箱中25、4、0 ℃搖床培養處理3 d，搖床轉速為120 r·min-1。處理結束后，用雙層篩網（400 目）過濾細胞，并用蒸餾水清洗3 遍，用濾紙吸干表面水分，鮮樣稱取質量，測定相關生理指標。

為了探究BRs 對高山離子芥抗寒性的影響是否受NO 信號分子調控，將懸浮培養好的處于指數生長期的同一批材料轉接于加入不同化學試劑的MS 液體培養基中進行處理。這些處理包括：（1）滅 菌 水；（2）0.1 μmol·L-1EBR；（3）100 μmol·L-1SNP（硝 普 鈉，外 源NO 供 體）；（4）0.1 μmol·L-1EBR+100 μmol·L-1PTIO；（5）0.1 μmol·L-1EBR+300 μmol·L-1L-NAME；（6）100 μmol·L-1PTIO；（7）300 μmol·L-1L-NAME。隨后將這些處理的懸浮細胞分為3 組，一組在光照培養箱中25 ℃培養，而另外兩組分別置于4 ℃和0 ℃低溫培養箱中，搖床培養3 d，以不加任何化學試劑處理并培養于25 ℃的細胞作為對照。處理結束后收集細胞測定相關指標。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 相對細胞活力測定

細胞活力的主要生理指標是氯化三苯四氮唑（TTC）還原能力［18］。0.2 g細胞中加入0.4% TTC 溶液和100 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH=7.0）于25 ℃下避光反應13 h，棄去上清液，用蒸餾水洗滌細胞3次后，再加入95%乙醇，60 ℃溫浴30 min，靜置于室溫下至細胞無色，取上清測定485 nm處吸光值，以光密度值的大小表示細胞活力。

相對細胞活力=處理細胞活力/未經任何處理細胞活力×100%。

1.2.2 相對離子滲漏率和膜脂過氧化程度測定

相對離子滲漏率測定參照Zhao等［19］的方法并稍加修正，即取樣結束，細胞中加入16 mL 去離子水，真空抽氣8 min，抽氣3 次，每次間隔2 min，然后震蕩使上下層液體混勻，靜置20 min，測電導率C1，沸水浴30 min，自來水冷卻10 min，震蕩待靜置1 h 后，測電導率C2，用公式計算相對離子滲漏率（C1/C2×100%）。膜脂過氧化程度用丙二醛（MDA）含量表示，采用硫代巴比妥酸法測定［20］。

1.2.3 NO含量和NOS活性測定

NO 含量和NOS 活性的測定參考Liu 等［21］的方法。

1.2.4 ROS含量測定

用硫酸鈦法測定H2O2含量，OH–含量的測定采用2-脫氧核糖法［21］。采用Zhao等［19］的方法并稍加修改測定O·–2產生速率。收集的懸浮細胞用65 mmol·L-1PBS（pH=7.8）緩沖液研磨，提取液于4 ℃下5 000g離心10 min。取上清加入65 mmol·L-1PBS（pH=7.8）和10 mmol·L-1鹽酸氫氨，于25 ℃下溫浴20 min，再加入對氨基苯磺酸和α-萘胺，于25 ℃下繼續溫浴20 min，在530 nm處測定吸光值。

1.2.5 抗氧化酶類活性測定

收集的懸浮細胞用50 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液（含1% PVP，pH=7.8）冰浴研磨提取，提取液于4 ℃，15 000g離心20 min，上清液用于酶活性分析，用考馬斯亮藍G-250 法測定蛋白濃度。APX 活性測定用AsA 比色法，CAT 活性采用H2O2分解法測定，GR 活性采用測定NADPH 氧化速率的方法，POD活性測定采用愈創木酚顯色法，SOD 活性測定采用氮藍四唑光化學還原法［21］。

1.2.6 抗氧化劑含量測定

收集的細胞用0.5 mmol·L-1EDTA 溶液（含3%三氯乙酸）研磨提取，提取液于4 ℃，15 000g離心10 min，上清液用于抗氧化劑含量分析。AsA 含量采用2，6-二氯酚錠酚（DCPIP）光度測定法，GSH含量用5，5-二硫代對硝基苯甲酸（DTNB）比色法進行測定［21］。

1.3 數據處理

所有試驗重復3 次，用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計和方差分析，不同處理數據之間的差異性用Duncan 多重檢驗進行分析，當P<0.05 認為有顯著性差異。用Origin 9.0繪制數據圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度EBR 對離子芥懸浮細胞抗寒性的影響

如圖1 所示，在4 ℃和0 ℃脅迫下，不加EBR處理的懸浮細胞活力分別降低至正常溫度下細胞活力的81.4%和78.4%，相對離子滲漏率增加了36.8% 和63.6%，MDA 質量摩爾濃度也升高了19.7%和37.9%，說明低溫處理明顯抑制離子芥懸浮細胞活力，導致相對離子滲漏率和MDA 質量摩爾濃度顯著升高，而且這種變化隨著溫度的降低表現得越為明顯。

圖1 在正常生長溫度（25 ℃）和低溫脅迫下（4 ℃和0 ℃），不同濃度EBR 處理對高山離子芥懸浮細胞相對活力（A）、相對離子滲漏率（B）和MDA 質量摩爾濃度（C）的影響圖中數據為平均值±標準差；柱上不同字母表示經Duncan 法檢驗在P<0.05水平差異顯著；下同。Fig.1 Effects of different EBR concentrations on relative cell viability（A），relative ion leakage（B） and MDA molality（C） in the suspension cultured cells from C. bungeana under normal growth temperature（25 ℃） and chilling stres（s4 ℃ and 0 ℃）Each value represented mean±standard deviation；Different letters on the bars indicated significant difference at P<0.05 level by Duncan test；the same as below.

不同濃度EBR處理對正常溫度下（25 ℃）生長的懸浮細胞的細胞活力、相對離子滲漏率和MDA質量摩爾濃度沒有產生顯著影響。而在4 ℃低溫環境下，與不加EBR 單獨低溫處理相比，0.01、0.10、1.00 μmol·L-1EBR 處理細胞相對活力分別提高了12.4%、19.4%和6.3%，相對離子滲漏率降低了10.7%、21.7%和6.9%，同時MDA 質量摩爾濃度顯著降低了9.5%、15.1%和8.6%。在0 ℃低溫環境下不同濃度EBR 處理對上述生理指標的影響與在4 ℃類似，表明EBR能夠明顯緩解低溫脅迫下細胞活力的下降及離子滲漏率和MDA質量摩爾濃度的增加。另外，在3 種處理濃度中，0.10 μmol·L-1EBR 對低溫脅迫下懸浮細胞的保護效果最理想，在后續試驗中使用該濃度EBR處理細胞。

2.2 EBR、EBR+PTIO 以及EBR+L-NAME 對離子芥懸浮細胞抗寒性的影響

由圖2 所示，在常溫下，EBR、EBR+PTIO 以及EBR+L-NAME 處理細胞的相對活力、相對離子滲漏率、MDA 質量摩爾濃度沒有顯著性差異。而在低溫脅迫下，EBR 處理可以明顯提高懸浮細胞相對活力，降低相對離子滲漏率和MDA 質量摩爾濃度。在4 ℃低溫脅迫下，與只加入EBR 處理相比，EBR+PTIO、EBR+L-NAME復合處理細胞的相對活力顯著降低了21.8%和35.8%，而相對離子滲漏率明顯升高了80.0%和79.4%，同時MDA 質量摩爾濃度明顯增加了27.8%和23.7%。在0 ℃低溫環境下，EBR、EBR+PTIO 以及EBR+L-NAME 對相對細胞活力、相對離子滲漏率和MDA 質量摩爾濃度的影響與4 ℃環境下類似。由此可見在低溫脅迫下，EBR中加入PTIO或L-NAME復合處理細胞時，EBR對細胞的保護作用被抑制。

圖2 在正常生長溫度（25 ℃）和低溫脅迫下（4 ℃和0 ℃），EBR、PTIO 以及L-NAME處理對高山離子芥懸浮細胞相對活力（A）、相對離子滲漏率（B）和MDA質量摩爾濃度（C）的影響EBR.0.1 μmol·L-1 EBR；EBR+PTIO.0.1 μmol·L-1 EBR+100 μmol·L-1 PTIO；EBR+L-NAME.0.1 μmol·L-1 EBR+300 μmol·L-1 L-NAME；下同。Fig.2 Effects of EBR，PTIO and L-NAME on relative cell viability（A），relative ion leakage（B） and MDA molality（C） in the suspension cultured cells from C. bungeana under normal growth temperature（25 ℃） and chilling stress（4 ℃ and 0 ℃）EBR.0.1 μmol·L-1 EBR；EBR+PTIO.0.1 μmol·L-1 EBR+100 μmol·L-1 PTIO；EBR+L-NAME.0.1 μmol·L-1 EBR+300 μmol·L-1 L-NAME；the same as below.

2.3 低溫脅迫下EBR 對離子芥懸浮細胞NO 含量和NOS活性的影響

如圖3 所示，在4 ℃和0 ℃低溫下，細胞NO 質量摩爾濃度分別升高了62.2%和83.1%，而NOS活性也同時上升了78.1%和139.3%，說明低溫處理可明顯提高細胞內源NO 質量摩爾濃度和NOS 活性，這種變化隨著溫度的降低表現的越為顯著。在正常生長狀況下（25 ℃），EBR 處理略微提高了細胞NO 質量摩爾濃度和NOS 活性。而在4 ℃和0 ℃低溫環境下，與僅處于逆境脅迫的細胞相比，EBR 處理細胞的NO 質量摩爾濃度分別顯著提高了44.6%和40.0%，NOS 活性也明顯增加了58.6%和32.5%，表明EBR 處理可以影響細胞內源NO 質量摩爾濃度和NOS活性，在低溫脅迫下，EBR 處理細胞的內源NO 水平和NOS 活性更高。在4 ℃和0 ℃低溫下，EBR+PTIO 復合處理明顯抑制了EBR對NO 質量摩爾濃度的誘導提高效應，與單獨EBR處理相比NO 質量摩爾濃度降低了65.3% 和55.8%，但EBR、EBR+PTIO 處理細胞的NOS 活性沒有顯著差異。同時，在低溫下NOS 抑制劑LNAME 的加入也顯著抑制了EBR 對NO 積累的促進效應，與4 ℃和0 ℃單獨EBR 處理相比NO 質量摩爾濃度降低了64.3%和43.5%。此外，L-NAME也可以抑制EBR處理增強的NOS活性。

圖3 在正常生長溫度（25 ℃）和低溫脅迫下（4 ℃和0 ℃），EBR、PTIO 以及L-NAME 處理對高山離子芥懸浮細胞NO質量摩爾濃度（A）和NOS活性（B）的影響Fig.3 Effects of EBR， PTIO and L-NAME on NO molality（A） and NOS activity（B） in the suspension cultured cells from C. bungeana under normal growth temperature（25 ℃） and chilling stress（4 ℃ and 0 ℃）

2.4 SNP、PTIO 以及L-NAME 對離子芥懸浮細胞抗寒性的影響

在4 ℃和0 ℃環境下，NO 供體SNP 處理懸浮細胞的相對活力相比單純低溫處理顯著提高了13.6% 和20.7%，相對離子滲漏率明顯減少了22.6%和36.6%，同時MDA 質量摩爾濃度也顯著降低了12.4%和26.8%（見圖4：A～C），表明NO 能夠明顯抑制低溫脅迫下細胞活力的降低以及離子滲漏率和MDA 質量摩爾濃度的升高。在4 ℃低溫下，與僅受逆境脅迫處理的細胞相比，PTIO 或LNAME 會導致相對細胞活力明顯下降，降低的程度達到51.0%和52.1%，同時相對離子滲漏率顯著升高了57.2%和42.5%，MDA 質量摩爾濃度增加了23.6%和19.8%。在0 ℃低溫環境下，SNP、PTIO以及L-NAME 對相對細胞活力、相對離子滲漏率和MDA 質量摩爾濃度的影響與4 ℃環境下類似。在正常生長溫度（25 ℃）下，SNP、PTIO、L-NAME處理細胞的相對活力、相對離子滲漏率和MDA 質量摩爾濃度沒有顯著性差異，說明SNP、PTIO 及LNAME對常溫下生長的懸浮細胞不會產生影響。

此外，圖4D～E 顯示，無論在正常生長溫度還是在低溫脅迫下，與不加任何試劑處理的細胞相比，雖然SNP 是NO 的供體可以促進懸浮細胞內源NO 質量摩爾濃度大幅度上升，然而卻明顯抑制細胞NOS 活性，PTIO 是NO 清除劑可以降低細胞NO水平，但卻增強了NOS 活性，這表明細胞NO 質量摩爾濃度與其NOS 活性之間存在反饋抑制。LNAME 處理在抑制細胞NOS 活性的同時也降低了細胞NO質量摩爾濃度。

2.5 低溫脅迫下EBR、SNP、PTIO以及L-NAME對離子芥懸浮細胞ROS含量的影響

如圖5 所示，懸浮細胞處于低溫環境時，與對照相比其H2O2質量摩爾濃度、O·–2產生速率和OH-含量明顯上升，這種變化隨著溫度的降低表現的越為顯著，在4 ℃和0 ℃低溫下，H2O2質量摩爾濃度增加了66.5%和105.9%，O·–2產生速率升高了84.3%和114.0%，同樣OH–含量增加了45.9%和53.0%。在4 ℃環境下，外源EBR 處理細胞的H2O2質量摩爾濃度、O·–2產生速率和OH-含量相比僅處于低溫脅迫的細胞明顯下降了30.2%、42.0%和27.1%，而在EBR 中加入PTIO 后H2O2質量摩爾濃度、O·–2產生速率和OH–含量又顯著增加，相比單獨EBR 處理分別增加了101.3%、83.0%和33.0%，同樣EBR+L-NAME 與單獨EBR 處理相比上述指標分別明顯增加了90.7%、64.8%和37.1%。在0 ℃，EBR、EBR+PTIO 以及EBR+L-NAME 對H2O2質量摩爾濃度、O·–2產生速率和OH–含量的影響與4 ℃類似。由此可見EBR 可以抑制低溫所引起的ROS大量積累，而用PTIO清除NO或用L-NAME抑制NOS 活性可以阻抑EBR 降低ROS 含量的這種生理效應。

在4 ℃和0 ℃脅迫下，SNP 處理細胞的H2O2質量摩爾濃度相比單純低溫處理顯著降低了26.3%和34.2%，O·–2產 生 速 率 明 顯 減 少 了43.6% 和42.3%，同時OH-含量也顯著降低了28.5% 和18.4%，說明NO 也可以抑制低溫所引起的ROS 大量積累。另外，與僅受低溫脅迫的細胞相比，PTIO或L-NAME 單獨處理會明顯提高細胞的H2O2質量摩爾濃度、O·–2產生速率和OH-含量。

2.6 低溫脅迫下EBR、SNP、PTIO以及L-NAME對離子芥懸浮細胞抗氧化防御系統的影響

與對照相比，低溫脅迫下懸浮細胞APX、GR、POD 和SOD 活性明顯升高，而CAT 活性卻被脅迫逆境抑制，在4 ℃和0 ℃低溫下，CAT 活性下降了18.1%和38.8%（見圖6）。在4 ℃，外源EBR 處理后APX、CAT、GR、POD 和SOD 活性顯著增強，相比單獨低溫脅迫分別明顯增加了54.1%、30.8%、36.7%、42.5%和29.3%，外源SNP 處理同樣也顯著提高了上述抗氧化酶活性。在0 ℃，EBR 以及SNP對APX、CAT、GR、POD 和SOD 活性的影響與4 ℃類似。如圖7 所示，低溫處理下懸浮細胞AsA 和GSH 質量摩爾濃度顯著增加，與對照相比，在4 ℃脅迫下增加了44.2%和90.5%，在0 ℃脅迫下增加了20.9%和16.9%，而在加入EBR 后AsA 和GSH質量摩爾濃度進一步明顯提高，相比單純4 ℃低溫處理增加了28.9%和17.4%，與僅處于0 ℃脅迫處理相比提高了50.8%和47.4%。同時外源SNP 處理也顯著提高了AsA 和GSH 質量摩爾濃度。以上結果說明，EBR 和NO 可以增強低溫脅迫下細胞的抗氧化防御能力。

圖7 低溫脅迫下，EBR、SNP、PTIO 以及L-NAME 處理對高山離子芥懸浮細胞AsA（A）和GSH（B）質量摩爾濃度的影響Fig.7 Effects of EBR， SNP， PTIO and L-NAME on the molalities of AsA（A） and GSH（B） in the suspension cultured cells from C. bungeana under chilling stress

如圖6 所示，在4 ℃低溫脅迫下，EBR 中加入PTIO 后APX、CAT、GR、POD 和SOD 活性又明顯降低，與單獨EBR 處理對比分別減少了48.4%、43.8%、42.2%、36.9%和22.8%，同樣EBR+L-NAME與單獨EBR 處理相比上述抗氧化酶活性分別顯著降低了55.3%、42.6%、40.3%、45.3%和26.3%。在0 ℃，EBR+PTIO 以及EBR+L-NAME 對APX、CAT、GR、POD 和SOD 活性的影響與4 ℃類似。與此同時，4 ℃低溫下在EBR 中加入PTIO 或L-NAME 復合處理細胞的AsA 質量摩爾濃度與只加入EBR 處理相比明顯降低31.7%和31.0%，同樣GSH質量摩爾濃度也顯著減少了28.4%和23.3%。在0 ℃環境下，EBR+PTIO以及EBR+L-NAME對AsA和GSH質量摩爾濃度的影響與4 ℃類似?？梢奝TIO 及LNAME 在不同程度上阻礙了低溫脅迫下EBR 對抗氧化酶活性和抗氧化劑含量的誘導提高效應。此外，與僅受低溫脅迫的細胞相比，PTIO 及L-NAME單獨處理會導致細胞APX、CAT、GR、POD 和SOD活性以及AsA和GSH質量摩爾濃度明顯下降。

3 討論

3.1 EBR對離子芥懸浮細胞抗寒性的影響

在本研究中，低溫脅迫會明顯抑制懸浮細胞活力，外源EBR 處理可以使脅迫下細胞活力部分恢復。相對離子滲漏率是反映植物細胞膜受低溫逆境損傷的一個重要生理指標，MDA 是膜脂過氧化產物，其含量的多少可以反映膜脂過氧化程度。低溫脅迫會引起細胞膜損傷，胞內可溶性物質和電解質大量向膜外滲漏以及膜脂過氧化程度加劇，而EBR 處理可以緩解離子滲漏和膜脂過氧化程度的加劇。低溫脅迫導致植物體內ROS過量積累，EBR 處理可以抑制低溫脅迫下離子芥懸浮細胞H2O2含量、O·–2產生速率和OH-含量的升高，提高抗氧化酶APX、CAT、GR、POD 和SOD 的活性，促進抗氧化劑AsA 和GSH 的積累，增強細胞的抗氧化防御能力，從而緩解ROS 大量積累對細胞造成的氧化損傷，防止膜脂過氧化程度加劇，以維持低溫狀態下細胞膜系統結構和功能的穩定性，保證其生理代謝的正常進行，提高植物對低溫脅迫的抗逆能力。這與EBR 在葡萄（Vitis vinifera）［9］、辣椒（Capsicum annuum）［22-23］和垂穗披堿草（Elymus nutans）［24］中的研究結果一致?？寡趸烙到y的增強可能通過轉錄或翻譯特定基因來調節植物體內抗氧化酶及抗氧化劑代謝中關鍵酶的合成和活化［25］，從而增強植物對低溫脅迫的耐受力，以抵抗低溫對植物體造成的損傷。

3.2 NO 在離子芥懸浮細胞響應低溫脅迫時發揮的功能

本研究中SNP 處理可以緩解低溫造成的離子芥懸浮細胞活力降低，離子滲漏以及膜脂過氧化程度加劇。與僅受低溫處理的細胞相比，PTIO 或L-NAME單獨處理會明顯加劇細胞活力下降，離子滲漏和膜脂過氧化程度。在低溫脅迫下，懸浮細胞NO含量和NOS活性明顯升高，而NOS抑制劑LNAME 處理阻礙了低溫對NO 含量的誘導提高效應，說明低溫環境下NO積累來源于NOS催化。在逆境脅迫下，NO 可以作為一種抗氧化劑迅速清除ROS［3，13，16］，許多研究表明NO防衛和保護植物細胞免受脅迫損傷與NO 能夠有效清除ROS，調節植物體ROS含量減少有密切關系［15］。本研究發現低溫導致細胞H2O2含量、O·–2產生速率和OH–含量顯著上升，外源SNP 處理可以抑制低溫脅迫下ROS 大量積累。與僅受低溫脅迫的細胞相比，PTIO 及LNAME 處理導致H2O2含量、O·–2產生速率和OH–含量明顯升高，表明NO 作為一種抗氧化劑直接清除低溫脅迫下細胞內過量產生的ROS，從而緩解ROS 大量積累對細胞造成的氧化損傷。NO 還可以作為信號分子激活細胞的抗氧化防御系統［19，26-27］。本研究中，低溫脅迫下SNP 處理可以顯著提高細胞抗氧化酶APX、CAT、GR、POD 和SOD活性以及抗氧化劑AsA 和GSH 含量，從而增強細胞的抗氧化防御能力，這與牟雪姣等［4］在蝴蝶蘭（Phalaenopsisspp.）和黃志明等［28］在枇杷（Eriobotrya japonica）幼果中的研究結果一致。此外，與僅受低溫處理的細胞相比，PTIO 及L-NAME 處理導致APX、CAT、GR、POD 和SOD 活性以及AsA 和GSH含量顯著下降。在Xu等［3］和陳宇等［29］的研究中，采用NO清除劑或NOS抑制劑處理均抑制了低溫脅迫下枇杷幼果中CAT、POD、SOD 和APX 的活性?？梢?，在低溫環境下NO 作為信號分子激活細胞的抗氧化防御系統，從而抑制ROS過量積累，修復氧化損傷。綜上，NOS 催化產生的NO 參與離子芥懸浮細胞對低溫脅迫的響應過程，是重要的脅迫響應信號分子，它使細胞啟動一系列反應，防御和保護植物體免受脅迫損傷，從而增強植物的抗寒性。

3.3 低溫脅迫下EBR和NO的關系

大量研究表明，NO 可以作為信號分子參與調控植物激素信號轉導［12-14］。在擬南芥中，NO 可以與ABA通過對細胞骨架組織的調節作用促進根毛生長和異位根毛形成［30］。另外，Pagnussat 等［31］的研究表明吲哚乙酸誘導不定根發育的過程中，NO含量瞬時升高并作為信號分子參與調控這一生理反應。NO 處理可以延緩赤霉素、細胞分裂素誘導的細胞程序性凋亡，緩解赤霉素對SOD 和CAT 活性的抑制［32］。NO 參與乙烯誘導的蠶豆（Vicia faba）氣孔關閉［33］，還可作為對乙烯有抑制作用的因子延緩植物的成熟和衰老［12］。

諸多研究證實BRs 與NO 互作調節植物生長發育［34-35］，BRs 處理提高擬南芥根細胞中NO 濃度，在BRs 誘導根系結構變化中作為下游受體發揮功能［36］。施加外源BRs不僅提高野茶樹（Camellia sinensis）葉片中類黃酮濃度，還可以促進NO 積累，NO 作為BRs 的下游信號分子發揮作用并在其促進類黃酮合成中是必需的［37］。李雨桐等［38］的研究發現BRs誘導黃瓜（Cucumis sativus）幼苗不定根發生過程中NO 作為下游信號分子起正向調控作用。此外，BRs 增強植物對各種環境脅迫的抗逆性也與NO 信號途徑有關。在煙草（Nicotiana benthamiana）幼苗遭受鹽脅迫時BRs 能夠促進體內NO 積累從而抵御脅迫［39］。BRs 處理可以緩解水分脅迫造成的氧化損傷從而增強玉米（Zea mays）和辣椒植株的抗逆性，同時BRs 誘導生成的NO 參與調控此過程［40-41］。NOS和NR 活性被外源BRs調節并誘導NO 生成從而增強黃瓜對低溫和光氧化脅迫的抗性［42］。在重金屬鎘脅迫時，BRs 處理提高辣椒植株中NR活性和NO含量進而緩解脅迫造成的損傷［43］。綜上可知，BRs 和NO 在植物生長發育過程中相互影響，發揮重要的調控作用。

本研究中，外源EBR 處理可以緩解低溫脅迫下高山離子芥懸浮細胞活力的下降以及離子滲漏和膜脂過氧化程度的加劇，而用PTIO 抑制NO 積累或L-NAME 抑制NOS 活性則會阻抑EBR 對細胞的保護效應，同時外源EBR 處理可以明顯提高低溫脅迫下細胞內源NO含量并激活NOS活性，這表明NO 含量和NOS 活性的顯著提高對于EBR 誘導提高植物抗寒性是必需的。此外，NOS 抑制劑LNAME 會阻抑低溫下EBR 對NO 積累的促進效應，可見NOS 在NO 調控EBR 誘導提高植物抗寒性的生理過程中發揮重要作用，EBR 誘導的NO 積累來源于NOS 催化。低溫脅迫下，EBR 處理降低H2O2含量、O·–2產生速率和OH-含量的生理效應也被PTIO 及L-NAME 所阻抑。與此同時，PTIO 及LNAME 明顯抑制了EBR 對抗氧化酶APX、CAT、GR、POD 和SOD 活性的增強效應，以及抗氧化劑AsA 和GSH 含量的提高效應，從而導致細胞清除ROS的能力下降。上述結果表明EBR 通過激活離子芥懸浮細胞的NOS 活性來促進細胞內源NO 積累，在低溫脅迫下，EBR 處理可以抑制ROS過量積累并增強細胞的抗氧化防御能力，而這兩個過程均受NO 調控，從而緩解低溫造成的氧化損傷，提高細胞的抗寒性，這與馬金虎等［44］在玉米種胚中得到的結果是一致的?？傊?，低溫脅迫下NOS 來源的NO是EBR的下游信號分子。

植物通過激活多種防御反應來響應低溫脅迫，除了NO，ABA、Ca2+、ROS、茉莉酸（JA）等都可作為第二信使參與調控低溫信號的識別、轉導等。ABA 是植物響應低溫脅迫的重要信號分子，引起植物體內適應性調節反應和相關冷調控基因表達［1］。低溫激活了膜上的Ca2+通道，細胞內Ca2+水平在短時間內驟增，Ca2+與下游的鈣調素等鈣結合蛋白結合，激活一系列蛋白激酶，從而進一步通過誘導下游相關基因的表達調控植物體對低溫的各種生理代謝響應［45］。ROS 可以作為信號分子參與細胞響應低溫脅迫，并受Ca2+激活，通過細胞質中Ca2+濃度的變化傳遞冷信號［46］。張政委等［27］的研究指出，Ca2+參與低溫脅迫下NO 的調節過程，且ROS 可能作為信號分子參與且位于Ca2+的下游。此外，NO與JA在植物對低溫脅迫的響應中可能存在信號交叉［29］。BRs 可能是通過Ca2+、鈣信使系統以及促進ABA合成來調節植物抗冷力的形成［6，47］，因此可以推測其他信號分子可能參與低溫環境下BRs 信號傳遞，NO 與其他信號分子在BRs 傳導網絡中存在復雜的交叉調控。

4 結論

綜上所述，在低溫逆境脅迫下，EBR 處理可以激活高山離子芥懸浮細胞的NOS 活性，導致細胞內源NO 水平顯著升高，積累的NO 可以作為抗氧化劑直接清除低溫脅迫下過量產生的ROS，同時，NO 還可以作為信號分子上調細胞的抗氧化防御能力，增強的抗氧化防御系統抑制ROS 含量的升高，緩解ROS大量積累對細胞造成的氧化損傷，防止膜脂過氧化程度加劇，從而穩定細胞膜的結構和功能，增強抗寒能力?？傊?，低溫脅迫下，由NOS 催化產生的NO 在BRs 抑制ROS 積累以及激活抗氧化防御的響應中發揮重要的下游信號分子功能，從而提高植物的抗寒性。低溫下BRs 和其他信號分子之間的相互作用及其傳遞網絡還需進一步研究。