TRV介導的溪蓀VIGS轉化體系的構建與鑒定

劉桂伶 徐 諾 史恭發 王 玲

（東北林業大學園林學院，哈爾濱 150040）

溪蓀（Iris sanguinea）為鳶尾科（Iridaceae）鳶尾屬（Iris）多年生草本植物，由于其極強的抗寒能力和較高的觀賞價值成為了東北地區的重要園林綠化植物［1］。目前對于溪蓀的研究主要集中于種子生物學［2］、開花生物學［3］和新品種選育［4］等方面。鳶尾科僅唐菖蒲（Gladiolus gandavensis）［5］等少數植物建立了完整的遺傳轉化體系，在溪蓀遺傳轉化體系研究中，僅唐彪［6］以花莖誘導出來的愈傷為受體，進行GUS 基因的轉化，但并未獲得不定芽。目前，溪蓀的基因功能驗證只能通過模式植物進行，溪蓀等鳶尾屬植物基因功能研究進展緩慢。病毒誘導基因沉默技術（Virus-induced gene silencing，VIGS）適用于缺乏穩定遺傳轉化體系的物種進行基因功能分析，其操作簡單，無需遺傳轉化和組織培養，試驗周期較短，加速了基因功能分析的進程，是反向遺傳學研究基因功能的重要手段［7］。已在非洲菊（Gerbera jamesonii）［8］、矮牽牛（Petunia hybrida）［9］、唐菖蒲（Gladiolus hybridus）［10］等多個觀賞花卉的基因功能研究中成功使用。

八氫番茄紅素脫氫酶基因（Phytoene desaturease，PDS）的功能喪失會導致植物出現光漂白現象，常作為VIGS 體系構建的指示基因［11］。PDS蛋白的C末端均含有1個FAD保守結構域，作為植物類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵酶，其失活會導致類胡蘿卜素合成遭到破壞，導致本應呈綠色的葉片組織變成白色。這個明顯的表型變化極易觀察，效果明顯且產生表型所需時間較短。PDS基因在小麥（Triticum aestivum）［12］、水稻（Oryza sativa）［13］、大麥（Hordeum vulgare）［14］、番茄（Solanum lycopersicum）［15］等多個植物的VIGS 體系構建中被應用。Burch-Smith 等［16］在擬南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗上建立PDS與AtCUL1基因可視化VIGS 體系的基礎上，進行了植物抗病研究。這些研究中，PDS基因被用作為報告基因與其他基因結合作為基因功能研究和遺傳改良的手段。

本研究以煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）為病毒載體，以IsPDS為報告基因，建立溪蓀葉部的VIGS 體系，不僅對解析溪蓀乃至鳶尾屬植物基因功能具有重要意義，也對其他遺傳轉化體系構建困難的單子葉植物VIGS 體系構建提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

VIGS試驗用苗為東北林業大學園林學院苗圃（126°64′N，45°72′E）露地栽培的5年生溪蓀實生苗；2021年6月采集溪蓀干凈葉片，立即置于液氮冷凍后在超低溫冰箱中-80 ℃保存，用于RNA的提取。

1.1.2 病毒載體和菌株

TRV 病毒載體pTRV1 和pTRV2 由山東農業大學徐宗大教授惠贈，所選用大腸桿菌感受態為DH5α（全式金，CD201-02），農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）感受態為GV3101（上海唯地，AC1001）。

1.2 方法

1.2.1 IsPDS基因片段的擴增

按RNA提取試劑盒（康為世紀，CW0535）的操作說明提取溪蓀葉片的總RNA，以1 μg 的總RNA做模板，進行反轉錄（TaKaRa，D2680A）后稀釋備用；從課題組前期溪蓀花瓣轉錄組中篩選出PDS基因（GenBank：OR295217），在其ORF 區域內根據SGN（http：//vigs.solgenomics.net/）網站選取長度299 bp 的特異性片段［17］，基因片段克隆引物（F：5′-ATGAAACAACAGGGTGTGCCTGA-3′，R：5′-GCGAGTAAAAGGTGCTTCACTGTTC-3′），并在正向和反向引物的5′端分別添加pTRV2載體的同源臂堿 基 序 列（F：TGAGTAAGGTTACCGAATTCTCTAGAATGAA-ACAACAGGGTGTGCCTGA， R：GCCTCGAGACGCGTGAGCTCGGTACCGCGAGTAAAAGGTGCTTCA-CTGTTC，下劃線為引物序列的同源臂），使用KOD-Plus-Neo（東洋紡，KOD-401）進行PCR 反應，反應體系參考說明書，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，將正確的條帶切下后進行膠回收。

1.2.2 重組病毒載體pTRV-IsPDS構建

純化后的PCR 基因片段，與經XbaⅠ-KpnⅠ雙酶切線性化的pTRV2 質粒用同源重組試劑盒（諾唯贊，C115-01）連接。將上述連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，鑒定陽性克隆并測序。

1.2.3 VIGS沉默體系的建立

分別將含有pTRV1、pTRV2 和pTRV2-IsPDS的質粒用凍融法轉化農桿菌GV3101，在50 mg·L-1卡那霉素和25 mg·L-1利福平抗性條件下篩選轉化子，挑取單菌落至含以上兩種抗生素的1 mL YEB培養液中，28 ℃，200 r·min-1培養12 h，取1 mL 上述菌液，加入25 mL YEB 液體培養基（50 mg·L-1卡那霉素，25 mg·L-1利福平）中，28 ℃， 200 r·min-1培養10～12 h，當菌液的OD600為1.8～2.0 時，用含有10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES、200 μmol·L-1AS的200 mL重懸液重懸菌體，重懸液OD600為0.8～1.0。

使用1 mL 注射器，分別將下列每組菌液中成分按1∶1體積比混合后，25 ℃避光靜置活化3 h：將含有pTRV1 與pTRV2 的農桿菌GV3101 菌液作為病毒空載對照組，含有pTRV1 與pTRV2-IsPDS的農桿菌GV3101菌液作為試驗組，試驗組和病毒空載對照組選擇同一溪蓀植株上長勢相近的葉片進行。另外，每組試驗均設置空白對照Mock 組，將等體積無菌水注射溪蓀葉片中，并觀察葉片注射后是否出現壞死的現象。

試驗在大田環境中進行，氣溫15～20 °C，選擇晴朗天氣的下午6～8時進行，用1 mL注射器針頭扎傷生長一致的溪蓀葉片上表皮，沿著平行脈緩慢注射重懸液1 mL至溪蓀葉片維管束中（見圖1）。

圖1 溪蓀VIGS侵染技術示意圖Fig.1 Schematic diagram of VIGS infection technology of I. sanguinea

1.2.4 基因表達量分析

從pTRV2-IsPDS侵染的溪蓀葉片白化部分、注射pTRV2 侵染的溪蓀葉片的相應部分提取總RNA 并進行反轉錄，以Actin為內參基因（F：CGGTATGGAGGCTGCTGGTA，R：TCAACGTGCAATCACAATCTC），采用qRT-PCR 對IsPDS基因的相對表達情況進行定量分析，所用定量引物（F：GAAATCCACCTGAGAGGCTATG，R：TGTTCCATCAGAGTTCAGCTC）。 按 照FastStart Universal SYBR Green Master Mix Kit 說明在LightCycler 96 well Real-Time PCR System 上進行檢測。反應體系 20 μL。反應程序為95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，31 s，30 個循環，參考2-ΔΔCt法對目的基因的相對定量表達進行分析［18］。

1.2.5 數據處理

通過統計出現明顯光漂白現象的葉片的植株數，計算溪蓀VIGS的沉默率：

植株沉默率=（白化株數/轉化總株數）×100%。

2 結果與分析

2.1 IsPDS基因片段的克隆結果

IsPDS基因在299 片段擴增出目標條帶（見圖2A），經測序，序列與轉錄組測序結果一致，在GenBank 數據庫中進行Blast 分析表明，該片段與已知基因番紅花（Crocus ancyrensis）的PDS基因（GenBank：KT124380.1）同源性為92.1%，表明已經成功克隆出溪蓀PDS基因的特異性片段。

圖2 PDS基因片段的PCR擴增結果A.IsPDS 特異性片段PCR 擴增（M.DNA 標準分子量；1.IsPDS 基因片段）；B.TRV2-IsPDS 重組質粒PCR 鑒定（M.DNA 標準分子量；1.pTRV2-IsPDS重組質粒）。Fig.2 PCR amplification results of IsPDS A.Amplification of IsPDS fragmen（tM.DNA Marker；1.Fragment of IsPDS）；B.Identification of vial vector TRV2-IsPDS by PCR（M.DNA Marker；1.Fragment of pTRV2-IsPDS）.

2.2 IsPDS基因VIGS重組載體的構建

構建獲得溪蓀重組病毒載體pTRV2-IsPDS（見圖2B），通過PCR 鑒定和測序驗證，說明pTRV2-IsPDS基因沉默載體構建成功。

2.3 表型鑒定及IsPDS基因表達情況

自接種第1 日起，14 d 之后，觀察葉片白化情況，其中注射無菌水的空白對照組的葉片未產生任何白化表型，且未出現葉片破損腐爛等現象。病毒空載體處理的樣本中無明顯的葉片顏色變化，與空白對照組及病毒空載體組相比，在病毒與目的基因復合載體處理的試驗組樣本中，產生了葉片白化表型（見圖3A）。侵染20 d后葉片的其他位置也出現了白化現象。對溪蓀葉片進行PCR檢測發現，TRV病毒已經成功在溪蓀葉片中表達（見圖3B）。

圖3 植株表型變化及IsPDS基因在葉片中qRT-PCR表達分析A.溪蓀PDS 基因沉默后的葉片白化表型（M.注射無菌水的葉片；TRV2-GFP.病毒空載對照葉片；1～3.試驗組出現沉默表型葉片）；B.溪蓀葉片TRV2基因PCR結果（M.DNA標準分子量；1，M.注射無菌水植株；2.TRV2-GFP病毒空載對照組；3～5.試驗組出現沉默表型的葉片）；C.空白對照組、病毒空載組及試驗組的IsPDS基因表達量分析。Fig.3 Phenotypic change of plant and qRT-PCR analysis of IsPDS in leaves A.Phenotypes of albino leaves after PDS gene silencing in I.sanguinea（M.Leaves injected with sterile water；TRV2-GFP；1-3.Phenotype of PDS gene silenced）；B.PCR detection results of TRV2 gene（M.DNA Marker；1，M.Leaves injected with sterile water；2.TRV2-GFP，3-5.IsPDS gene silenced）；C.Analysis of PDS gene expression in photobleached plants.

通過統計具有光漂白現象的植株數計算VIGS的沉默效率為56%，收集沉默植株的葉片，利用qRT-PCR 分析IsPDS基因的表達量，結果顯示，相比于陰性對照植株和空白植株，3組試驗組溪蓀中IsPDS基因的表達量平均降低了50.39%（見圖3C），而注射無菌水的Mock組與注射TRV2病毒空載組之間無顯著差異。說明沉默體系能夠對目標基因進行沉默。

3 討論

VIGS 技術為遺傳轉化困難和生長周期較長的植物提供了基因功能分析的簡便方法［19］，基于TRV 的VIGS 病毒載體是目前使用最廣泛的載體，其接種后植株沉默效率高，沉默表型持續性較好［20］，但由于寄主范圍的限制，對TRV 以單子葉植物為研究對象而建立VIGS 體系卻鮮有報道［21］。鳶尾屬植物的遺傳轉化體系的構建困難，溪蓀的VIGS 體系的成功構建可加快鳶尾屬植物基因功能研究的速度。

PDS基因可視化效果明顯，提高了VIGS 試驗的時效性，VIGS 技術處理的植株由于病毒侵染效率的差異會出現沉默效率不一致、時期不統一等現象，導致VIGS 試驗失敗的原因較多，無法判斷問題出現在VIGS 體系上，還是對應沉默基因的功能上。而利用PDS基因為指示基因，將沉默結果肉眼可見，為后續試驗材料的收集以及數據的分析帶來極大的便利。如沉默小麥品種的穗部PDS沉默后，接種病毒14 d 后開始出現葉片的白化現象，且基因表達量下調超過60%，沉默性狀穩定［22］。PDS基因在大豆（Glycine max）中沉默后，葉片出現了高度均勻的光漂白表型，沉默后的植株的整個生命周期都性狀穩定，并且基因沉默性狀遺傳到了其20%的種子中，這些種子的幼苗都出現了白化的表型［23］。由于PDS基因序列的保守性，異源PDS基因片段也用于實現目的植物物種中PDS基因的瞬時沉默表達［24-25］，可見，PDS基因在多種植物VIGS體系構建中的重要性。

在溪蓀VIGS 體系構建中，存在基因沉默脫靶導致試驗失敗的風險，VIGS 試驗的成功需要確保靶基因的高度特異性，這樣才能確保較高的沉默效率。只有選擇了沉默基因的特異性片段才能成功獲得沉默表型，現在已開發出許多軟件（如SGN、pssRNAit、DEQOR 等）來輔助進行預測VIGS沉默效率，以期取得更好的沉默表型［17，26-27］。本研究利用了SGN 網站選擇了299 bp 的特異性片段，取得了較好的沉默效果。

針對不同植物種類的特點，目前已開發了多種VIGS 試驗中的農桿菌侵染方法。除常見的真空滲透、注射器侵染等，還有用牙簽挑出農桿菌并刺傷植株幼苗葉片，以及農桿菌直接噴灑植物幼苗等方法，都獲得了良好的沉默效果［28-29］，已有的接種方式，如真空滲透和灌根法更適用于幼苗及室溫環境下的植物材料，并不適用于大田條件下的溪蓀。小麥的大田苗VIGS 采用穗部摩擦接種法進行，但是出現了病毒接種濃度不均勻等問題，造成沉默效果大打折扣［22］。本研究針對于露地栽培溪蓀采用葉片注射方法：1 mL 注射器針頭扎傷溪蓀葉片，沿著平行脈緩慢注射1 mL 重懸液至溪蓀葉片上表皮維管束中。讓菌液在溪蓀的葉片中充分存留并發揮功效，此方法菌液注射的位置白化現象較為明顯。

玫瑰（Rosa rugosa）［30］、矮牽牛［31］等多數植物在VIGS 處理后，為了緩解病毒侵染對植物材料的傷害都需要進行一定時間的人工遮光處理［32］。本研究從大田條件下的溪蓀生長情況出發，將具體的接種時間安排為下午的6～8 點，此時環境溫度相對較低，菌液不會快速蒸發，較為適合VIGS 接種，且接種以后無需人為制造遮光條件，使得操作方法更加簡捷，省時省力，值得大田植物VIGS 體系構建來參考借鑒。

溪蓀VIGS 體系中病毒侵染液的配制方法與現有的其他植物方法操作相似［30］，但是考慮到本試驗在大田環境中操作，相比于實驗室環境較為特殊，影響其溫度、濕度和光照強度等因素較多，且本試驗種所用的溪蓀為多年生的成熟植株，其本身具備較強的抗侵染能力和較強的抗性，為了提高農桿菌的侵染能力和效率及病毒的存活基數，本試驗采用了侵染液現用現配的方式，提高攜帶病毒載體的農桿菌的濃度至OD600為1.8～2.0。保證了在自然條件下，溪蓀葉片接種區域內攜帶病毒載體的農桿菌具有足夠的存活基數，使整個試驗的侵染效率得到提高。而侵染矮牽牛［31］、非洲菊［8］等植物的農桿菌濃度僅為OD6001.0～1.2，這與試驗環境條件和試驗用苗的生長狀態有關。

在環境因素中，溫度是影響煙草花葉病毒有效傳播的最重要因素。在多種觀賞植物研究中發現，VIGS 病毒感染的最適溫度為15～20 ℃［33］。在溫度22 ℃下，侵染高粱（Sorghum bicolor）葉片后發現僅有10%的植株產生了針對高粱PDS基因沉默的白化現象［34］。后人又對高粱VIGS 的試驗體系進行了環境溫度的優化，發現將沉默后的高粱植株轉移到18 ℃溫室后，1 個月后出現了100%的光漂白現象，證明了低溫更有利于VIGS 病毒的侵染［35］。同樣的，在對番茄VIGS 體系進行改進時，研究人員發現環境溫度15 ℃為最佳，此時番茄葉片、果實和花朵90%以上的沉默表型［36］，本研究選擇在哈爾濱的室外溫度為15～20 ℃的5月底進行，溫度條件滿足VIGS 所需的最適溫度，故試驗結果較為理想。

4 結論

綜上所述，對于單子葉植物溪蓀的VIGS 操作方法為：選擇IsPDS的特異性片段，構建pTRV2-IsPDS載體后轉化農桿菌，pTRV1 和pTRV2-IsPDS的菌液OD600調至1.8～2.0 后重懸，重懸液OD600調至0.8～1.0，在室外溫度為15～20 ℃的下午6～8時進行，用1 mL 注射器針頭扎傷溪蓀葉片外表皮，沿著平行脈緩慢注射重懸液1 mL 至溪蓀葉片維管束中，平均14 d 后溪蓀葉片會出現明顯的白化表型。本研究以溪蓀為材料建立了VIGS 體系，克服了由于無遺傳轉化體系而導致的無法驗證溪蓀等鳶尾屬植物利用本源開展基因功能研究的瓶頸。