HPLC 法同時測定R-四氫罌粟堿中的8 種有關物質

杜文哲，徐嘉健，張福利，楊文亮，林麗婭

（1.上海工程技術大學 化學化工學院，上海 201620；2.上海醫藥工業研究院有限公司，上海 201203；3.杭州博崤生物制藥有限公司，浙江 杭州 311404 ）

苯磺順阿曲庫銨是一種高效的肌肉松弛劑[1]，該藥物的合成是以R-四氫罌粟堿（5）作為原料，因此，5 的質量控制是該藥物質量保證的關鍵[2]。本課題組前期開發了一鍋法合成四氫罌粟堿鹽酸鹽，再通過拆分合成5 的工藝[3]，合成路線及路線中涉及雜質如圖1 所示。

圖1 5 的合成工藝路線及相關雜質結構

四氫罌粟堿的相關研究多集中于合成工藝優化[4-5]，文獻中并未對相關雜質進行研究?，F有對于異喹啉類化合物檢測的文獻中，多是對其含量檢測[6-8]。關于異喹啉類的檢測，劉學起等[9]用HPLC 對鹽酸罌粟堿的含量進行檢測，缺少對于有關物質的同時檢測的方法；王瑤等[10]用HPLC-MS聯用技術對鹽酸罌粟堿注射劑的含量以及一個有關物質進行檢測，對于雜質研究不夠深入。目前對于異喹啉類化合物及其雜質同時定量的分析方法未見報道。

參考以上方法，本文使用常規的HPLC 對優化后5 的合成工藝中的8 個有關物質進行分析方法開發與驗證工作，以期為苯磺酸順阿曲庫銨的工業化生產提供參考。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

試劑：1（安徽德信佳生物醫藥有限公司，批號：GLA-220502，含量98.01%）；2（安徽德信佳生物醫藥有限公司，批號：GLS-210801，含量99.88%）；3（自制經標化，批號：210922-2-1，含量99.71%）；4（自制經標化，批號：220613-1-1，含量 97.68%）；6（自制經標化，批號：210909-1-1，含量98.79%）；7（自制經標化，批號：220223-1-2，含量98.11%）；8（自制經標化，批號：220927-2-2，含量99.01%）；9（自制經標化，批號：220315-2-2，含量99.70%）；5 對照品（自制經標化，批號：220914-1-1，含量：99.73%）；5 樣品（自制待檢測，批號：210603-1-1-6、210609-1-1-4、210609-1-2-4）。各化合物合成均依據文獻記載[3]。

試劑：甲酸銨，AR，Adamas-beta；甲醇，色譜純，Adamas-beta；乙腈，色譜純，Adamasbeta；無水甲酸，分析純，麥克林；蒸餾水，娃哈哈公司。

儀器：高效液相色譜儀，U3000 型，美國Thermo Fisher Scientific 公司；分析天平，XPR205型，瑞士METTLER TOLEDO 公司；Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。

1.2 色譜條件

Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以10.0 g/L的甲酸銨-乙腈（100∶5）為流動相A，甲醇為流動相B，柱溫37℃，檢測波長280 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量10 μL，梯度洗脫（0.0-40.0 min，A 90%-43%；40.0-50.0 min，A 43% ；50.0-50.1 min，A 43%-90% ；50.1-60.0min，A 90%）。

1.3 溶液配制

稀釋劑（33.3 g/L 甲酸銨∶甲醇∶乙腈=6∶2∶2）：稱取19.7 g 甲酸銨，加水590 mL，加入10 mL 無水甲酸后，加入甲醇、乙腈各200 mL，搖勻即得。

供試品溶液（1 mg/mL）：精密稱取5 樣品（批號：210603-1-1-6）5 mg，置于5 mL 容量瓶中，用稀釋劑定容至刻度，搖勻即得。

對照品溶液（1 mg/mL）：精密稱取5 對照品5 mg，置于5 mL 量瓶中，使用稀釋劑定容，作為5 的對照品溶液；精密稱取1、2、3、4、6、7、8、9 對照品各5 mg，分別置于5 mL 量瓶中，1、2、3、4、7、8、9 使用稀釋劑定容；6 使用1 mL二氯甲烷溶解后，使用乙腈定容，作為各雜質對照品溶液。

雜質混合對照品儲備液（20 μg/mL）：分別移取1、2、3、4、6、7、8、9 對照品溶液各500 μL置于25 mL量瓶中，使用稀釋劑定容至刻度，搖勻即得。

系統適用性溶液：稱取5 對照品20 mg，置于20 mL 量瓶中，加入雜質混合對照品儲備液1mL后，用稀釋劑定容至刻度，搖勻即得。

對照溶液（0.1%自身對照溶液）：取供試品溶液100 μL 置于100 mL 量瓶，加入稀釋劑定容至刻度，搖勻即得。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

采用DAD 對5 和6 進行全波長掃描，結果如圖2 所示。圖譜顯示，5 的最大吸收波長為192 nm、231 nm、281 nm；6 的最大吸收波長為194 nm、230 nm、281 nm、320 nm，1、2、3、4、7、8、9的最大吸收波長與6相似，考慮到低波段容易對檢測造成干擾；在231 nm 處，有空白峰干擾檢測；綜合上述并結合各國藥典中對苯磺順阿曲庫銨檢測時的波長選擇，最終選擇280 nm 作為5 有關物質的檢測波長。

圖2 5、6 的紫外吸收光譜

2.1.2 色譜柱的篩選

從待測物的結構式可知，除化合物2 含有羧基外，每個化合物均含有氨基，極性相對較強，各化合物結構近似，極性接近。對于填料進行篩選，C18填料的色譜柱相較于C8具有更好的保留，并查閱各國藥典中對鹽酸罌粟堿以及苯磺順阿曲庫銨的有關物質方法中均使用C18填料色譜柱，因此選擇使用C18填料色譜柱。

對各國藥典中記載的苯磺順阿曲庫銨有關物質檢測所使用色譜柱及色譜方法進行嘗試，分別使用了Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm，中國藥典）、YMC-UltraHT Hydrosphere C18（3.0×100 mm，2 μm，歐洲藥典）以及Kromasil 100-5-C18（4.6×250 mm，5 μm，美國藥典）三種色譜柱，重現結果見圖3。

圖3 系統適用性溶液典型色譜圖：a.中國藥典重現結果；b.歐洲藥典重現結果；c.最終確定方法結果

圖3a 為Eclipse Plus C18色譜柱重現結果，圖譜顯示峰形相對較差，且分離度不佳；圖3b 為YMC-UltraHT Hydrosphere C18色譜柱重現結果，圖譜顯示各化合物的保留較弱，從而導致分離度不合格；Kromasil 100-5-C18色譜柱峰形良好，但分離度不夠理想。因此，以此為基礎對色譜條件進行優化，并確定了最終色譜條件，如圖3c 所示，各化合物分離度均大于1.5，因此，選擇該色譜柱來測定5 中的有關物質。

2.2 線性等參數考察

2.2.1 線性與范圍

移取“1.3”項下的各對照品溶液，加稀釋劑分別配置為0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、10.0 μg/mL的線性溶液，按照“1.2”項下色譜條件檢測。以峰面積為縱坐標，線性溶液的質量濃度為橫坐標，繪制各化合物的標準曲線，結果見表1。

表1 各化合物線性回歸方程

2.2.2 重復性檢驗

按照“1.3”項下配置系統適用性溶液，平行配置6 份，按照“1.2”項下色譜條件檢測，計算單雜和總雜含量，并計算其RSD 值。結果顯示，1、2、3、4、6、7、8、9 的RSD 分別為3.7%、0.0%、3.1%、3.7%、4.5%、4.7%、4.1%、3.4%，總雜含量RSD 為3.9%，表明方法重復性良好。

2.2.3 中間精密度檢驗

由兩名分析人員在不同日期檢測5，分別平行配置6份系統適用性溶液以及0.1%自身對照溶液，重新配置稀釋劑和流動相并且使用不同儀器，按照“1.2”項下色譜條件檢測，計算2 個分析人員制備的12 份樣品的RSD 值。結果顯示，6 份樣品的RSD 均小于10%，且12 份樣品中，1、2、3、4、6、7、8、9 含量的RSD 值分別為4.7%、4.3%、4.6%、6.4%、6.4%、4.1%、5.1%、5.6%，總雜質含量的RSD 為5.0%，表明方法的中間精密度能達到要求。

2.2.4 檢測限與定量限

將各雜質的對照品溶液用稀釋劑逐步稀釋成一定濃度的溶液，在“1.2”項下色譜條件檢測，記錄色譜圖。信噪比（S/N）為3～10時測得的量為其檢測限，S/N≥10 時測得的量為其定量限。結果顯示，1、2、3、4、5、7、8、9 檢測限為0.20 μg/mL，6 檢測限為0.10 μg/mL；1、2、3、4、5、7、8、9 定量限為0.50 μg/mL，6 定量限為0.25 μg/mL。定量限連續進樣6 次，1、2、3、4、5、6、7、8、9 的RSD 分別為2.5%、1.1%、2.9%、2.8%、1.2%、3.5%、3.2%、1.6%、1.9%。

2.2.5 準確度試驗

分別精密稱取5 對照品20 mg 置于20 mL 量瓶，共11 份。前兩份直接用稀釋劑定容，其余9份，分別加入“1.3”項下雜質混合對照品儲備液250 μL、500 μL、750 μL，使用稀釋劑定容，配置為50%（0.5 μg/mL）、100%（1.0 μg/mL）、150%（1.5 μg/mL）雜質限度的加標溶液，每個濃度平行配置三份。該11 份溶液分別配置0.1%自身對照，即取100 μL 置于100 mL 容量瓶中，用稀釋劑定容至刻度制得。按照“1.2”項下色譜條件檢測，以0.1%自身對照法計算平均回收率。結果顯示，1、2、3、4、6、7、8、9 的平均回收率分別為 93.0%、99.2%、104.9%、102.0%、96.3%、101.8%、102.5%、98.6%；RSD 分別為 3.4%、3.2%、3.5%、3.0%、2.6%、3.9%、3.1%、3.8%。

2.2.6 耐用性試驗

取“1.3”項下系統適用性溶液及其0.1%自身對照溶液，按照“1.2”項下色譜條件檢測，分別考察了柱溫（37±2）℃、流速（1.0±0.1）mL/min、流動相A 起始比例（10±2）%、檢測波長（280±2）nm對于分離效果的影響。結果顯示，不同耐用性色譜條件下，各雜質與5 分離度均大于1.5，單個雜質的絕對差值≤0.02%，總雜質絕對差值≤0.1%，說明方法耐用性良好。

2.2.7 溶液穩定性

取“1.3”項下系統適用性溶液及0.1%自身對照溶液，按“1.2”項下色譜條件檢測；并將加標樣品溶液分別置于室溫、低溫（10℃）環境下，定時檢測。結果顯示，在室溫條件下，27 h 穩定；低溫（10℃）條件下25 h 穩定，所有雜質含量變化均在0.01%范圍內，總雜質絕對差值為0。

2.3 樣品檢測

取三批5 樣品，按照上述溶液配制條件及色譜條件進樣分析，結果見表2。

表2 5 的檢測結果/%

其中，1、2、3、4、7、8 未檢出，由檢測結果可知，使用文獻[3]中的合成工藝路線所得到的5純度較高，可以作為對照品使用。

3 結論

本文以R-四氫罌粟堿為研究對象，建立了HPLC 法同時測定8 個有關物質，且通過方法學驗證證明該法準確、有效，適用于R-四氫罌粟堿中的有關物質測定，為苯磺順阿曲庫銨的質量研究提供參考。