凍融囊胚移植中囊胚形態學評分對妊娠結局和新生兒出生結局的影響

徐思蕾,陳 潼,張小建,孫明菡

(1.電子科技大學醫學院,四川 成都 610054; 2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院婦產科生殖中心,四川 成都 610072)

輔助生殖技術發展四十年來,隨著囊胚培養技術和玻璃化冷凍體系的不斷成熟和完善,試管嬰兒的妊娠率已顯著提高[1,2]。為降低多胎妊娠率、提高胚胎著床率[3],實驗室囊胚培養技術在臨床日益重視。胚胎基因組激活階段是從受精后第3天卵裂期胚胎開始到囊胚形成,要真實評估胚胎發育潛能必須實現胚胎基因組從母體型到胚胎型的轉變[4],發育潛能較差的胚胎在胚胎基因組激活階段被淘汰[5]。因此普遍認為與卵裂期胚胎相比,能形成囊胚的胚胎具有更好的種植潛能,囊胚移植具有較高的著床率和活產率[6]。如何選擇發育潛能更高的囊胚移植是輔助生殖技術中最主要的挑戰之一。Gardner形態學評價體系是現階段臨床上用于優質囊胚篩選的主要方法[7,8],這一評價體系的形態學參數包括囊胚擴張和孵化階段的形態、內細胞團(inner cell mass,ICM)及滋養層細胞(trophectoderm,TE)等級。越來越多的證據表明,冷凍和新鮮胚胎移植后的活產率(live-birth rate,LBR)可通過胚胎在體外達到囊胚階段的能力來預估[9]。也有研究者對囊胚形態學等級評分在預測胚胎發育潛能中的作用價值提出質疑。有研究報道ICM和TE等級評分可作為臨床上評價妊娠率和活產率的一個重要指標,對于優質囊胚而言,囊胚的TE評分越高則流產率越低[10]。猜測原因可能與胚胎滋養層細胞的功能有關,胚胎著床與著床后分化發育成胎盤部分的滋養層細胞存在密切聯系[11]。但亦有學者提出囊胚擴張和孵化階段形態、ICM等級及TE等級與早期妊娠結局和新生兒出生結局無顯著相關性的觀點[12]。有研究發現,雙囊胚凍融移植D5,D6,D7臨床妊娠率依次降低,胚胎著床率依次減少,差異均具有統計學意義[13,14]。Hiraoka等研究發現,第6、7天優囊胚凍融移植周期活產兒的性別比例、早產率、出生體重無顯著性差異[15]。本研究分析我院生殖中心凍融囊胚移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)患者的臨床資料,探討FET周期中不同分級的囊胚對妊娠結局和新生兒出生結局的影響,為胚胎實驗室篩選發育潛能最佳的囊胚提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年5月至2021年12月在四川省人民醫院生殖中心行FET的不孕患者,總計2576個周期。納入標準:①年齡在38歲以下(包含38歲);②均行FET;③采用GnRH拮抗劑方案或GnRH激動劑降調節方案控制促排卵周期;④隨訪數據完整。排除標準:①嚴重子宮畸形明確診斷;②子宮內膜異位癥、子宮腺肌癥;③子宮內膜回聲不均、宮腔積液、宮腔形態異?；蛭词中g治療的子宮內膜息肉等影響子宮內膜容受性疾病;④采用自然周期、微刺激、黃體期促排等刺激方案控制超促排卵周期;⑤供卵、供精試管周期;⑥卵子冷凍解凍周期。本研究采用的移植囊胚均處于擴張分期的3～6期。以ICM及TE的致密程度和細胞數為標準對囊胚進行分期和分級并以此劃分組別,其中A組(移植≥4AA級囊胚)108周期,B組(移植4-6AB,4-6BA囊胚)370個周期,C組(移植4-6BB,4-6CA囊胚)1170個周期,D組(移植4-6BC,4-6CB,4-6CC囊胚)928個周期。本研究經四川省人民醫院倫理委員會審查批準通過。

1.2 方法

1.2.1控制性促排卵方案及體外受精 控制性促排方案包括GnRH激動劑降調節方案和GnRH拮抗劑方案,以竇卵泡直徑及卵巢激素水平為參考標準給予150～300 IU/d范圍內的促性腺激素(gonadotropin,Gn),主導卵泡平均直徑達18 mm時給予人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)。至少2個優勢卵泡直徑達18 mm或至少3個優勢卵泡直徑達17 mm以上時采用重組絨促性素(艾澤,默克雪蘭諾公司,國藥準字SJ20130091)250 μg或5000～10000 IU hCG(珠海麗珠醫藥公司,國藥準字H44020642)扳機,36～38 h后行取卵術。將所有獲得的卵母細胞置于37 ℃、5% O2、5% CO2的培養箱中培養。決定行IVF或ICSI中的何種受精方式需視取卵日男方精液情況而定。脫除顆粒細胞在授精后4.5 h進行并觀察卵母細胞成熟度和雙極(2PB)情況,若卵母細胞2PB數/MⅡ卵數在30%以下(包含30%)則進行補救ICSI (RICSI)。在受精后16～18 h觀察胚胎受精情況。

1.2.2囊胚胚胎培養和評級 對處于卵裂期的胚胎培養48 h后進行觀察,對第5～7天形成的囊胚采用Gardner囊胚評分標準進行分級和評估。按照囊胚腔的擴張程度可分6期:1期:早期囊胚,囊胚腔體積未達到囊胚總體積的1/2;2期:囊胚腔體積大于或等于囊胚總體積的1/2;3期:完全擴張囊胚,囊胚腔完全占據整個囊胚;4期:擴張后的囊胚,囊胚體積比早期囊胚大,透明帶變薄;5期:孵出的囊胚,滋養外胚層開始從透明帶裂口孵出;6期:完全孵出的囊胚,囊胚從透明帶中完全逸出。按照ICM和TE的細胞數量及形態可分3個等級:A級:ICM細胞多而緊密;TE細胞多且大小均勻適中,致密排列于囊胚周圍;B級:ICM細胞相對少,結合較松散,部分有整體性;TE細胞數少,松散排列在囊胚周圍;C級:ICM細胞極少或近乎無細胞,并且大小不均勻,結構缺乏整體性;TE細胞極少或僅只有幾個大小不均一且排列稀疏的細胞。囊胚的擴張程度在3期以上,囊胚評分在3BC/CB以上可行冷凍或移植。

1.2.3冷凍囊胚移植 采用激素替代周期方案、降調節人工周期方案及自然周期方案行子宮內膜準備。當超聲提示內膜厚度8～14 mm時加孕激素轉化內膜5天后行囊胚移植。移植當天解凍囊胚,采用商品化的囊胚解凍復蘇液體,按照試劑盒說明進行囊胚解凍,解凍具體方法參照玻璃化解凍試劑盒(Kitatato日本)說明書進行。復蘇后解凍的囊胚常規進行激光輔助孵化,然后將囊胚轉移至37℃、5% O2、5% CO2的培養箱內進行2 h的培養,借助倒置顯微鏡觀察囊胚的擴張情況并以此為依據進行分級評分。

1.3 觀察指標主要包括著床率、臨床妊娠率、流產率、早產率、活產率、雙胎率、多胎妊娠率、異位妊娠率等。在完成囊胚移植的12天后測量血HCG,臨床妊娠的診斷標準為借助陰道超聲檢查在囊胚移植后的28天可觀察到宮內孕囊和原始胎心搏動;若在宮外可探及孕囊則診斷為異位妊娠,并記錄孕囊的數目。對臨床妊娠者隨訪至妊娠結束。

胚胎著床率=著床胚胎數/移植胚胎總數×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植總周期數×100%;異位妊娠率=異位妊娠周期數/移植總周期數×100%;自然流產率=自然流產周期數/移植總周期數×100%;雙胎妊娠率=雙胎妊娠周期數/移植周期數×100%;多胎妊娠率活產率=多胎妊娠周期數/移植周期數×100%,活產率=活產周期數/移植周期數×100%。妊娠滿28周,胎兒娩出后有心跳、呼吸、臍帶搏動、隨意肌收縮4項生命指標之一者稱為活產;妊娠滿28周但不足37周即分娩者稱為早產。

1.4 統計學方法應用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用t檢驗或方差分析;計數資料以例數(%)表示,比較采用卡方檢驗;不同參數對臨床妊娠率及活產率的影響采用多因素Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組患者基線資料及控制性促排卵周期比較本研究總共納入2576個FET,四組患者年齡分別是(30.0±4.4)歲、(29.9±4.3)歲、(30.2±4.4)歲、(31.0±4.4)歲;體質量指數(BMI)分別是(21.2±2.0)kg/m2、(20.5±2.2)kg/m2、(22.7±5.1)kg/m2、(21.8±3.3)kg/m2。不同組別患者年齡、不孕年限、BMI、AMH、基礎性激素水平、子宮內膜情況以及促性腺激素總量和天數進行比較,差異無統計學意義(P> 0.05)。見表1。

表1 各組患者的基線資料

2.2 不同囊胚級別各組患者妊娠結局比較對各組囊胚移植后的妊娠結局進行比較發現,A組囊胚移植后的臨床妊娠率最高,高于B、C、D組(P< 0.05),B組臨床妊娠率高于C組和D組(P< 0.05),A組與B組間臨床妊娠率比較差異無統計學意義(P>0.05)。各組患者的著床率比較差異有統計學意義(P< 0.05);各組異位妊娠率、早孕流產率和中孕流產率、多胎妊娠率比較差異無統計學意義(P>0.05)。A組與B組、A組與C組、C組與D組間的雙胎妊娠率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組妊娠結局比較

2.3 凍融囊胚移植周期臨床妊娠率和活產率多因素Logistic回歸分析多因素Logistic回歸分析結果顯示,囊胚ICM和TE評分是臨床妊娠率和活產率的獨立影響因素(P<0.05)。見表3、表4。

表3 臨床妊娠率的多因素Logistic回歸分析

表4 活產率的多因素Logistic回歸分析

3 討論

隨著胚胎實驗室體外囊胚培養技術的日趨成熟,通過形態學評級篩選具有較高發育潛能的囊胚成為胚胎移植中非常關鍵的步驟。本研究納入2576個凍融囊胚移植周期進行分析,結果顯示凍融囊胚的ICM和TE評級對囊胚發育潛能、著床率、臨床妊娠率和活產率方面具有一定預測價值。Gardner評分是人類輔助生殖技術實驗室操作專家共識,也是目前國際上主要使用的囊胚評級方法[16]。陳夢茜等研究顯示囊胚的內細胞團質量和整倍體胚胎著床率成正相關趨勢,A級ICM胚胎移植著床率高于B級[10]。因此,本研究采用ICM和TE兩個指標進行分組,結果提示囊胚ICM和TE評分與臨床妊娠率和活產率存在密切關聯且結果具有統計學意義,隨著囊胚ICM和TE評分的增高,臨床妊娠率和活產率亦增高。各組的著床率比較有統計學意義,隨著ICM和TE評分增加,著床率下降。然而,流產率相關指標的比較在各組中均無統計學意義。由此提示,在囊胚移植中囊胚的ICM及TE評分可作為妊娠結局和囊胚發育潛能的重要預測指標之一,但在囊胚分級相差不大的組間比較中,囊胚的ICM及TE評分作為預估發育潛能的指標并未顯示出其優勢。說明囊胚的內細胞團和滋養細胞層評分對于凍融囊胚移植后妊娠結局的預測具有一定的參考價值。

本研究還評估了不同內細胞團和滋養細胞層評分的囊胚移植后新生兒出生結局的情況,結果顯示新生兒出生性別比較A、B、C 三組無統計學差異,但A組男嬰出生率高于D組。新生兒出生體重A、B、C組間比較無統計學差異,但A組新生兒出生體重低于D組。由此提示,在凍融雙囊胚移植中,對于ICM和TE評級均為A的囊胚與ICM和TE評級為 BC/CB/CC的囊胚間的比較,內細胞團和滋養細胞層評分對于評估新生兒的性別和體重具有一定的價值,且結果顯示ICM和TE評級越高,新生兒為男孩和體重低的概率可能越,可能考慮優質囊胚移植著床率高,繼續妊娠率高,雙胎妊娠早產率略高于足月妊娠,因此低體重兒增加趨勢。然而,對于ICM和TE評級相差不大的組別間新生兒性別和體重的評估,內細胞團和滋養細胞層評分在本研究中并未得到有統計學意義的結果,未來需要進一步探究。

關于囊胚擴張程度是否會影響凍融囊胚移植后的妊娠結局和新生兒出生結局仍存在爭議。但本研究Logistic回歸分析結果顯示,囊胚擴張程度不能作為臨床妊娠率和活產率的獨立影響因素(P>0.05)。據此我們認為在對優質囊胚的研究中囊胚的擴張程度不會對囊胚移植后的妊娠結局產生重大影響。

綜上,在FET中囊胚的ICM及TE評分尤為重要,是臨床妊娠率和活產率的獨立影響因素,對于新生兒性別和體重的評估亦有一定價值,因而可作為凍融囊胚移植后妊娠結局和新生兒出生結局預測的一個參數,為制定臨床囊胚移植策略提供參考。