雙歧桿菌基于菊粉促進普拉梭菌增殖的探究

高文玉,肖越,王鴻超,朱金林,陸文偉,2*

1(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)2(江南大學,國家功能食品技術研究中心,江蘇 無錫,214122)

人體腸道內定植復雜的微生物群落,它們共同構成一個穩定的腸道微生態,這些細菌或通過與宿主協同作用或者自身發揮作用,對維護人體健康具有重要意義[1-2]。腸道微生物可以影響代謝、免疫和神經調節,菌群結構的紊亂會導致不同疾病的發生和發展。菌群主要通過自身的代謝產物發揮潛在益生作用,其中,短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFA)是最豐富的代謝物,增加短鏈脂肪酸的含量有助于降低腸道pH,抑制有害菌的生長,同時對維護腸道穩態,保護腸屏障,緩解炎癥和肥胖等具有重要的作用。其中,丁酸鹽是結腸細胞的主要能量來源,還具有一定的抗炎作用[3]。

普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii,F.prausnitzii)是健康人群腸道內豐度較高的物種之一,因其具有潛在益生作用而受到越來越多的關注,許多疾病的發生都與普拉梭菌豐度降低相關。研究表明,在老年人、肥胖人群、Ⅱ型糖尿病患者、特應性皮炎和炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)患者腸道內,該物種豐度都顯著低于健康人群[4-6]。其次,普拉梭菌也逐漸發展為區別克羅恩病(Crohn′s disease, CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)的生物標志物。研究發現,普拉梭菌通過促進抗炎因子的分泌發揮抗炎作用,多項動物實驗表明普拉梭菌能夠緩解葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)誘導的結腸炎[7]。除代謝性疾病之外,許多研究認為普拉梭菌也是調控腸腦軸功能的關鍵物種,研究表明患有輕度認知障礙受試者的腸道中普拉梭菌豐度比健康人群低,而補充普拉梭菌菌株能夠改善阿爾茲海默癥小鼠的認知障礙[8]。盡管許多證據證明普拉梭菌對人體具有重要益生作用,但是由于普拉梭菌不可食用和對氧氣敏感等特點限制它的發展和應用,因此基于膳食因子和菌群互作是目前最簡便有效調節普拉梭菌豐度的方式。

膳食因子是影響腸道菌群結構的最主要因素,通過攝入益生元等物質可以在一定程度上調節菌群結構,促進有益菌生長,抑制有害菌繁殖[9]。研究發現菊粉是重要的雙歧因子,可以增加腸道中雙歧桿菌豐度[10]。雙歧桿菌作為益生菌可以產生大量的乙酸,而乙酸是腸道微生物合成丁酸的重要前體物質[11]。腸道微生物通過復雜的相互作用處于動態平衡,物種之間形成復雜的互作網絡,既可以競爭消耗營養物質,也可以協同促進[12-13]?；诖?揭示微生物之間的相互作用也是促進普拉梭菌增殖的重要手段[14]。

本研究建立雙歧桿菌與普拉梭菌在菊粉中的共培養模式,通過測定普拉梭菌的菌落數、丁酸鹽產量和菊粉利用程度來評估雙歧桿菌對普拉梭菌生長的促進作用,進一步通過動物實驗探究以菊粉為益生元,雙歧桿菌在體內促進普拉梭菌增殖的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料、動物、試劑

菊粉(純度>90%)、酪蛋白胨,上海創賽科技有限公司;葡萄糖、氯化鈉、無水硫酸鈉、乙醚等其他所有試劑,國藥集團化學試劑有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)、溶菌酶,天根生化科技(北京)有限公司;糞便DNA提取試劑盒(Fast DNA SPIN Kit for Feces),美國MP biomedicals公司;膠回收試劑盒,德國Qiagen公司;普拉梭菌特異性引物,生工生物工程(上海)股份有限公司;20只6周齡無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級C57BL/6 J小鼠,北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

DG250厭氧工作箱,英國Don Whitley公司;Infinite BZ0酶標儀,瑞士Tecan公司;GR60DA壓力蒸汽滅菌鍋,廈門致微儀器有限公司;GC-MS,日本島津公司;ICS-3000離子色譜儀和脈沖安培檢測器,美國Dionex公司;離心機,德國Eppendorf公司;高通量組織破碎儀,寧波新芝生物科技股份有限公司;PCR儀,美國Bio-Rad公司;2000C超微量分光光度計,美國Nano Drop公司;振蕩器,德國IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的活化與鑒定

普拉梭菌CCFM1203和P45均分離自成人的糞便;普拉梭菌A2-165,購自DSMZ德國微生物和細胞培養物保藏中心;3株長雙歧桿菌、3株假小鏈雙歧桿菌、2株兩歧雙歧桿菌、3株動物雙歧桿菌和3株短雙歧桿菌菌,分離自成人糞便。

分別將普拉梭菌種子液和雙歧桿菌種子液接種至YCFA液體培養基和MRS液體培養基(添加0.05%L-半胱氨酸鹽酸鹽)中,連續活化3代,放置于厭氧工作站中,在37 ℃的條件下培養24～48 h。

菌種鑒定:取菌泥DNA的PCR產物測序,最后在美國NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST比對,確認菌種。

1.3.2 生長曲線測定

單培養:將普拉梭菌和雙歧桿菌分別以2%(體積分數)接種于5 mL菊粉YCFA液體培養基中,在厭氧箱中37 ℃培養48 h,每組設置3個平行。共培養:將普拉梭菌和雙歧桿菌以1∶1混合,以2%(體積分數)接種于5 mL菊粉YCFA液體培養基中,在厭氧箱中37 ℃培養48 h,每組設置3個平行。將單培養和共培養體系菌液加至96微孔板中,采用多功能酶標儀Tecan Infinite BZ0測定OD600,每隔30 min自動檢測一次且連續測定48 h,以此評估菌株單培養和共培養時利用菊粉的能力。

1.3.3 菌落數測定

通過熒光定量PCR實驗分別測定單培養和共培養下普拉梭菌的菌落數。取1 mL培養48 h的菌懸液提取純菌DNA,方法參照天根細菌基因組DNA提取試劑盒說明書,將所得DNA作為qPCR反應的模板。普拉梭菌特異性引物:F:5′- GGAGGAAGAAGGTCTTCG G-3′;R:5′-AATTCCGCCTACCTCTGCACT-3′。

1.3.4 短鏈脂肪酸含量測定

取體外發酵所得上清液500 μL于2 mL無菌離心管中,加入40 μL 10%硫酸酸化,振蕩30 s混勻。轉移至通風櫥中,加入1 mL無水乙醚,振蕩30 s混勻,以12 000 r/min的轉速在4 ℃下離心15 min,將上清液轉移至裝有0.25 g無水硫酸鈉的離心管中靜置15 min以充分除取水分,以同樣條件離心,將上清液過膜轉移至氣相小瓶。采用Rtx-Wax柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm)和質譜檢測器(GC-MS-QP2010Vitta,system)對樣品中各短鏈脂肪酸分離,設置N2為載氣,流速為1 mL/min,進樣體積為1 μL、分流比為10∶1,初始柱溫為100 ℃,以7.5 ℃/min升溫速率升溫至140 ℃,再以60 ℃/min升溫至200 ℃。在200 ℃保持3 min,進樣溫度為240 ℃,電離溫度為220 ℃。

1.3.5 發酵上清液菊粉降解程度測定

樣品前處理:取1 mL發酵48 h后的培養上清液,加入等體積乙腈置于冰上30 min沉淀蛋白,在4 ℃下以12 000 r/min的轉速離心15 min,取上清液,置于真空濃縮儀中3 h,用500 μL超純水復溶,用0.22 μm微孔膜過濾,裝入進樣小瓶等待檢測。流動相為洗脫液A:超純水;洗脫液B:1 mol/L NaAc;洗脫液C:250 mmol/L NaOH;流速0.5 mL/min。洗脫梯度:0 min,4% B和38% C;40 min,40% B和38% C;41 min,4% B和30% C;50 min,4% A和38% B。使用離子色譜儀(ICS-5000)和高性能陰離子交換色譜(high performance anion exchange chromatography, HPAEC)和脈沖安培檢測器(pulsed amperometric detection, PAD)進行,采用CarboPac PA200色譜柱(Dionex)。

1.3.6 動物實驗設計

本研究使用20只SPF C57BL/6 J雄性小鼠,飼養于江南大學實驗動物中心SPF屏障環境中,溫度控制在20～26 ℃,相對濕度為40%～70%,照明制度為標準的12 h光照和12 h黑暗循環,每天更換飲水和飼料,飼料為普通飼料,小鼠自由進食進水。所有操作均按照《江南大學實驗動物管理辦法》執行,所有動物倫理均通過江南大學實驗動物福利倫理委員批準。

雙歧桿菌干預對小鼠腸道中普拉梭菌豐度及生理功能的影響(倫理批準號:JN.No20220930c080 1115【396】)。將20只6周齡小鼠隨機分為4組,每組8只,適應期一周結束后開始實驗,實驗共計5周,小鼠飼料為普通飼料,自由飲水,具體實驗方案設計見表1。

表1 動物實驗方案設計Table 1 The design of animal experiment

1.3.7 糞便DNA提取與16S rRNA測序

取干預至第4周最后一天的小鼠糞便,按照FastDNA Spin Kit for Feces試劑盒提取獲得小鼠糞便DNA,然后以其為模板對細菌的V3～V4片段進行PCR。正向引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′),反向引物806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。用12%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴增產物,按照膠回收試劑盒說明書進行。在Illumina Miseq PE300平臺上進行上機檢測,下機數據采用QIIME II軟件分析。

1.3.8 數據統計與分析

本文實驗數據均以“平均值±標準差”(Mean±SD)表示,兩組間差異用非配對t檢驗方法進行統計學分析,未特別說明的均表示與空白組(最左側柱子)進行顯著性差異標注,P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.000 1,利用Graph pad Prism 9.0軟件進行繪圖。利用生科云(https://www.bioincloud.tech)進行菌群分析。

2 結果與分析

2.1 不同種雙歧桿菌促進普拉梭菌在菊粉中菌落數增加

腸道菌群之間存在緊密的互作網絡,微生物之間通過互養關系實現協同增殖[15-16],研究發現菊粉可以促進雙歧桿菌生長[17]并且與產丁酸菌之間形成互養關系[18]?；谇叭搜芯拷Y果,初步探究雙歧桿菌是否與普拉梭菌之間存在互養關系。本研究分別將普拉梭菌CCFM1203、長雙歧桿菌CCFM1306和青春雙歧桿菌FXJCHJ15M4單培養或共同培養于0.5%菊粉YCFA培養基中,生長情況如圖1所示,結果發現普拉梭菌CCFM1203在含有菊粉的培養基中幾乎難以生長,而長雙歧桿菌CCFM1306和青春雙歧桿菌FXJCHJ15M4單獨培養的生長情況優于普拉梭菌CCFM1203,其OD600約為0.5。但是當普拉梭菌CCFM1203分別和2株雙歧桿菌共同培養于含有菊粉的培養基中時,菌液的OD600可以達到1.0以上,生長情況遠強于任何一株菌單獨培養,由此推斷普拉梭菌和雙歧桿菌之間存在相互促進作用。

為進一步探究兩菌之間是否存在相互促進作用,以及普拉梭菌和其他種雙歧桿菌共培養是否也存在類似現象,本研究選擇腸道中常見的長雙歧桿菌、假小鏈雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和短雙歧桿菌共14株,分別與普拉梭菌在含菊粉的培養基中共同培養,測定普拉梭菌在單獨培養和共同培養下的菌落數變化,結果如圖2所示?？傮w來看,3株不同的普拉梭菌分別與14株雙歧桿菌共培養后菌落數均顯著增加,普拉梭菌菌落數約提高1.5個數量級左右。其中,長雙歧桿菌和假小鏈雙歧桿菌刺激普拉梭菌生長的能力最強且不具有菌株特異性,只有兩歧雙歧桿菌較其他4種雙歧桿菌刺激能力弱。

圖1 普拉梭菌CCFM1203分別與長雙歧桿菌CCFM1306、 青春雙歧桿菌FXJCHJ15M4在菊粉中單培養和 共培養的生長曲線Fig.1 The growth curves of F.prausnitzii CCFM1203, Bifidobacterium longum CCFM1306 and Bifidobacterium adolescens FXJCHJ15M4 in mono- and coculture in inulin

a-普拉梭菌CCFM1203分別與不同雙歧桿菌單培養和共培養的菌落數;b-普拉梭菌P45分別與不同雙歧桿菌單培養和共培養的菌落數; c-普拉梭菌A2-165分別與不同雙歧桿菌單培養和共培養的菌落數圖2 普拉梭菌與不同雙歧桿菌在菊粉中單培養和共培養的菌落數Fig.2 The cell number of F.prausnitzii in mono- and co-culture with Bifidobacterium in inulin注:所有組別均與圖片第一列(單菌培養組別)有顯著性差異,***表示P<0.001;****表示P<0.000 1(下同)。

2.2 不同種雙歧桿菌促進普拉梭菌在菊粉中代謝短鏈脂肪酸含量增加

短鏈脂肪酸是腸道菌群維護宿主健康的一個重要途徑[19],雙歧桿菌能夠為腸道中產丁酸菌提供乙酸而形成互養[20],普拉梭菌通過分泌丁酸發揮抗炎作用,同時為結腸細胞提供能量[21],因此丁酸濃度也是衡量普拉梭菌生長的一個重要指標[22]。本研究測定普拉梭菌在含菊粉培養基單培養和與雙歧桿菌共培養后的短鏈脂肪酸濃度,結果如圖3所示,雙歧桿菌與普拉梭菌共培養后發酵上清液中乙酸濃度顯著下降,特別是普拉梭菌CCFM1203和P45,同時,發酵上清液中丁酸鹽濃度顯著增加,其中與假小鏈雙歧桿菌或長雙歧桿菌共培養后可產生更多的丁酸,最多可增加10.5倍,而兩歧雙歧桿菌促進丁酸鹽產量的能力較差,共培養后丁酸鹽含量僅為單培養的2倍,動物雙歧桿菌和短雙歧桿菌則促進普拉梭菌產丁酸鹽的能力具有菌株特異性,只有其中1株可以顯著增加丁酸鹽濃度。不同株雙歧桿菌刺激普拉梭菌產丁酸鹽的能力基本與其提高普拉梭菌生長的能力對應,由此進一步說明雙歧桿菌可以刺激普拉梭菌生長。

由于普拉梭菌代謝物主要為丁酸,而乙酸是丁酸合成的重要前體物質,因此腸道中其他代謝乙酸的微生物都有促進普拉梭菌產丁酸的潛力,例如多形擬桿菌和Akkermansia菌都可以分泌乙酸被普拉梭菌利用[23-24]。除乙酸外,普拉梭菌對大多數維生素和氨基酸都是營養缺陷型,羅伊氏乳桿菌可以為普拉梭菌生長提供豐富的硫胺素[25],枯草芽孢桿菌通過分泌核黃素而促進普拉梭菌生長[26],核黃素不僅能夠作為生長因子促進普拉梭菌,還能降低氧化還原電勢促進普拉梭菌在腸道中的定植[27]。

2.3 長雙歧桿菌協同普拉梭菌增殖促進發酵上清液中菊粉的降解

發酵上清液中菊粉的聚合度分布可以說明普拉梭菌和雙歧桿菌單培養或共培養利用菊粉的程度,結果如圖4所示,普拉梭菌CCFM1203培養36 h后幾乎不消耗菊粉,長雙歧桿菌CCFM1306可以消耗部分菊粉,但是將普拉梭菌CCFM1203和長雙歧桿菌CCFM1306共培養36 h后,發酵上清液中大部分聚合度的菊粉均被降解,兩菌共培養后的消耗程度遠大于單菌單培養,通過分解大片段的菊粉也產生更多的單糖和二糖等小片段,表明雙歧桿菌和普拉梭菌共培養后促進菊粉更徹底被消耗利用。除菊粉之外,許多多糖由于分子質量大而限制了普拉梭菌的利用,基于前期研究,普拉梭菌難以在含有褐藻酸鈉的培養基中生長,但是多形擬桿菌能將褐藻酸鈉降解成褐藻低聚糖后被普拉梭菌利用[28],由此可篩選其他多糖發掘普拉梭菌與腸道微生物更多互養的可能性。

2.4 雙歧桿菌干預對小鼠糞便菌群結構及普拉梭菌豐度的影響

體外實驗表明長雙歧桿菌能顯著增加普拉梭菌在含菊粉培養基中的菌落數,刺激普拉梭菌產更多丁酸進而發揮其益生作用,但腸道內菌群多樣性高,物種之間的營養競爭作用或協同作用更加復雜,無法得知在腸道內環境中通過雙歧桿菌的協同作用是否可以增加普拉梭菌在腸道中的豐度,因此本研究通過將小鼠分為4個組別,分別是“空白組”,“普拉梭菌組”,“菊粉組”和“長雙歧桿菌+菊粉”組探究在體內菊粉和/或雙歧桿菌對普拉梭菌豐度的影響?；谇叭搜芯堪l現,小鼠腸道中幾乎不含有普拉梭菌,因此首先給除空白組外所有小鼠灌胃普拉梭菌,使該物種在腸道中定植,隨后灌胃菊粉和長雙歧桿菌進行干預。圖5表示干預1個月后不同組別種每只小鼠糞便菌群結構門水平和屬水平物種組成。

a-雙歧桿菌單培養及與普拉梭菌共培養后發酵上清液中乙酸濃度;b-普拉梭菌CCFM1203單培養及與不同種雙歧桿菌共培養后發酵 上清液中丁酸濃度;c-普拉梭菌P45單培養及與不同種雙歧桿菌共培養后發酵上清液中丁酸濃度; d-普拉梭菌A2-165單培養及與不同種雙歧桿菌共培養后發酵上清液中丁酸濃度圖3 普拉梭菌與雙歧桿菌單培養及共培養后的SCFA濃度Fig.3 The content of SCFAs of F.prausnitzii and Bifidobacterium in mono- and co-culture注:圖a分為5個組別,各個組別均表示與本組最左側(雙歧桿菌單培養)進行顯著性差異標注。未標注表示不具有顯著性差異; *表示P<0.05;**表示P<0.01(下同)。

a-普拉梭菌CCFM1203在菊粉中單培養發酵上清液中菊粉聚合度;b-長雙歧桿菌CCFM1306在菊粉中單培養發酵上清液中菊粉聚合度; c-拉梭菌CCFM1203和長雙歧桿菌CCFM1306在菊粉中共培養發酵上清液中菊粉聚合度圖4 發酵上清液中菊粉分子聚合度Fig.4 The polymerization degree of inulin in supernatant

圖6表明不同干預組別普拉梭菌的豐度均比空白組高,其中只有普拉梭菌組(只灌胃普拉梭菌使其定植,而不進行其他干預)中該物種的豐度顯著增加,反而在干預菊粉和長雙歧桿菌之后,普拉梭菌的豐度相比于空白組僅有增加的趨勢但不具有顯著性差異,推斷可能是由于給小鼠干預長雙歧桿菌和菊粉后,長雙歧桿菌能夠優先占據優勢地位,普拉梭菌缺乏競爭力而難以增殖,這與前人發現的鏈狀雙歧桿菌可以增加小鼠腸道中普拉梭菌豐度的結果有所不同[29]。推測由于本實驗給小鼠干預長雙歧桿菌和普拉梭菌的周期較短,不利于這該株長雙歧桿菌在腸道中定植,并且雙歧桿菌在小鼠腸道中的定植能力可能有種特異性。

通過LSFse分析,圖7表明菊粉的干預會改變腸道菌群結構,顯著促進雙歧桿菌、乳桿菌和Akkermansia菌在體內增殖并且成為腸道中的優勢物種,長雙歧桿菌分解菊粉產生的小分子片段可能被其他優勢物種優先利用而抑制了與普拉梭菌的協同作用,這與許多研究結果相一致[30]。此外,菊粉干預的劑量可能會影響兩種菌的相互作用,可通過設置不同劑量的菊粉濃度進一步探究。

圖6 不同組別中普拉梭菌的豐度Fig.6 The abundance of F.prausnitzii in different groups

2.5 雙歧桿菌干預對小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量的影響

腸道菌群的改變伴隨其代謝產物的改變。短鏈脂肪酸通常由腸道中有益菌降解膳食纖維產生,具有抗炎、抑制有害微生物生長、為結腸上皮細胞提供能量等重要益生作用。如圖8所示,通過測定小鼠糞便中的短鏈脂肪酸發現不同組別小鼠糞便中乙酸含量有增加的趨勢,其中在對小鼠同時進行長雙歧桿菌和菊粉干預后糞便中乙酸含量最高,同時該組別小鼠糞便菌群中雙歧桿菌和Akkermansia菌顯著增加,而這2種菌屬都能夠產豐富的乙酸,因此推測這兩種菌屬是提高糞便中乙酸含量提高的重要貢獻者。然而,糞便中短鏈脂肪酸含量是多種微生物共同代謝的結果,丙酸和丁酸濃度較低,丁酸鹽含量在不同組別之間不具有顯著性差異?！伴L雙歧桿菌+菊粉組”的丙酸濃度顯著降低,推測是被吸收利用。

圖7 普拉梭菌組與菊粉組的糞便菌群差異物種分析Fig.7 The analysis of differential species between F.prausnitzii group and inulin group

a-乙酸;b-丙酸;c-丁酸圖8 小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量Fig.8 The content of SCFAs in feces

3 結論

本研究探究雙歧桿菌和普拉梭菌基于菊粉的協同增殖模式,通過體外實驗表明在含菊粉培養基中培養時,雙歧桿菌可以增加普拉梭菌的菌落數,刺激普拉梭菌產生更多丁酸鹽,同時使得菊粉被更充分地消耗利用。給小鼠干預菊粉和長雙歧桿菌后,其腸道中普拉梭菌豐度具有增加的趨勢,且小鼠糞便中乙酸的含量顯著提高。